第二章染色体与DNA2

1、DNA的双螺旋结构对于维的双螺旋结构对于维持遗传物质的稳定性和复制持遗传物质的稳定性和复制的准确性是极为重要的。的准确性是极为重要的。(a) Hypothesis 1:Semi-conservative replication(b) Hypothesis 2:Conservative replicationIntermediate molecule(c) Hypothesis 3:Dispersive replicationAlternative Hypotheses for DNA SynthesisMatthew Messelson Franklin Stahl原核生物只有一个原核生物只有

2、一个复复制单位，制单位，其复制是从其复制是从一个起始点一个起始点开始，同开始，同时向两个方向进行，时向两个方向进行，称为称为双向复制双向复制。复制。复制中的中的DNADNA成为成为 状状。大肠杆菌的ori是一个245 bp的富含AT的序列。Displacement loopDNA Synthesis3Completely single stranded5G A AT CT G C Polymerase inactive35Completely double stranded53G A AT CT G C CT TAGACG Polymerase inactive35Single strand

3、as template plus 3 end to start synthesis5OH 3G A AT CT G C C TTPolymerase activePPPCH253OOHBaseStructure of dNTPs: Whats happening at the level of the nucleotide?PPPPPPPPPPCH2CH2CH2OHOHOOOBaseBaseBaseCH2CH2CH2OHOOOBaseBaseBase5 end of strand3 end of strand353H20+Synthesis reactionDNA synthesis reac

4、tion: addition of nucleotides at the 3 endbase addition occurs at the 3 endbase addition occurs at the 3 end, next one here+ + + | + | +切除引物、切除引物、修复修复 修复修复复制复制聚合酶聚合酶 7聚合酶聚合酶 10 DNA聚合酶聚合酶不是复制大肠杆菌染色体的主要聚合酶，不是复制大肠杆菌染色体的主要聚合酶，它有它有35核酸外切酶活性，保证了核酸外切酶活性，保证了DNA复制的准确性。复制的准确性。它也可用来除去冈崎片断它也可用来除去冈崎片断5端端RNA引物，使冈

5、崎片断间引物，使冈崎片断间缺口消失，保证连接酶将片断连接起来。缺口消失，保证连接酶将片断连接起来。DNA聚合酶活性中心刺激核酸外切酶3-5外切酶校正链接两个聚合酶构成钳子具有前进能力将装载到DNA上半块夹子The DNA polymerase A TopoisomeraseIB protein ( g re e n ) i s h i n d e re d i n unwinding DNA loops by the cancer inhibitor topotecan (red). The DNA polymerase protein (grey), a protein which dupl

6、icates DNA, is hindered by the DNA loops. (Credit: TU Delft/Tremani) 抗癌药物：拓扑替康抗癌药物：拓扑替康基因组DNA复制时，先导链的引物是DNA，后随链的引物是RNA () 2002年上海生化与细胞所单链结合蛋白（单链结合蛋白（SSB）Proteins of DNA ReplicationDNA exists in the nucleus as a condensed, compact structure. To prepare DNA for replication,a series of proteins aid in

7、the unwinding and separation of the double-stranded DNA molecule. These proteins are required because DNA must be single-stranded before replication can proceed. 1. DNA Helicases - These proteins bind to the double stranded DNA and stimulate theseparation of the two strands. 2. DNA single-stranded b

8、inding proteins - These proteins bind to the DNA as a tetramer and stabilize the single-stranded structure that is generated by the action of the helicases. Replication is 100 times faster when these proteins are attached to the single- stranded DNA. 3. DNA Topoisomerase - This enzyme catalyzes the

9、formation of negative supercoils that is thought to aid with the unwinding process. In addition to these proteins, several other enzymes are involved in bacterial DNA replication. 小结4. DNA Polymerase - DNA Polymerase I (Pol I) was the first enzyme discovered withpolymerase activity, and it is the be

10、st characterized enzyme. Although this was the first enzyme to be discovered that had the required polymerase activities, it is not the primary enzyme involved with bacterial DNA replication. That enzyme is DNA Polymerase III (Pol III). Three activities are associated with DNA polymerase I; *5 to 3

