T∕CPMA 023-2020 血中N-甲基氨甲酰血红蛋白加合物的测定 液相色谱串联质谱法

1、ICS 13.100CCSC 52团体标准T/CPMA 0232020血中N-甲基氨甲酰血红蛋白加合物的测定液相色谱串联质谱法Determination of N-methylcarbamoylatedhaemoglobin in blood by liquid chromatography-tandem mass spectrometry2020-12-30 发布2021-05-01 实施中华预防医学会发 布前言本标准按照GB/T 1.1-2020给出的规则起草。本标准由中华预防医学会提出并归口。本标准起草单位：苏州市疾病预防控制中心、杭州医学院、江苏省疾病预防控制中心、无锡市疾病预防控制中

2、心、江苏康达检测技术股份有限公司。本标准主要起草人：王春民、吴春霞、张秋萍、刘强、钱亚玲、唐红芳、阮征、刘华良、朱峰、吴宇伉、刘文卫、付杰、李军、李建、沈强、杨海兵血中 N-甲基氨甲酰血红蛋白加合物的测定液相色谱串联质谱法1 范围本标准规定了血中N-甲基氨甲酰血红蛋白加合物的液相色谱串联质谱检测方法。本标准适用于接触二甲基甲酰胺的职业人群血中N-甲基氨甲酰血红蛋白加合物的测定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GBZ/T 295 职业人群生物监测方法总则

3、3 原理血红蛋白中的N-甲基氨甲酰血红蛋白加合物（NMHb）经酸水解转化为3-甲基-5-异丙基乙内酰脲（MVH）后，经蛋白沉淀净化，液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）测定，以保留时间和特征离子及其丰度比定性，以定量特征离子的峰面积，用内标工作曲线法进行定量。4 仪器及材料4.1 肝素或乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝采血管：5 mL。4.2 具塞圆底离心管：15mL。4.3 离心机：4000 rpm。4.4 真空离心浓缩仪。4.5 涡旋混合器。4.6 电热恒温水浴锅，±2。4.7 96 孔板减压提取装置。4.8 96 孔蛋白沉淀板（配收集板及盖板）：复合吸附型（40mg/2ml/wel

4、l）或相当者。4.9 天平：感量 1mg 和 0.1 mg。4.10 液相色谱串联质谱仪，配电喷雾离子源。5 试剂5.1 超纯水。5.2 甲醇（CH3OH）：色谱纯。5.3 乙腈（C2H3N）：色谱纯。5.4 盐酸（HCl，=1.18 g/cm³）：优级纯。5.5 冰醋酸（CH3COOH）：优级纯。5.6 甲酸（HCOOH）：色谱纯。5.7 氯化钠（NaCl）：分析纯。5.8 氯化钾（KCl）：分析纯。5.9 十二水磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）：分析纯。5.10 磷酸二氢钾（KH2PO4）：分析纯。5.11 磷酸盐缓冲溶液：称取 80 g 氯化钠、2 g 氯化钾

5、、35.8 g 十二水磷酸氢二钠、2.4 g 磷酸二氢钾溶于 1000 mL 水中。或可直接购买成品（PBS，10 ×）。5.12 3-甲基-5-异丙基乙内酰脲（MVH，CAS：74310-99-9）：标准物质或色谱纯试剂（纯度99.0%）。5.133-甲基-异丁基海因（MIH，CAS：675854-31-6）：标准物质或色谱纯试剂（纯度99.0%）。5.14 甲醇溶液（1:1, v/v）：量取 100 mL 甲醇加入到 100 mL 水中。5.15 盐酸醋酸溶液（2:1,v/v）：量取 100 mL 冰醋酸加入到 200 mL 盐酸中。5.16 甲酸乙腈溶液（1:99,v/v）：吸

6、取 1 mL 甲酸加入到 99 mL 乙腈中。5.17 MVH 标准储备溶液：称取 0.0156 g MVH，用甲醇溶液溶解并定容至 50 mL，该储备液浓度为2.0 mmol/L。此溶液可在 4 冰箱中保存 14 d。5.18MIH 内标储备液：称取 0.0170 g MIH，用甲醇溶液溶解并定容至 50 mL，该内标储备液浓度为2.0 mmol/L。此溶液可在 4 冰箱中保存 14 d。5.19MIH 内标工作液：临用前准确吸取MIH 内标储备液 1.0 mL 于 50 mL 容量瓶中，用甲醇溶液定容至刻度，该内标溶液浓度为 40.0 nmol/mL。6 样品的采集、运输、制备和保存6.1

