第5章分子生物学研究法(上)

1、教学目的：教学目的： 1. 熟悉熟悉DNA基本操作技术的原理及操作步骤。基本操作技术的原理及操作步骤。 2. 熟悉熟悉RNA基本操作技术的原理及操作步骤。基本操作技术的原理及操作步骤。 3. 熟悉基因克隆技术的原理及操作步骤。熟悉基因克隆技术的原理及操作步骤。 4. 了解蛋白质与蛋白质组学技术的原理。了解蛋白质与蛋白质组学技术的原理。教学重点：教学重点： DNA和和RNA的基本操作技术。的基本操作技术。第第5章章 分子生物学研究法分子生物学研究法(上上)DNA、RNA及蛋白质操作技术及蛋白质操作技术 5.1 重组重组DNA技术史话技术史话 5.2 DNA基本操作技术基本操作技术 5.3 RNA

2、基本操作技术基本操作技术 5.4 基因克隆技术基因克隆技术 5.5 蛋白质与蛋白质组学技术蛋白质与蛋白质组学技术从从20世纪中叶开始，分子生物学研究得到高速发展，世纪中叶开始，分子生物学研究得到高速发展，主要原因是研究方法，特别是基因操作和基因工程主要原因是研究方法，特别是基因操作和基因工程技术的进步。技术的进步。基因操作主要包括基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、核酸分分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因人工合成、定点突变和基因人工合成、定点突变和PCR扩增等，是分子生扩增等，是分子生物学研究的核心技术。物学

3、研究的核心技术。基因工程是指在体外将核酸分子插入载体分子，构基因工程是指在体外将核酸分子插入载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。基因工程技术是核酸操作技术的一部分，强调外源基因工程技术是核酸操作技术的一部分，强调外源核酸在另一种寄主细胞中的繁衍与性状表达。核酸在另一种寄主细胞中的繁衍与性状表达。分子生物学研究的起步主要表现在分子生物学研究的起步主要表现在3个方面：个方面：在在20世纪世纪40年代确定了遗传信息的携带者、即基年代确定了遗传信息的携带者、即

4、基因的分子载体是因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题。的物质基础问题。在在20世纪世纪50年代提出了年代提出了DNA分子的双螺旋结构模分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制，解决了基因的自我复制和型和半保留复制机制，解决了基因的自我复制和世代交替问题。世代交替问题。在在20世纪世纪50年代末至年代末至60年代，相继提出了年代，相继提出了“中心中心法则法则”和操纵子学说，成功地破译了遗传密码，和操纵子学说，成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息的流动与表达机制。阐明了遗传信息的流动与表达机制。但当时缺乏有效的分离和富集单一但当时缺乏有效的分离和富集单一D

5、NA分子的技术，分子的技术，而无法对这类物质进行直接的生化分析。而无法对这类物质进行直接的生化分析。随着随着DNA分子体外切割与连接及核苷酸序列分析技分子体外切割与连接及核苷酸序列分析技术的进步，推动了重组术的进步，推动了重组DNA技术的产生与发展。技术的产生与发展。重组重组DNA的核心是用限制性内切核酸酶和的核心是用限制性内切核酸酶和DNA连连接酶对接酶对DNA分子进行体外切割与连接。分子进行体外切割与连接。工具酶的发现与应用是现代生物工程技术发展史上工具酶的发现与应用是现代生物工程技术发展史上的重要事件的重要事件(见见P167表表5-1)。将外源将外源DNA和载体分子重组成杂种和载体分子重

6、组成杂种DNA分子后，分子后，还必须通过转化过程将其导入到新寄主细胞中，才还必须通过转化过程将其导入到新寄主细胞中，才能保证重组能保证重组DNA分子的增殖。分子的增殖。自从琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶被引入核酸研究以来，自从琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段。互作用的重要实验手段。核酸凝胶电泳是现在通用的分子生物学研究方法。核酸凝胶电泳是现在通用的分子生物学研究方法。是是DNA分型、分型、DNA核苷酸序

