信号通路研究的技术方法

1、信号通路研究的技术方法一、蛋白激酶磷酸化及其活性测定一、蛋白激酶磷酸化及其活性测定二、蛋白磷酸化位点分析及其功能鉴定二、蛋白磷酸化位点分析及其功能鉴定三、三、DNADNA重组技术的应用重组技术的应用四、病毒技术对于揭示细胞信号通路的作用四、病毒技术对于揭示细胞信号通路的作用九、报告基因技术九、报告基因技术十、蛋白质与核酸相互作用技术十、蛋白质与核酸相互作用技术十一、对细胞内信号分子的干预技术十一、对细胞内信号分子的干预技术十二、信号分子基因表达检测技术十二、信号分子基因表达检测技术蛋白激酶磷酸化的检测蛋白激酶磷酸化的检测一、蛋白激酶磷酸化及其活性测定一、蛋白激酶磷酸化及其活性测定经典蛋白激酶活

2、性分析实验流程经典蛋白激酶活性分析实验流程32非放射性蛋白激酶活性分析实验流程非放射性蛋白激酶活性分析实验流程024681012140 5 10 20 30 60 90 120 Time (min)Relative kinase activityDynamic processes of p38 activation by LPS in RAW cellsEffect of individual MAPK pathways on PRAK activity in intact cellsMKK7(D)GST-ATF2GST-ELK1MKK1(E)MKK6(E)ControlHSP27PRAKCo

3、ntrolAniso.ArseniteTNF-80kDa-47kDa-39kDa-80kDa-47kDakDa97.4-68.0-43.9-29.0-18.4-14.3-ControlAniso.ArseniteTNFABThe major kinases of p38 and p38ChromatographyElectrophoresis pH1.9+MAPKAPK2ChromatographyElectrophoresis pH1.9+PRAKChromatographyElectrophoresis pH1.9MIX+二、蛋白磷酸化位点分析及其功能鉴定二、蛋白磷酸化位点分析及其功能鉴定

4、+- +-HSP27p38 GST-PRAK(93A)GST-PRAK(WT)GST-PRAK(186A)GST-PRAK(212A 214A)GST-PRAK(182A)GST-PRAK(WT)GST-PRAK(182D)GST-PRAK(182D 212D)+ -+ -+ -Fold of Activation05101520GST-PRAK(182A)GST-PRAK(182D)GST-PRAK(WT)GST-PRAK(93A)GST-PRAK(186A)GST-PRAK(182D 212D)GST-PRAK(212A 214A)BAElectrophoresis pH 8.9+p38

5、-PRAK(182A)+p38 -PRAK(182D)p38 -PRAK(wt)T182 is the regulatory phosphorylation site of PRAKPCR primerPCR primer三、三、DNA重组技术的应用重组技术的应用v活性诱变体v无活性诱变体v结构与功能的研究JNK2JNK3JNK1p38p38 p38 p38 ERK1ERK2ERK5The relationship between the members of MAPK familyMAPK Dural Phosphorylation Sites L-12 Length * *hp38 DFG

6、LARHTDD-EMTGYVATRWYRAPE25hP38 DFGLARQADE-EMTGYVATRWYRAPE25hp38 DFGLARQADS-EMTGYVVTRWYRAPE25hp38 DFGLARHADA-EMTGYVVTRWYRAPE25hJNK1 DFGLARTAGTS-FMMTPYVVTRYYRAPE27hJNK2 DFGLARTACTN-FMMTPYVVTRYYRAPE27hJNK3 DFGLARTAGTS-FMMTPYVVTRYYRAPE27hERK1 DFGLARIADPEHDH-TGFLTEYVATRWYRAPE31hERK2 DFGLARVADPDHDH-TGFLTEY

7、VATRWYRAPE31hBMK1 DFGMARGLCTSPAEH-QYFMTEYVATRWYRAPE32YHOG1 DFGLARIQDP-QMTGYVSTRWYRAPE 25YSMK1 DFGLARGIHAGFFKCHS-TVQPHITNYVATRWYRAPE36YMPK1 DFGLARGYSENPVEN-SQFLTEYVATRWYRAPE32YKSS1 DFGLARCLASSSDSRET-LVGFMTEYVATRWYRAPE35YFUS3 DFGLARIIDESAADNSEPTGQQSGMTEYVATRWYRAPE38domain VII VIIILoop-12(T-Loop) seque