11、elongation (polymerase activity) *3 to 5 exonuclease (proof-reading activity) *5 to 3 exonuclease (repair activity) The second two activities of DNA Pol I are important for replication, but DNA Polymerase III(Pol III) is the enzyme that performs the 5-3 polymerase function. 5. Primase - The requirem

12、ent for a free 3 hydroxyl group is fulfilled by the RNA primers that are synthesized at the initiation sites by these enzymes. 6. DNA Ligase - Nicks occur in the developing molecule because the RNA primer is removedand synthesis proceeds in a discontinuous manner on the lagging strand. The final rep

13、licationproduct does not have any nicks because DNA ligase forms a covalent phosphodiester linkagebetween 3-hydroxyl and 5-phosphate groups.小结The growing replication fork shows that both strands are synthesized simultaneouslyDNA polymerase IIINewly synthesized leading strand355Replication fork35Form

14、ation of the leading strand35353535Lagging strandsDNA polymerase IIIDNA polymerase III beginning synthesis of new fragment3535Okazaki fragmentsGapFormation of lagging strand前导链：在引物的前导链：在引物的3端按端按53方向连续不断地合成的方向连续不断地合成的DNA链。链。后随链：在引物的后随链：在引物的3端按端按53方向不连续合成的方向不连续合成的DNA链。链。冈崎片段：后随链上不连续合成的冈崎片段：后随链上不连续合成的D

15、NA短片段（不包括引物）。短片段（不包括引物）。Topoisomerase nicks DNA to relieve tension from unwinding2314567Pol III synthesizes leading strandHelicase opens helixPrimase synthesizes RNA primer (whats the story here?)Pol III elongates primer; produces Okazaki fragmentPol I excises RNA primer; fills gapDNA ligase links O

16、kazaki fragments to form continuous strand(error prone start, remove RNA, remove errors)DNA复制的过程复制的过程DNA分子上一段短的区域发生熔解，双链分离形成单链区域；解旋点沿DNA移动标志着复制叉的产生；引发反应和RNA引物合成.所有已知的所有已知的DNA复制都在复制都在DNA分子上特定位置开始的，分子上特定位置开始的，这个特定的位置称为这个特定的位置称为复制起点（复制起点（Origin of replication）,用用ori表示表示,富含富含A,T。GATCTNTTNTTTT成串排列的成串排列的三

17、个三个13bp序列序列共有序列共有序列共有序列共有序列TTATCCACA DnaA蛋白结合位点蛋白结合位点四个四个9bp序列序列DnaADnaB(解螺旋酶解螺旋酶)SSB大肠杆菌大肠杆菌DNA复制起点在起始阶段的结构模型复制起点在起始阶段的结构模型245 bpReplicator sequences include initiator binding sites and easily unwound DNA复制叉复制叉1复制叉复制叉2复制叉复制叉2的终点的终点复制叉复制叉1的终点的终点1. The DNA molecule is unwound and prepared for synthes

18、is by the action of DNA gyrase, DNAhelicase and the single-stranded DNA binding proteins. 2. A free 3OH group is required for replication, but when the two chains separate no group of thatnature exists. RNA primers are synthesized, and the free 3OH of the primer is used to begin replication. 3. The

19、replication fork moves in one direction, but DNA replication only goes in the 5 to 3 direction.This paradox is resolved by the use of Okazaki fragments. These are short, discontinuous replicationproducts that are produced off the lagging strand. This is in comparison to the continuous strand that is

20、 made off the leading strand. 4. The final product does not have RNA stretches in it. These are removed by the 5 to 3 exonucleaseaction of Polymerase I. 5. The final product does not have any gaps in the DNA that result from the removal of the RNA primer. These are filled in by the 5 to 3 polymerase