7、列分析、限制性内切核苷酸序列分析、限制性内切酶片段分析以及限制酶切作图等的技术基础。酶片段分析以及限制酶切作图等的技术基础。凝胶的分辨率与凝胶的类型和浓度有关凝胶的分辨率与凝胶的类型和浓度有关(P174表表5-2)。在凝胶电泳中，一般要加入溴化乙锭在凝胶电泳中，一般要加入溴化乙锭(EB)染色。染色。EB染色后的核酸分子在紫外光下发出荧光。染色后的核酸分子在紫外光下发出荧光。5.2.1 核酸凝胶电泳核酸凝胶电泳核酸凝胶电泳的基本原理：核酸凝胶电泳的基本原理：某种分子在特定的电场中，就会以一定的速度向适某种分子在特定的电场中，就会以一定的速度向适当的电极移动。当的电极移动。某物质在电场作用下的迁移

8、速度称为迁移率。某物质在电场作用下的迁移速度称为迁移率。迁移率与电场强度成正比，与该分子所携带的净电迁移率与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比(分子大分子大小、极性、介质的粘度系数等小、极性、介质的粘度系数等)。生理条件下，核酸分子中的糖生理条件下，核酸分子中的糖-磷酸骨架中的磷酸磷酸骨架中的磷酸基团呈离子化状态。把核酸分子放置在电场当中，基团呈离子化状态。把核酸分子放置在电场当中，将会向电场的正极方向迁移。将会向电场的正极方向迁移。普通凝胶电泳只能进行普通凝胶电泳只能进行DNA小片段分离，应用脉冲小片段分离，应用脉冲电

9、场凝胶技术可进行超大电场凝胶技术可进行超大DNA片段的分离研究。片段的分离研究。称样称样溶解溶解加热加热制板制板倒胶倒胶电泳操作基本程序电泳操作基本程序取样取样点样点样电泳电泳检测检测细菌转化是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌转化是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的细菌菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的生而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。命过程。提供转化提供转化DNA的菌株叫作供体菌株，接受转化的菌株叫作供体菌株，接受转化DNA的细菌菌株则被称为受体菌株。的细菌菌株则被称为受体菌株。处于能够接受外源处于能够接受外源DNA状态的细胞称为感受态细胞。状态的细胞称为感受态细

10、胞。细菌转化常用的方法：细菌转化常用的方法：CaCl2法和电击法。法和电击法。CaCl2法：法：将快速生长中的大肠杆菌置于经低温将快速生长中的大肠杆菌置于经低温(0)预处理的低渗氯化钙溶液中，造成细胞膨胀，膜通预处理的低渗氯化钙溶液中，造成细胞膨胀，膜通透性改变。透性改变。电击法：电击法：锐利的电脉冲可在细胞膜上造成小凹陷，锐利的电脉冲可在细胞膜上造成小凹陷，再形成孔洞。再形成孔洞。聚合酶链式反应聚合酶链式反应(PCR)是一种在体外快速扩增特是一种在体外快速扩增特定基因或定基因或DNA序列的方法。序列的方法。PCR体系的基本组成：体系的基本组成：超纯水、缓冲液、超纯水、缓冲液、Mg2+、dNT

11、P、DNA模板、引物、模板、引物、TaqDNA聚合酶。聚合酶。PCR的主要步骤的主要步骤(3步多次循环步多次循环)：变性变性(9096) 在加热或碱性条件下可使在加热或碱性条件下可使DNA双螺旋双螺旋的氢键断裂，形成单链的氢键断裂，形成单链DNA，称之为变性。，称之为变性。退火退火(2565) 是模板与引物的复性。引物是与模板是模板与引物的复性。引物是与模板某区序列互补的一小段某区序列互补的一小段DNA片段。片段。延伸延伸(7075) 结合在特定结合在特定DNA模板上的引物为出发模板上的引物为出发点，将四种脱氧核苷酸以碱基配对形式按点，将四种脱氧核苷酸以碱基配对形式按5 3 的方向的方向沿着模

