流式细胞仪及其应用指南

1、会计学1流式细胞仪及其应用指南流式细胞仪及其应用指南在管道大约50倍直径距离处，鞘液中心速度与边缘速度达到稳定，形成稳定的层流。样本与鞘液未入管道时，边缘与中心速度一致。进入管道后，受管壁粘性阻力边缘速度下降，中心速度不变。流体形成层流后，会产生流体聚焦效应，所有颗粒均被推致流速最快的液流中。颗粒以衡定的速度作匀速运动。标本来源：标本来源：外周血、骨髓、组织块、培养细胞、脱落细胞及其他。外周血、骨髓、组织块、培养细胞、脱落细胞及其他。根据各种具体实验，选用根据各种具体实验，选用不同的抗凝剂。不同的抗凝剂。可用的抗凝剂如下：可用的抗凝剂如下：EDTA： 2mg/ml枸椽酸钠：枸椽酸钠：0.38%

2、肝素：肝素：15IU/ml标本处理时间：新鲜样本分析时，样本采集后应立即分析样本固定方法：样本固定方法：1%的多聚甲醛或75%的酒精，作用30分钟。注：不同的实验，所用的固定方法不完全相同。样本处理标准试剂：样本处理标准试剂：一、10%Bovine Serum Albumin BSA1. 溶解10g BSA至100ml蒸馏水中2. 4C，20000 g离心30分钟3. 分装后-20C保存二、0.1% BSA-PBS缓冲液 1. 准备500ml，PH7.3 PBS2. 加入5ml 10% BSA3. 使用0.45um滤网过滤三、氯化铵溶血剂 1. 在一升蒸馏水中溶解8.29g NH4CL,1g

3、KHCO3和37mg Na2EDTA 2. 调节PH值至7.23. 在使用前配置该溶血剂，并用0.45um滤膜过滤方法一：溶血法方法一：溶血法1.取取100 ul抗凝全血；抗凝全血；2. 快速加入快速加入 2ml NH4CL溶血剂溶血剂,混匀；混匀；3. 室温孵育室温孵育10分钟；分钟；4. 4C，400g离心离心10分钟。去上清，加入分钟。去上清，加入2ml BSA-PBS；5. 4C，400g离心离心10分钟。去上清，加入分钟。去上清，加入2ml BSA-PBS；6. 4C，400g离心离心10分钟。去上清，调整细胞浓度至分钟。去上清，调整细胞浓度至5x106/ml。富集白细胞富集白细胞注

4、：注：化学试剂直接作用于红细胞的溶血剂有：以草酸为主的溶血剂（化学试剂直接作用于红细胞的溶血剂有：以草酸为主的溶血剂（Coulter Q-Prep），基于），基于NH4CL的的BD公司的公司的FACSLyse溶血剂。溶血剂。优点：优点：溶血时间快？，在流式细胞仪上可清楚地将淋巴、单核、溶血时间快？，在流式细胞仪上可清楚地将淋巴、单核、粒及红细胞碎片相区分。粒及红细胞碎片相区分。缺点：缺点：需严格掌握溶血时间，对白细胞表面抗原有影响，随时间细胞形需严格掌握溶血时间，对白细胞表面抗原有影响，随时间细胞形态变化大。态变化大。方法二：密度离心法提取单个核细胞方法二：密度离心法提取单个核细胞 Histo

5、paque 1077为为Ficoll与与Sodium diatrizoate(泛影酸钠泛影酸钠)混合物，其密混合物，其密度为度为1.1191.077。通过离心可将全血中的粒细胞与单个核细胞分离。粒细胞。通过离心可将全血中的粒细胞与单个核细胞分离。粒细胞沉积于沉积于1.1191.077的血浆层，而单个核细胞则在的血浆层，而单个核细胞则在1.077以下的血浆层中。以下的血浆层中。 1. 准备2ml抗凝血（根据实验要求确定用血量）， 等量PBS稀释；2. 准备1ml Histopaque 1077 (Sigma)；3. 室温下700g离心30分钟；4. 仔细将含有单个核细胞血浆层吸出；5. 加4ml

6、 BSA-PBS，400g离心10分钟；6. 加2ml BSA-PBS清洗2次。 淋巴节、扁桃体、脾、胸腺等淋巴组织淋巴节、扁桃体、脾、胸腺等淋巴组织由于结构松散，由于结构松散，容易分离成单个细胞。一般对样本进行切剪、研磨、过滤便可。容易分离成单个细胞。一般对样本进行切剪、研磨、过滤便可。3.将样本经滤网过滤，用密度法分离、提将样本经滤网过滤，用密度法分离、提纯淋巴细胞。纯淋巴细胞。方方 法法：其他标本：其他标本：通常在其他组织中分离淋巴细胞需用酶进行消化。对于通常在其他组织中分离淋巴细胞需用酶进行消化。对于不同标本，处理方法也各不相同。不同标本，处理方法也各不相同。制备大鼠肾脏浸润细胞制备大