21、 action of DNA Polymerase I. 6. DNA polymerase does not have the ability to form the final bond. This is done by the enzyme DNA ligase. A General Model for DNA ReplicationPOLIII, b b subunitPCNATelomerase isa reversetranscriptasetogether witha template RNAIt is active ingerm cells, notin somatic cel

22、ls,and is activatedin cancersGroupOrganismTelomeric repeat (5 to 3 toward the end)VertebratesHuman, mouse, XenopusTTAGGGFilamentousfungiNeurosporaTTAGGGSlime moldsPhysarum, DidymiumTTAGGG DictyosteliumAG(1-8)CiliatedprotozoaTetrahymena, GlaucomaTTGGGGParameciumTTGGG(T/G)Oxytricha, Stylonychia,TTTTGG

23、GGEuplotesFission yeastsSchizosaccharomyces pombeTTAC(A)(C)G(1-8)Budding yeasts Saccharomyces cerevisiaeTGTGGGTGTGGTGTelomeres contain arrays of DNA repeatsFinishing school for telomeres端粒的环状结构端粒的环状结构可修复的损伤可修复的损伤激活存活反应网络激活存活反应网络损伤类型损伤类型化学介质化学介质辐射因素辐射因素损伤程度损伤程度不可逆的损伤不可逆的损伤细胞反应细胞反应细胞后果细胞后果激活凋亡途径激活凋亡途径

24、细胞周期阻滞、修复细胞周期阻滞、修复突变、染色体畸变突变、染色体畸变细胞存活细胞存活细胞死亡细胞死亡细胞恶性转化细胞恶性转化自发碱基修饰自发碱基修饰复制错误复制错误各种各种DNADNA损伤损伤二、二、DNA修复修复( repair)DNADNA修复（修复（DNA repairingDNA repairing）是细胞对）是细胞对DNADNA受损伤后的一种反受损伤后的一种反应，这种反应可能使应，这种反应可能使DNADNA结构恢复原样，重新能执行它原来的功结构恢复原样，重新能执行它原来的功能；但有时并非能完全消除能；但有时并非能完全消除DNADNA的损伤，只是使细胞能够耐受这的损伤，只是使细胞能够耐

25、受这DNADNA的损伤而能继续生存。也许这未能完全修复而存留下来的损的损伤而能继续生存。也许这未能完全修复而存留下来的损伤会在适合的条件下显示出来（如细胞的癌变等），但如果细胞伤会在适合的条件下显示出来（如细胞的癌变等），但如果细胞不具备这修复功能，就无法对付经常在发生的不具备这修复功能，就无法对付经常在发生的DNADNA损伤事件，就损伤事件，就不能生存。所以研究不能生存。所以研究DNADNA修复也是探索生命的一个重要方面，而修复也是探索生命的一个重要方面，而且与基础医学、肿瘤学等密切相关。对不同的且与基础医学、肿瘤学等密切相关。对不同的DNADNA损伤，细胞可损伤，细胞可以有不同的修复反应以

26、有不同的修复反应 扼要说明细胞中DNA修复系统有哪几种 中国科学院2002年硕士学位研究生入学分子遗传学试题（一）错配修复（一）错配修复（mismatch repair）p 错配修复对错配修复对DNA复制忠实性的贡献力达复制忠实性的贡献力达102-103，DNA子子链中的错配几乎完全能被修正。链中的错配几乎完全能被修正。p 该系统识别母链的依据来自该系统识别母链的依据来自Dam甲基化酶，它能使位于甲基化酶，它能使位于5GATC序列中腺苷酸的序列中腺苷酸的N6位甲基化。一旦复制叉通过起始位位甲基化。一旦复制叉通过起始位点，母链就会在点，母链就会在DNA合成前的几秒至几分钟内被甲基化。合成前的几秒