12、板顺序合成新的沿着模板顺序合成新的DNA链。链。在在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法称为实时定量知模板进行定量分析的方法称为实时定量PCR。常规常规PCR技术无法对起始模板准确定量，无法对扩技术无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测增反应实时检测实时定量实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一循环扩增产物量的变化，通过扩增反应中每一循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲

13、线的分析对起始模板进行定量分析。值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数称为阈值时所经过的扩增循环次数称为Ct值。值。荧光标记方式：非特异性荧光标记荧光标记方式：非特异性荧光标记(SYBR Green)和和特异性荧光标记特异性荧光标记(TaqMan)。表观遗传：基因的表观遗传：基因的DNA序列不发生改变的情况下，序列不发生改变的情况下，基基 因的表达水平与功能发生改变，并产生可遗传因的表达水平与功能发生改变，并产生可遗传的表型。的表型。表观遗传学：是研究在没有细胞核表观遗传学：是研

14、究在没有细胞核DNA序列改变序列改变的情况时，基因功能的可逆的、可遗传的改变。的情况时，基因功能的可逆的、可遗传的改变。特征特征: 可遗传、可逆性、可遗传、可逆性、DNA不变。不变。表观遗传学的现象：表观遗传学的现象：DNA甲基化、组蛋白修饰、甲基化、组蛋白修饰、微小微小RNA、基因印记。、基因印记。DNA甲基化是指生物体在甲基转移酶的催化下，甲基化是指生物体在甲基转移酶的催化下，以以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体将甲基转移到特定腺苷甲硫氨酸为甲基供体将甲基转移到特定的碱基上的过程。的碱基上的过程。甲基化的主要形式有甲基化的主要形式有5-甲基胞嘧啶、甲基胞嘧啶、6-甲基腺嘌呤、甲基腺嘌呤、7-甲基

15、鸟嘌呤，真核生物主要发生于胞嘧啶。甲基鸟嘌呤，真核生物主要发生于胞嘧啶。DNA甲基化能引起染色质结构、甲基化能引起染色质结构、DNA构象、构象、DNA稳定性及稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，而与蛋白质相互作用方式的改变，而参与调控许多重要的生物学现象和发育过程。参与调控许多重要的生物学现象和发育过程。DNA甲基化将会抑制基因表达。甲基化将会抑制基因表达。DNA的的CpG序列在动物基因组的某些区域密度比序列在动物基因组的某些区域密度比较高，形成较高，形成CpG岛。岛。哺乳动物基因组中约有哺乳动物基因组中约有4万个万个CpG岛，岛， CpG岛常位岛常位于基因启动子区或第一个外显子区，只有

16、于基因启动子区或第一个外显子区，只有CpG岛岛中的胞嘧啶能被甲基化。中的胞嘧啶能被甲基化。肿瘤发生时，抑癌基因肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的岛以外的CpG序列非序列非甲基化程度增加，而甲基化程度增加，而CpG岛中则呈高甲基化状态。岛中则呈高甲基化状态。实验中常用重亚硫酸盐测序法来确定某个碱基位实验中常用重亚硫酸盐测序法来确定某个碱基位点的甲基化情况，其主要过程点的甲基化情况，其主要过程(见见P182图图5-15)：u将待测将待测DNA样品用限制性内切核酸酶处理，或用样品用限制性内切核酸酶处理，或用超声波破碎成超声波破碎成5001000bp的碎片。的碎片。u重亚硫酸盐处理使重亚硫酸盐处理使D