7、鼠肾脏浸润细胞解剖刀、解剖刀、CO2孵育箱、滤网孵育箱、滤网以及含以及含1mg/ml胶原酶的细胞培养液（无血清）胶原酶的细胞培养液（无血清）材料：材料：1. 将样本置于皮氏培养皿，用解培刀切成小块；将样本置于皮氏培养皿，用解培刀切成小块；2. 加入加入10ml胶原酶溶液，胶原酶溶液，37C CO2培养箱孵育培养箱孵育30分钟；分钟；3. 滤网过滤；滤网过滤；4. 密度梯度法离心提纯淋巴细胞。密度梯度法离心提纯淋巴细胞。1. 解剖刀解剖刀2. 0.15%胰蛋白酶胰蛋白酶3. Hankss缓冲盐或缓冲盐或PBS，pH7.34. 不含不含Ca、Mg离子的离子的HBSS5. II型胶原酶型胶原酶6.

8、1%BSA或或5%FBS7. 5ml的吸样管的吸样管8. 35um尼龙滤网尼龙滤网9. DNase1. 将样本置于皮氏培养皿，加15ml BSA-PBS，将样本切 成1mm3大小，用镊子将其分离；2. HBSS或PBS洗清3. 加入10ml无Ca、Mg离子0.2% II型胶原酶溶液0.02% DNase 1的HBSS；4. 37C摇床上孵育1560分钟，视样本类型而定；操操 作作8.、Mg的HBSS重悬， 37C孵育一段时间加入1%BSA或5%FBS，灭活酶活性。n其他样本，计数后决定使用体积目标细胞数量及检测终浓度：目标细胞数量及检测终浓度：1106/mlSPECIFIC ANTIBODYN

9、ON-SPECIFIC ANTIBODYCONCENTRATIONAMOUNT BOUND抗体滴定原理抗体滴定原理33 gs/n = 2.51 gs/n = 2.10.3 gs/n = 2.40.1 gs/n = 4.10.03 gs/n = 4.80.01 gs/n = 4.60.003 gs/n = 3.50.001 gs/n = 3.2auto65432100102030405060DilutionSignal to NoiseTITER放置较长时间放置较长时间白细胞保护型溶血剂Cal-Lyse(其中已含细胞固定剂)：1，100ul外周血，加入100ul溶血剂2，混匀后，室温下孵育10分

10、钟3，加入2ml蒸馏水，混匀后室温下孵育10分钟4，根据实验需要，免洗直接上机检测或400g离心10分钟后PBS重悬优点：试剂为温和型溶血剂，不影响细胞表面抗原及溶血时间无需精确把握各各溶溶血血剂剂性性能能比比较较能量级激发激发态发射激光能量损失Alexa Green具有更佳的能量转移效率及更纯的发射光谱为复合荧光素，荧光激发较率较高，信号强FTIC、PE、PE-Cy5三者为流式细胞最为常的荧光，并经常将三者共同使用进行三色分析在配有双激光的流式细胞仪上，此荧光染料与FITC、PE、PE-Cy5联用做四色分析。但现在因单激光四色可实现，故使用该染料意义不大。染料激发光发射光光源Propidiu

11、m Iodide495342639488Ethidium biromide4933206374887-Aminoactinomycin D546647514488Acridine Orange503 530(DNA)488640(RNA)Chromomycin A3430580457Hoechst 33342395450UVDAPI372456UVPyronin Y545565514488Thiazole Orange509533488YO-PRO-1642661488TO-PRO-3642661630LDS 751543712488需要更高的精度：300MESF以内nn如标本中无明显特征细胞

12、群，可使用已建淋巴细胞检测方案根据相对位置定位目标细胞群FL1FL2n多色荧光补偿调节方法同双色法ISHAGE方案去除这些影响。据其中的淋巴细胞的位置调节R4门确定R4 门在FS 和SS 轴上最小值的最低范围线的左侧然后根据此进的CD45 界线位置确定R1 门的最小值n下载：乳腺癌DNA异倍体患者生存率DNA倍体分析中，S期的含量也是评估疾病预后的重要指标检测是结合肿瘤标记物，特异性地分析肿瘤细胞的检测是结合肿瘤标记物，特异性地分析肿瘤细胞的DNADNA含量有助于提高诊断的准确率。含量有助于提高诊断的准确率。10101 110102 210103 310104 4Thi azol e O range -Thi azol e O range -