27、至几分钟内被甲基化。p 只要两条只要两条DNA链上碱基配对出现问题，错配修复系统就会链上碱基配对出现问题，错配修复系统就会根据根据“保存母链，修正子链保存母链，修正子链”的原则，找出错误碱基所在的的原则，找出错误碱基所在的位置，并在对应于母链甲基化腺苷酸上游鸟苷酸的位置，并在对应于母链甲基化腺苷酸上游鸟苷酸的5位置切位置切开子链，再启动特定的修复途径，合成新的子链片断。开子链，再启动特定的修复途径，合成新的子链片断。（二）碱基切除修复（二）碱基切除修复（Base-excision repair）p 所有细胞中都带有能识别受损核酸位点的不同糖苷水解酶，所有细胞中都带有能识别受损核酸位点的不同糖苷

28、水解酶，能特异性切除受损核苷酸上的能特异性切除受损核苷酸上的N-糖苷键，形成去嘌呤或去嘧糖苷键，形成去嘌呤或去嘧啶位点，统称啶位点，统称AP位点。位点。p DNA分子中一旦产生了分子中一旦产生了AP位点，内切酶就会把受损核苷位点，内切酶就会把受损核苷酸的糖苷酸的糖苷-磷酸键切开，移去磷酸键切开，移去AP位点附近小片段位点附近小片段DNA，并由，并由DNA聚合酶聚合酶和和DNA连接酶共同完成修复。连接酶共同完成修复。（三）核苷酸切除修复（三）核苷酸切除修复（nucleotide-excision repair）p 当当NDA链上相应位置的核苷酸发生损伤，导致双链之间无链上相应位置的核苷酸发生损伤

29、，导致双链之间无法形成氢键，则由核苷酸切除修复系统负责修复。法形成氢键，则由核苷酸切除修复系统负责修复。p损伤发生后，首先由损伤发生后，首先由DNA切割酶在已损伤的核苷酸切割酶在已损伤的核苷酸5和和3位位置分别切开磷酸糖苷键，产生一个由置分别切开磷酸糖苷键，产生一个由12-13个核苷酸（原核生个核苷酸（原核生物）或物）或27-29个核苷酸（人或其他高等真核生物）的小片段，个核苷酸（人或其他高等真核生物）的小片段，移去小片段后由移去小片段后由DNA聚合酶聚合酶（原核）或（原核）或（真核）合成新的（真核）合成新的片断，并由片断，并由DNA连接酶完成修复中的最后一道工序。连接酶完成修复中的最后一道工

30、序。（四）直接修复（direct repair）p 生物体内还存在DNA损伤直接修复而并不需要切除碱基或核苷酸的机制。包括光修复、单链断裂的重接、碱基的直接插入、烷基的转移等。三、转座三、转座 (transposition)定义：定义： 是由可移位因子介导的遗传物质重排现象。是由可移位因子介导的遗传物质重排现象。转座子（转座子（transposon ,transposable element）：）：一些小的一些小的DNA序列，能移动到细胞基因组的任何部位。序列，能移动到细胞基因组的任何部位。这种不这种不依靠同源性而能移动的依靠同源性而能移动的DNA片段即称为转位元件或转座子，是片段即称为转位元

31、件或转座子，是存在于染色体存在于染色体DNA上可以自主复制和位移的基本单位。上可以自主复制和位移的基本单位。分类：插入序列；复合转座子；分类：插入序列；复合转座子； 非复合转座子非复合转座子 转座子的分类和结构特征转座子的分类和结构特征1、最简单的转座子不含有任何宿主基因而常称为、最简单的转座子不含有任何宿主基因而常称为插入序插入序列列（insertional sequence，IS），它们是细菌染色体或），它们是细菌染色体或质粒质粒DNA的正常组成部分。一个细菌细胞常含有不少于的正常组成部分。一个细菌细胞常含有不少于10个个IS序列。常见的序列。常见的IS序列都是很小的序列都是很小的DNA片

32、段（约片段（约1 kb），），末端具有倒置重复序列，转座时常复制宿主靶位点末端具有倒置重复序列，转座时常复制宿主靶位点415 bp的的DNA形成正向重复区。大部分形成正向重复区。大部分IS序列只有一个开放序列只有一个开放读码框，翻译起点紧挨着第一个倒置重复区，终止点位于读码框，翻译起点紧挨着第一个倒置重复区，终止点位于第二个倒置重复区或附近。第二个倒置重复区或附近。转座作用的机制转座作用的机制转座发生时，受体分子中有一段很短的（转座发生时，受体分子中有一段很短的（312 bp）、被）、被称为靶序列的称为靶序列的DNA会被复制，使插入的转座子位于两个重会被复制，使插入的转座子位于两个重复的靶序列