17、NA中未发生甲基化的胞嘧啶中未发生甲基化的胞嘧啶(C)发生脱氨基作用转变成尿嘧啶发生脱氨基作用转变成尿嘧啶(U)，甲基化后，甲基化后的胞嘧啶不受影响。的胞嘧啶不受影响。uPCR扩增后的尿嘧啶扩增后的尿嘧啶(U)被测序仪读取为胸腺嘧啶被测序仪读取为胸腺嘧啶(T)。对。对引物的选择和设计要求非常高。引物的选择和设计要求非常高。u参考原始序列即可判断原参考原始序列即可判断原C位点是否甲基化，未位点是否甲基化，未甲基化的甲基化的C经处理后成经处理后成T，甲基化的，甲基化的C不变。不变。从生物组织细胞提取出全部从生物组织细胞提取出全部DNA将其切成预期大小将其切成预期大小的片段，分别与载体连接，转入受体

18、细菌或细胞，的片段，分别与载体连接，转入受体细菌或细胞，形成克隆。形成克隆。每一个细胞接受了含有基因组每一个细胞接受了含有基因组DNA中的某个片段与中的某个片段与载体连接的重组载体连接的重组DNA分子，而且可以繁殖扩增，许分子，而且可以繁殖扩增，许多细胞一起组成一个含有基因组各多细胞一起组成一个含有基因组各DNA片段克隆的片段克隆的集合体，就称为基因组集合体，就称为基因组DNA文库。文库。基因组基因组DNA文库可用于分离特定的基因片断、分析文库可用于分离特定的基因片断、分析特定基因结构、研究基因表达调控、还可用于全基特定基因结构、研究基因表达调控、还可用于全基因组物理图谱的构建和全基因组序列测

19、定。因组物理图谱的构建和全基因组序列测定。细胞总细胞总RNA包括包括mRNA、rRNA、tRNA、sRNA。典型动物细胞中：典型动物细胞中：mRNA 1%5%，rRNA 80%85%，tRNA 15%20%。实验室常用实验室常用Trizol试剂提取总试剂提取总RNA。Trizol是一种新型总是一种新型总RNA抽提试剂，能迅速破碎细抽提试剂，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。主要成分是苯酚，胞并抑制细胞释放出的核酸酶。主要成分是苯酚，用来裂解细胞；还加有用来裂解细胞；还加有8-羟基喹啉、异硫氰酸胍、羟基喹啉、异硫氰酸胍、-巯基乙醇等，用来抑制内源和外源巯基乙醇等，用来抑制内源和外源RNas

20、e。5.3.1 总总RNA的提取的提取将组织在液氮中磨碎，每将组织在液氮中磨碎，每50100mg组织加入组织加入1ml TRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理。，用匀浆仪进行匀浆处理。将匀浆样品在室温将匀浆样品在室温(1530)放置放置5分钟，使核酸蛋分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。每使用白复合物完全分离。每使用1ml TRIzol加入加入0.2ml氯氯仿，振荡仿，振荡15秒，室温放置秒，室温放置3分钟。分钟。2810000g离心离心15分钟。样品分三层：底层为分钟。样品分三层：底层为黄色有机相，黄色有机相， RNA在上层水相中和一个中间层。在上层水相中和一个中间层。水相转移到新管中，每使用水相转

21、移到新管中，每使用1ml TRIzol加入加入0.5ml异异丙醇丙醇(沉淀水相中的沉淀水相中的RNA)，室温放置，室温放置10分钟。分钟。 2810000g离心离心10分钟，离心后在管侧和管底分钟，离心后在管侧和管底出现胶状出现胶状RNA沉淀，弃上清。沉淀，弃上清。 用用75%乙醇洗涤乙醇洗涤RNA沉淀。每沉淀。每1ml TRIzol加加1ml 75%乙醇。乙醇。28不超过不超过7500g离心离心5分钟，弃上分钟，弃上清。室温放置干燥或真空抽干清。室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀。沉淀。利用利用mRNA3 端含有端含有poly(A)的特点，当的特点，当mRNA流经流经寡聚寡聚(dT)纤维素柱时

