特殊显微镜的使用

1、细胞生物学实验细胞生物学实验生命科学学院生命科学学院生物技术与工程实验中心生物技术与工程实验中心I I 暗视野显微镜暗视野显微镜一、实验目的一、实验目的 了解暗视野显微镜观察活细胞的基本原理；了解暗视野显微镜观察活细胞的基本原理； 了解暗视野显微镜的特殊组件和位置；了解暗视野显微镜的特殊组件和位置； 掌握调节暗视野显微镜的基本步骤。掌握调节暗视野显微镜的基本步骤。实验一实验一 特殊显微镜的原理及其使用特殊显微镜的原理及其使用二、原理和结构特点二、原理和结构特点1.1.原理原理l根据丁达尔效应原理设计的一种在黑色背景条件下观根据丁达尔效应原理设计的一种在黑色背景条件下观察被检物体的显微镜。察被检

2、物体的显微镜。l不让直射光线进入物镜的镜头，而是先让直射光线经不让直射光线进入物镜的镜头，而是先让直射光线经过暗视野聚光器后改变途径，使其斜向射向被检物体。过暗视野聚光器后改变途径，使其斜向射向被检物体。l能观察到明视野下看不到的极其微小的物体，可判断能观察到明视野下看不到的极其微小的物体，可判断物质颗粒的存在与否。物质颗粒的存在与否。最高分辨率可达最高分辨率可达0.004微米微米l主要用于微小粒子、细菌形态、细菌记数，透明标本主要用于微小粒子、细菌形态、细菌记数，透明标本观察等。观察等。2 .结构特点结构特点 使用中央遮光板或暗使用中央遮光板或暗视野聚光器（常用的是抛视野聚光器（常用的是抛物

3、面聚光器），使光源的物面聚光器），使光源的中央光束被阻挡。不能由中央光束被阻挡。不能由下而上地通过标本进入物下而上地通过标本进入物镜。从而使光线改变途径，镜。从而使光线改变途径，倾斜地照射在观察的标本倾斜地照射在观察的标本上，标本遇光发生反射或上，标本遇光发生反射或散射，散射的光线投入物散射，散射的光线投入物镜内，因而整个视野是黑镜内，因而整个视野是黑暗的。暗的。三、实验步骤三、实验步骤1.1.样品制备：在一张无划痕、清洁的载玻片上滴一样品制备：在一张无划痕、清洁的载玻片上滴一滴生理盐水，用牙签取牙垢或用镊子撕洋葱内表滴生理盐水，用牙签取牙垢或用镊子撕洋葱内表皮细胞与载玻片上的生理盐水混合均匀

4、，盖上盖皮细胞与载玻片上的生理盐水混合均匀，盖上盖玻片，用滤纸条吸取盖片四周多余的水分，镜检。玻片，用滤纸条吸取盖片四周多余的水分，镜检。2.2.将暗视野聚光器安装在显微镜上，调强照明光。将暗视野聚光器安装在显微镜上，调强照明光。3.在聚光器透镜的上表面滴上镜头油。向上缓慢调升在聚光器透镜的上表面滴上镜头油。向上缓慢调升聚光镜，使镜头油与载玻片下表面缓缓接触。只聚光镜，使镜头油与载玻片下表面缓缓接触。只有在油滴与载玻片的底面相接触后，光线才能射有在油滴与载玻片的底面相接触后，光线才能射向标本。向标本。4.4.将标本置于载物台上，插入将标本置于载物台上，插入10 x10 x物镜，用调焦螺旋物镜，

5、用调焦螺旋聚焦样品。聚焦样品。作作 业业1.绘制暗视野内洋葱内表皮细胞图（绘制暗视野内洋葱内表皮细胞图（35个个细胞）细胞）2.明视野和暗视野像的主要区别是什么？暗明视野和暗视野像的主要区别是什么？暗视野显微镜的特殊组件是什么？视野显微镜的特殊组件是什么？II.相差显微镜的原理和使用相差显微镜的原理和使用 一、实验目的一、实验目的 了解相差显微镜观察活细胞的基本原理；了解相差显微镜观察活细胞的基本原理； 了解相差显微镜的特殊组件和位置；了解相差显微镜的特殊组件和位置； 掌握调节相差显微镜的基本步骤。掌握调节相差显微镜的基本步骤。二、原理和结构特点二、原理和结构特点1 1 原理原理 光波有振幅（

6、亮度）、波长（颜色）及相位光波有振幅（亮度）、波长（颜色）及相位( (指在某一时间指在某一时间上光的波动所能达到的位置上光的波动所能达到的位置) )的不同。的不同。 当光通过物体时，如波长和振幅发生变化，人们的眼睛才当光通过物体时，如波长和振幅发生变化，人们的眼睛才能观察到，这就是普通显微镜下能够观察到染色标本的道能观察到，这就是普通显微镜下能够观察到染色标本的道理。而活细胞和未经染色的生物标本，因细胞各部微细结理。而活细胞和未经染色的生物标本，因细胞各部微细结构的折射率和厚度略有不同，光波通过时，波长和振幅并构的折射率和厚度略有不同，光波通过时，波长和振幅并不发生变化，仅相位有变化不发生变化