33、之间。复的靶序列之间。不同转座子的靶序列长度不同，但特定转座子所复制的靶不同转座子的靶序列长度不同，但特定转座子所复制的靶序列长度是一样的。序列长度是一样的。IS1两翼总共有两翼总共有9个碱基对的靶序列，个碱基对的靶序列，而而Tn3两端总共有两端总共有5 bp的靶序列。的靶序列。2、复合式转座子、复合式转座子（composite transposon）是一类带有某些抗药性基因（或其他宿主基因）的转座是一类带有某些抗药性基因（或其他宿主基因）的转座子，其两翼往往是两个相同或高度同源的子，其两翼往往是两个相同或高度同源的IS序列。序列。一旦形成复合转座子，一旦形成复合转座子，IS序列就不能再单独移

34、动，因为序列就不能再单独移动，因为它们的功能被修饰了，只能作为复合体移动。它们的功能被修饰了，只能作为复合体移动。3、除了末端带有、除了末端带有IS序列的复合转座子以外，还存在一些没序列的复合转座子以外，还存在一些没有有IS序列的、体积庞大的转座子（序列的、体积庞大的转座子（5000 bp以上），叫做以上），叫做TnA家族家族。这些转座子常带有。这些转座子常带有3个基因，一个编码个基因，一个编码-内酰胺内酰胺酶（酶（AmpR,青霉素抗性基因），另两个是转座所必须的。青霉素抗性基因），另两个是转座所必须的。所有所有TnA类转座子两翼都带有类转座子两翼都带有38 bp的倒置重复序列。的倒置重复序列

35、。根据转座方式不同把转座子分为复制性转座子和非复制性根据转座方式不同把转座子分为复制性转座子和非复制性转座子：转座子：在复制性转座中，整个转座子被复制，所移动的仅仅是原在复制性转座中，整个转座子被复制，所移动的仅仅是原转座子的拷贝。转座酶和解离酶分别作用于原始及复制转转座子的拷贝。转座酶和解离酶分别作用于原始及复制转座子。座子。TnA类主要是这种形式。类主要是这种形式。在非复制性转座中，原始转座子作为一个可移动的实体直在非复制性转座中，原始转座子作为一个可移动的实体直接被移位，这就会在供体位点上留下一个裂口，其结果是接被移位，这就会在供体位点上留下一个裂口，其结果是使供体基因组受到轻微的损伤（

36、在基因多拷贝的细菌中可使供体基因组受到轻微的损伤（在基因多拷贝的细菌中可以忍受）或致死，还有一种可能就是修复系统能识别双链以忍受）或致死，还有一种可能就是修复系统能识别双链断裂处，并加以修复。断裂处，并加以修复。IS序列、序列、Mu及及Tn5等以这种方式进等以这种方式进行转座。行转座。转座的遗传学效应转座的遗传学效应转座引起插入突变，导致结构基因失活；转座引起插入突变，导致结构基因失活；转座产生新的基因；转座产生新的基因；转座产生染色体畸变；转座产生染色体畸变；1. 转座引起生物进化：由于转座作用，使某些原来转座引起生物进化：由于转座作用，使某些原来在染色体上相距甚远的基因组合到一起，构建成在

37、染色体上相距甚远的基因组合到一起，构建成新的表达单元，产生新的基因和蛋白质分子。新的表达单元，产生新的基因和蛋白质分子。由转座子引起的染色体由转座子引起的染色体DNA缺失（缺失（a）或倒位（）或倒位（b）真核生物中的转座子真核生物中的转座子1、 玉米中的控制因子（玉米中的控制因子（controlling element）玉米中的控制因子分为两类，即自主性因子和非自玉米中的控制因子分为两类，即自主性因子和非自主性因子。当基因组中存在与非自主性因子同家族主性因子。当基因组中存在与非自主性因子同家族的自主性因子时，它才具备转座功能。的自主性因子时，它才具备转座功能。同一家族的自主性因子能为非自主性因