22、，在高盐缓冲液作用下，纤维素柱时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异的吸附在寡聚被特异的吸附在寡聚(dT)纤维素上。纤维素上。再用低盐溶液或蒸馏水洗再用低盐溶液或蒸馏水洗脱脱mRNA。经过两次寡聚经过两次寡聚(dT)纤维素纤维素柱，可得较纯的柱，可得较纯的mRNA。纯化纯化mRNA在在70%乙醇中乙醇中 -70可保存一年以上。可保存一年以上。cDNA的合成包括第一链和第二链的合成包括第一链和第二链cDNA的合成。的合成。第一链第一链cDNA的合成是以的合成是以mRNA为模板，反转录为模板，反转录为为cDNA，由反转录酶催化，该酶合成，由反转录酶催化，该酶合成DNA时需时需要引物引导，常用引物是

23、寡聚要引物引导，常用引物是寡聚(dT)。寡聚寡聚(dT)引物一般含引物一般含1220个脱氧胸腺嘧啶核苷酸，个脱氧胸腺嘧啶核苷酸，后面再加一个连接引物后面再加一个连接引物(常为常为Xho酶切位点酶切位点)以便以便于克隆构建。于克隆构建。第二链第二链cDNA的合成以第一链为模板，由的合成以第一链为模板，由DNA聚聚合酶催化。合酶催化。cDNA文库是指某生物某发育时期文库是指某生物某发育时期所转录的全部所转录的全部mRNA经反转录形成经反转录形成的的cDNA片段与某种载体连接而形片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。成的克隆的集合。 RNA分离富集分离富集 mRNA cDNA逆转录酶逆转录酶复制复制

24、 双链双链cDNA载体载体 重组重组DNA分子分子含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌受体菌受体菌基本步骤：基本步骤：提取总提取总RNA。在获得高质量的在获得高质量的mRNA后，反转后，反转录合成录合成cDNA。合成接头的加入，将双链合成接头的加入，将双链DNA克克隆到载体中去。隆到载体中去。分析分析cDNA片断，扩增片断，扩增cDNA文库。文库。对建立的对建立的cDNA文库进行鉴定。文库进行鉴定。 基因文库的筛选是指通过某种特殊方法从基因文库基因文库的筛选是指通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组中鉴定出含有所需重组DNA分子特定克隆的过程。分子特定克隆的过程。筛选方法有很多种，常用

25、的有：核酸杂交法、筛选方法有很多种，常用的有：核酸杂交法、PCR筛选法、免疫筛选法。筛选法、免疫筛选法。核酸杂交法核酸杂交法 常用放射性标记的特异常用放射性标记的特异DNA探针进行探针进行高密度的菌落杂交筛选高密度的菌落杂交筛选(见见P189图图5-21)。PCR筛选法筛选法 在已知序列信息并获得基因特异引物在已知序列信息并获得基因特异引物时，用时，用PCR筛选法比较简单。筛选法比较简单。免疫筛选法免疫筛选法 基于抗原抗体特异性结合的原理，利用基于抗原抗体特异性结合的原理，利用表达载体所编码的蛋白质进行免疫筛选。表达载体所编码的蛋白质进行免疫筛选。在多细胞的高等生物个体水平上，人们用克隆在多细

26、胞的高等生物个体水平上，人们用克隆(clone)表示由具有相同基因型的同一物种的两表示由具有相同基因型的同一物种的两个或数个个体组成的群体。从同一受精卵分裂个或数个个体组成的群体。从同一受精卵分裂而来的单卵双生子便是属于同一克隆。而来的单卵双生子便是属于同一克隆。在细胞水平上，克隆一词是指由同一个祖细胞在细胞水平上，克隆一词是指由同一个祖细胞分裂而来的一群遗传上同一的子细胞群体。分裂而来的一群遗传上同一的子细胞群体。在分子生物学上，把外源在分子生物学上，把外源DNA插入具有复制能插入具有复制能力的载体力的载体DNA中，使之得以永久保存和复制，中，使之得以永久保存和复制，这种过程称为克隆。这种过