7、，仅相位有变化( (相应发生的差异即相位差相应发生的差异即相位差) )，而这种微小的变化，人眼是无法加以鉴别的，故在普通显而这种微小的变化，人眼是无法加以鉴别的，故在普通显微镜下难以观察到。微镜下难以观察到。相差显微镜能够改变直射光或衍射光的相位，并相差显微镜能够改变直射光或衍射光的相位，并且利用光的衍射和干涉现象，把相位差变成振幅且利用光的衍射和干涉现象，把相位差变成振幅差（明暗差），同时它还吸收部分直射光线，以差（明暗差），同时它还吸收部分直射光线，以增大其明暗的反差。因此可用以观察活细胞或未增大其明暗的反差。因此可用以观察活细胞或未染色标本。染色标本。2.2.结构特点结构特点 相差显微镜

8、与普通显微相差显微镜与普通显微镜的主要不同之处是：镜的主要不同之处是：用环状光阑代替可变光用环状光阑代替可变光阑，用带相位板的物镜阑，用带相位板的物镜( (通常标有通常标有PHPH的标记的标记) )代代替普通物镜，替普通物镜，并带有一并带有一个合轴调节用的望远镜。个合轴调节用的望远镜。 2.1环状光阑环状光阑 具有环形开孔的光阑。位于聚光器的前焦点平面上，具有环形开孔的光阑。位于聚光器的前焦点平面上，光阑的直径大小是与物镜的放大倍数相匹配的，并光阑的直径大小是与物镜的放大倍数相匹配的，并有一个明视场光阑，与聚焦器一起组成转盘聚光器。有一个明视场光阑，与聚焦器一起组成转盘聚光器。在使用时只要把相

9、应的光阑转到光路即可。在使用时只要把相应的光阑转到光路即可。 2.2相板相板 位于物镜内部的后焦平面上。相板上有两个区域，位于物镜内部的后焦平面上。相板上有两个区域，直射光通过的部分叫直射光通过的部分叫“共轭面共轭面”，衍射光通过的部，衍射光通过的部分叫分叫“补偿面补偿面”。带有相板的物镜叫相差物镜，常。带有相板的物镜叫相差物镜，常以以“Ph”字样标在物镜外壳上。字样标在物镜外壳上。相差物镜剖面图相差物镜剖面图转盘聚光器构造图转盘聚光器构造图 二、实验步骤二、实验步骤 1.样品制备：在一张清洁无痕的载玻片上滴一滴生样品制备：在一张清洁无痕的载玻片上滴一滴生理盐水，用牙签刮自己的口腔粘膜少许或用

10、镊子撕理盐水，用牙签刮自己的口腔粘膜少许或用镊子撕洋葱内表皮细胞与载玻片上的生理盐水混合均匀，洋葱内表皮细胞与载玻片上的生理盐水混合均匀，盖上清洁的盖玻片，用滤纸条吸取盖片周围多余的盖上清洁的盖玻片，用滤纸条吸取盖片周围多余的水分，用指甲油封片（或不封片）。水分，用指甲油封片（或不封片）。 2.将将10 x相差物镜旋入光路。相差物镜旋入光路。 3.将相应于将相应于10 x相差物镜的相差聚光器的环状光阑移相差物镜的相差聚光器的环状光阑移入光路中，完全打开聚光器的孔径光阑。入光路中，完全打开聚光器的孔径光阑。 4.将样品置于载物台上，用聚焦螺旋聚焦样品。将样品置于载物台上，用聚焦螺旋聚焦样品。 5

11、.用柯勒照明法调节聚光器：用柯勒照明法调节聚光器：将视场光阑关到将视场光阑关到最小；最小；用聚光器升降调节螺旋，调节聚光器的用聚光器升降调节螺旋，调节聚光器的上下位置，直至在目镜中观察到视场光阑像的边上下位置，直至在目镜中观察到视场光阑像的边缘清楚；缘清楚；调节聚光器的调中螺旋，使视场光阑调节聚光器的调中螺旋，使视场光阑的像移至视场中央（调中聚光器）；的像移至视场中央（调中聚光器）；打开视场打开视场光阑，使其边缘与目镜中的视场同样大小。柯勒光阑，使其边缘与目镜中的视场同样大小。柯勒照明是调好相差像的关键之一。照明是调好相差像的关键之一。 6.观察物镜后焦面，调节仪器使聚光器中环状光阑的观察物镜

12、后焦面，调节仪器使聚光器中环状光阑的像和相差物镜中相板的圆环互相吻合，这一步是调好像和相差物镜中相板的圆环互相吻合，这一步是调好相差最重要的步骤。具体方法是：取下一个目镜，插相差最重要的步骤。具体方法是：取下一个目镜，插入一个聚焦望远镜或肉眼直接观察，如果环状光阑的入一个聚焦望远镜或肉眼直接观察，如果环状光阑的明亮光圈与圆形相板不吻合，可以通过调节聚光器上明亮光圈与圆形相板不吻合，可以通过调节聚光器上的调中螺旋使之吻合。调节吻合后，插入目镜，就可的调中螺旋使之吻合。调节吻合后，插入目镜，就可在目镜中观察到一个清晰的口腔上皮细胞的相差像。在目镜中观察到一个清晰的口腔上皮细胞的相差像。 7.如果换用高倍相差物镜观察，需要移入相应的高倍如果换用高倍相差物镜观察，需要移入相应的高倍相差物镜的聚光器环状光阑进行观察。相差物镜的聚光器环状光阑进行观察。(A) bright-field microscopy.(B) phase-contrast microscopy (C) differential-interference-contrast microscopy. (D) dark-fie