38、子的转座提同一家族的自主性因子能为非自主性因子的转座提供反式作用蛋白（转座酶）。供反式作用蛋白（转座酶）。在著名的在著名的AcDs体系中，自主转座子体系中，自主转座子Ac（活化子，（活化子，activator）长）长4563 bp，转录生成，转录生成3500 bp的单一的单一成熟成熟RNA。Ac转座子的两翼有转座子的两翼有11 bp的倒置重复序列，在其靶的倒置重复序列，在其靶DNA位点复制形成位点复制形成8 bp正向重复。正向重复。已知所有已知所有Ds（解离子，（解离子，dissociate）都是）都是Ac转座转座子的缺失突变体，其两端有完整的转座特征序列。子的缺失突变体，其两端有完整的转座特

39、征序列。The structure of the Ac autonomous transposable element of corn and of several Ds nonautonomous elements derived from Ac“ 杂种不育杂种不育”（hybrid dysgenesis）。）。P型型（父本贡献的，（父本贡献的，paternal contributing）M型型（母本贡献的，（母本贡献的，maternal contributing）M（）（）P（）（） 后代可育后代可育P（）（）M（）（） 后代不育。后代不育。 P转座子两翼都与转座子两翼都与31 bp倒置重复

40、序列，转座后导致靶倒置重复序列，转座后导致靶DNA复制产生复制产生8 bp正向重复序列。有实验证明，正向重复序列。有实验证明，P转座子插入果转座子插入果蝇基因组蝇基因组W位点引起杂种不育位点引起杂种不育。P转座子的原初转录产物为转座子的原初转录产物为2.5或或3.0 kb，包括外显子，包括外显子0、1、2、3，3个内含子。个内含子。体细胞中，只有前两个内含子能被顺利切除，产生包括外显体细胞中，只有前两个内含子能被顺利切除，产生包括外显子子02的功能型的功能型mRNA并被翻译成一个并被翻译成一个6.6104的转座阻遏的转座阻遏蛋白。蛋白。在雄性生殖细胞中，内含子在雄性生殖细胞中，内含子4能被切除

41、，所产生的成熟能被切除，所产生的成熟mRNA包括全部包括全部4个外显子并被翻译成个外显子并被翻译成8.7104转座酶，导转座酶，导致致P转座子转座和配子体败育。转座子转座和配子体败育。有 P 因子转座 P 品系 (PP) 雄性染色体 雌性染色体 P 细胞型 阻遏物 P 因子 P 因子 66KD 阻遏物 抑制所 ORF0 ORF1 ORF2 ORF3 ORF0 ORF1 ORF2 ORF3 66K PM 雄性染色体 雌性染色体 P 细胞型 P 因 子 P 因子 合成转 ORF0 ORF1 ORF2 ORF3 座 酶 87K 杂种不育 MP 雄性染色体 雌性染色体 P 细胞型 阻遏物 无 P 因子

42、 P 因子 66KD 阻遏物 抑制所 ORF0 ORF1 ORF2 ORF3 66K 有 P 因 子转座 图 23-57 杂种不育取决于基因组中 P 因子和不同类型细胞中 66KD 阻遏物的相互作用。 (仿 B.Lewin:GENES ,1997, Fig.18.27)要点：要点：P品系中，品系中，P转座子基因在雄性配子体中表达为活性转座子基因在雄性配子体中表达为活性转座子，但在体细胞和雌性配子体中表达为转座阻转座子，但在体细胞和雌性配子体中表达为转座阻遏物；遏物；M品系中，没有品系中，没有P转座子基因存在，所以不存在转座子基因存在，所以不存在P转转座子和转座阻遏物；座子和转座阻遏物；P转座子插入基因