27、程称为克隆。cDNA末端快速扩增法末端快速扩增法(RACE)是用于从已知是用于从已知cDNA片段扩增全长基因的方法，根据已知序片段扩增全长基因的方法，根据已知序列设计基因片段内部特异引物，由该片段向外列设计基因片段内部特异引物，由该片段向外侧进行侧进行PCR扩增得到目的序列。扩增得到目的序列。用于扩增用于扩增5 端的方法称为端的方法称为5 RACE，用于扩增，用于扩增3 端的称为端的称为3 RACE。已知已知cDNA序列可来自序列表达标签、减法序列可来自序列表达标签、减法cDNA库、差法显示和基因文库筛选。库、差法显示和基因文库筛选。5 RACE 在反转录酶的作用下，以已知在反转录酶的作用下，

28、以已知基 因 片 段 内 部 特 异 性 引 物基 因 片 段 内 部 特 异 性 引 物(GPS1)启始启始cDNA第一条链的第一条链的合成合成 RNase降解模板降解模板mRNA，纯化，纯化cDNA第一条链。第一条链。 用末端转移酶在用末端转移酶在cDNA链链3 端端加加dC，形成寡聚，形成寡聚(dC)尾巴。尾巴。 以连有寡聚以连有寡聚(dG)的锚定引物的锚定引物(AP)和基因片段内部特异引物和基因片段内部特异引物(GPS2)进行进行PCR扩增，以期扩增，以期得到目的基因得到目的基因5 端片段。端片段。3 RACE 在反转录酶的作用下，以在反转录酶的作用下，以连有可以和连有可以和polyA

29、配对的配对的寡聚寡聚(dT)的锚定引物启始的锚定引物启始cDNA第一条链的合成。第一条链的合成。 RNaseH降解模板降解模板mRNA。 用通用锚定引物和基因片用通用锚定引物和基因片段内部特异引物进行段内部特异引物进行PCR扩增，以期得到目的基因扩增，以期得到目的基因3 端片段端片段。cDNA差示分析法差示分析法(RAD)充分发挥了充分发挥了PCR能以指数能以指数形式扩增双链形式扩增双链DNA模板，仅以线形形式扩增单链模模板，仅以线形形式扩增单链模板的特性，通过降低板的特性，通过降低cDNA群体复杂性和更换群体复杂性和更换cDNA两端接头等方法，特异性扩增目的基因片断。两端接头等方法，特异性扩

30、增目的基因片断。试验材料试验材料(Tester T)和探针材料和探针材料(Driver D)在接受差在接受差示分析前均经一个示分析前均经一个4碱基切割酶处理，形成平均长碱基切割酶处理，形成平均长度度256bp的代表群，保证绝大部分遗传信息能被的代表群，保证绝大部分遗传信息能被PCR扩增。扩增。每次每次T减减D反应后仅设置反应后仅设置72复性与延伸，复性与延伸，94变变性这两个参数共性这两个参数共20个个PCR循环，循环，PCR产物的特异性产物的特异性和所得探针的纯度非常高。和所得探针的纯度非常高。Gateway基因大规模克隆法利用基因大规模克隆法利用噬菌体进行位点噬菌体进行位点特异性特异性DN

31、A片段重组，实现不需要传统的酶切连片段重组，实现不需要传统的酶切连接过程的基因快速克隆和载体间平行转移，为大接过程的基因快速克隆和载体间平行转移，为大规模克隆基因组注释的可读框提供了保障。规模克隆基因组注释的可读框提供了保障。Gateway克隆技术包括克隆技术包括TOBO反应和反应和LR反应。反应。TOBO反应反应将目的基因连入将目的基因连入Entry载体载体(见见P194图图5-25a)。LR反应反应将目的基因片段从将目的基因片段从Entry载体重组到表达载体重组到表达载体载体(见见P194图图5-25b)。基因的图位克隆法是分离未知性状目的基因的一基因的图位克隆法是分离未知性状目的基因的一