8、nce of MAP kinasesConstruction of p38 loop-12 to ERK like structure p38 .DFGLARHTDDE-MTGYVATRWYRAPE.p38(E) .DFGLARHTDDE-MTEYVATRWYRAPE.p38(6+) .DFGLARHTDDEHDHTGFMTGYVATRWYRAPE.p38(6+E) .DFGLARHTDDEHDHTGFMTEYVATRWYRAPE.p38(VAP) .DFGLARVADPE-MTGYVATRWYRAPE.p38(DL) .DFGLARHTDDD-LTGYVATRWYRAPE.p38(VAPD6

9、+LE) .DFGLARVADPDHDHTGFLTEYVATRWYRAPE.ERK2 .DFGLARVADPDHDHTGFLTEYVATRWYRAPE.MAPKMKKSubstratesLoop-12 is a key structure to determine the selection of substrate (.TXY.) -四、病毒技术对于揭示细胞信号通路的作用四、病毒技术对于揭示细胞信号通路的作用v腺病毒腺病毒v逆转录病毒逆转录病毒几种几种MAPKMAPK通路抑制剂的化学结构示意图通路抑制剂的化学结构示意图: :ONH2OCH3OPD98059HNNSOFCH3NOHNFNHNS

10、B202190SB203580CH=CHCH=CHOHOCH3OHOCH3OOCurcuminEffects of SB203580 and PD98059 on endogenous PRAK activityHSP27TNF + + + +- - - - - - - - - -Arsenite+ + + +- - - - - - - - - -PMA+ + + +- - - - - - - - - -SB203580_ _- - - -+ +- - -+ +- - - -+ +PD98059- - - - -+ +- - -+ +- - -+ +- -LPSEGFControlp38p38

11、 p38 p38 p38p38 p38 p38 LPS、UV刺激心肌细胞共聚焦显微镜大体扫描LPS Control UV 蛋白质三维结构分析对于揭示信号分子的功能的作用PHTHSH3SH2KinaseBtkSH3SH2KinaseSrc蛋白激酶结构域1.蛋白质结合实验2.免疫共沉淀实验3.FRET 和 BRET荧光能量共振转移(Fluorescence resonance energy transfer)生物发光共振能量转移(bioluminescence resonance energy transfer)4.酵母双杂合系统Identification of MEF2C as a subst

12、rate for p38第 一 步 附着第 二 步激活第三步紧密粘附第 四 步渗出ECEC：趋化因子受体：PECAM：白细胞整合素：选择素：选择素配体：白细胞激活物：Ig家族成员白细胞的渗出过程白细胞的渗出过程 5.噬菌体展示技术九、报告基因技术九、报告基因技术研究细胞信号转导通路通过转录因子对基因启动子转录活性的影响。051015Relative luciferase activityControlLPSEGFLPS+FHPIp38 is involved in the enhancement of TNF- promoter transactivityInduction of c-Jun

13、through MEF2C phosphorylation by p38EMSA十、蛋白质与核酸相互作用技术十、蛋白质与核酸相互作用技术研究细胞内蛋白质尤其是转录因子与特定核酸序列的相互作用。反义核酸技术的应用十一、对细胞内信号分子的干预技术十一、对细胞内信号分子的干预技术研究细胞内蛋白质尤其是转录因子与特定核酸序列的相互作用。RNAiRNAiFigure 1. Effects of mex-3 RNA interference on levels of the endogenous mRNA. Nomarski DIC micrographs show in situ hybridizati

14、on of 4-cell stage embryos. (A) Negative control showing lack of staining in the absence of the hybridization probe. (B) Embryo from uninjected parent showing normal pattern of endogenous mex-3 RNA (purple staining). (C) Embryo from parent injected with purified mex-3 antisense RNA. These embryos (a

15、nd the parent animals) retain mex-3 mRNA, although levels may be somewhat less than wild type. (D) Late 4-cell stage embryo from a parent injected with dsRNA corresponding to mex-3 ; no mex-3 RNA is detected. (Templates used for interfering RNA and in situ probes were largely non-overlapping.) 十二、信号分子基因表达检测技术十二、信号分子基因表达检测技术 研究细胞内mRNA表达水平。HeartBrainPlacentaLungLiverSkeletal Mu