32、种好方法。从理论上说，所有具有某种表现型的种好方法。从理论上说，所有具有某种表现型的基因都可以通过该方法克隆得到。基因都可以通过该方法克隆得到。首先，通过构建遗传连锁图，将目的基因定位到首先，通过构建遗传连锁图，将目的基因定位到某个染色体的特定位点，并在其两侧确定紧密连某个染色体的特定位点，并在其两侧确定紧密连锁的锁的RFLP或或RAPD分子标记。分子标记。其次，利用与目的基因最紧密连锁的一对分子标其次，利用与目的基因最紧密连锁的一对分子标记作探针，通过染色体步移技术将位于这两个标记作探针，通过染色体步移技术将位于这两个标记之间的基因片段克隆并分离出来。记之间的基因片段克隆并分离出来。再根据基

33、因功能互作原理鉴定目的基因。再根据基因功能互作原理鉴定目的基因。染色体步移：染色体步移： 利用已知的基因或分子标记来筛选大片段的利用已知的基因或分子标记来筛选大片段的DNA文库获得文库获得阳性克隆，如此得到的阳性克隆是阳性克隆，如此得到的阳性克隆是“一步克隆一步克隆”。 利用获得的克隆作探针对文库进行第二次杂交，得到与探利用获得的克隆作探针对文库进行第二次杂交，得到与探针具有重复序列的阳性克隆称为针具有重复序列的阳性克隆称为“二次克隆二次克隆”。 如此反复即可取到需要的克隆，获得目的基因。如此反复即可取到需要的克隆，获得目的基因。蛋白质组学的发展既是技术所推动的也是受技术蛋白质组学的发展既是技

34、术所推动的也是受技术限制的。限制的。蛋白质组学研究成功与否，很大程度上取决于其蛋白质组学研究成功与否，很大程度上取决于其技术方法水平的高低。技术方法水平的高低。蛋白质研究技术远比基因技术复杂和困难。蛋白质研究技术远比基因技术复杂和困难。蛋白质组的研究实质上是在细胞水平上对蛋白质蛋白质组的研究实质上是在细胞水平上对蛋白质进行大规模的平行分离和分析，往往要同时处理进行大规模的平行分离和分析，往往要同时处理成千上万种蛋白质。成千上万种蛋白质。发展高通量、高灵敏度、高准确性的研究技术平发展高通量、高灵敏度、高准确性的研究技术平台是现在乃至相当一段时间内蛋白质组学研究中台是现在乃至相当一段时间内蛋白质组

35、学研究中的主要任务。的主要任务。双向电泳双向电泳(2-DE)技术是分离大量混合蛋白质的最技术是分离大量混合蛋白质的最有效方法。有效方法。蛋白质组研究的发展以双向电泳技术作为核心。蛋白质组研究的发展以双向电泳技术作为核心。双向电泳包括等电聚焦双向电泳包括等电聚焦(IEF)和和SDS-聚丙烯酰胺凝聚丙烯酰胺凝胶胶(SDS-PAGE)两种电泳技术。两种电泳技术。第一向等电聚焦电泳第一向等电聚焦电泳 不同等电点蛋白会聚集在介不同等电点蛋白会聚集在介质的不同区域。质的不同区域。第二向第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 不同分子量的不同分子量的蛋白质分离。蛋白质分离。pH3 等电聚焦电泳等电聚焦电泳 pH10SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳荧光差异显示双向电泳技术荧光差异显示双向电泳技术(2D-DIGE)主要利用主要利用蛋白质的等电点和分子量的差异来分离蛋白质混蛋白质的等电点和分子量的差异来分离蛋白质