7、 样品采集、运输按GBZ/T 295要求采集职业人群静脉全血2.5 mL于采血管中，立即轻轻摇匀；采集未暴露于二甲基甲酰胺的健康人群血样，立即轻轻摇匀，作为空白血样。样品冷藏运输。6.2 血红蛋白提取取 2 mL 血样于 15 mL 离心管中，以 2000 rpm 离心 15min。弃去上层，加入 7.0 mL 水，轻轻振荡10s，立即加入 1.0 mL 磷酸盐缓冲溶液，摇匀，以 1000 rpm 离心 5min。吸取上清液于另一 15 mL 离心管中，得血红蛋白提取液。提取液在真空离心浓缩仪中（45 ）干燥至干，制成松散、无结块的血红蛋白粉末约 300 mg。未暴露于二甲基甲酰胺的健康人群血

8、样，按上方法制备成空白血红蛋白。血液中血红蛋白提取应在 24 h 内完成。6.3 样品保存血红蛋白提取液密封后在4 可保存3 d，在-18 可保存5 d。干燥后血红蛋白粉末在-18 可保存14 d，在-80 可保存30 d。7 分析步骤7.1 仪器操作参考条件7.1.1 液相色谱参考条件a) 色谱柱：Bonshell C18 Plus（3.0mm×50mm，2.7mm，100 Å）或相当者；b)柱温：35；c) 流动相：A 为 0.1%甲酸溶液，B 为 0.1%甲酸乙腈溶液；d) 流速：0.25mL/min；e) 进样量：5mL；f) 流动相梯度洗脱条件见表 1。表1流动相

9、梯度洗脱条件时间/min流动相 A/%流动相 B/%0.0090101.2010903.0010903.5090104.0090107.1.2 质谱参考条件a) 电离方式：电喷雾电离（ESI），正离子模式；b) 毛细管电压：3.5 kV；c)源温度：150；d) 脱溶剂气温度：350；e) 脱溶剂气流速：800 L/h；f) 检测方式：多反应监测（MRM），监测参数见表 2。表2多反应监测（MRM）参数化合物母离子子离子锥孔电压/V碰撞能量/V3-甲基-5-异丙基乙内酰脲157.172.03215129.132113-甲基-异丁基海因171.186.03015a 为定量离子7.2 工作曲线制备

10、与测定各取适量 MVH 标准储备溶液，用甲醇溶液将其稀释成 0 nmol/mL400 nmol/mL 的标准系列溶液。依次取 100mL 以上标准系列溶液，加入到各含有 0.100 g 空白血红蛋白粉末的 15mL 圆底离心管中，然后各加入 250mL MIH 内标工作液，再各加入盐酸醋酸溶液 4.65mL，立即涡旋混匀 30s，将以上离心管置于 95 水浴中加热降解 1 h，取出冷却至室温，混匀后净化。取降解后溶液 200mL 上样到 96 孔蛋白沉淀板，加入 600mL 甲酸乙腈溶液，混匀后盖上盖板。控制真空泵压力使液滴流出速度不超过 1 mL/min，收集流出液，混匀；制备得到内标 MI

11、H 含量为 10.0 nmol 的 MVH 含量为 0 nmol40 nmol 标准工作系列溶液。参照仪器操作条件，分别测定标准工作系列溶液；以标准工作系列溶液中 MVH 的含量为横坐标， 以测得的 MVH 峰面积与内标 MIH 峰面积比值为纵坐标，绘制内标工作曲线。7.3 样品处理称取0.1g（精确至0.001g）血红蛋白粉末置于15mL具塞圆底离心管中，加入250 mL MIH内标工作液，再加入盐酸醋酸溶液4.75mL，立即涡旋混匀30s。将离心管置于95 水浴中加热降解1 h，取出冷却至室温，混匀后待净化。注：降解反应过程可能产生气泡，小心操作。取降解后溶液200mL上样到96孔蛋白沉淀

12、板，加入600mL甲酸乙腈溶液，混匀后盖上盖板。控制真空泵压力使液滴流出速度不超过1 mL/min，收集流出液，混匀后待测。7.4 样品测定用测定标准系列溶液的操作条件测定样品和样品空白溶液。样品中待测组分保留时间与标准工作溶液中对应组分保留时间相同，定性离子的相对丰度与相当浓度标准工作溶液中定性离子相对丰度一致， 且相对丰度允许偏差不超过表3规定的范围，则可判定样品中存在对应的化合物。表3定性确证相对离子丰度最大允许偏差相对离子丰度50%20%50%（含）10%20%（含）10%允许相对偏差±20%±25%±30%±50%根据得到的目标物峰面积，采用内

13、标工作曲线法进行定量。若MVH的浓度超过测定范围，则应减少取样量重新处理后再进样测定。7.5 质量控制检测过程质量控制按照GBZ/T 295进行。8 计算N-甲基氨甲酰血红蛋白加合物（NMHb）转化成3-甲基-5-异丙基乙内酰脲（MVH）为等摩尔反应， 故样品中N-甲基氨甲酰血红蛋白加合物（NMHb）的浓度可按式（1）计算：c = n（1）m式中：c样品中N-甲基氨甲酰血红蛋白加合物（NMHb）的浓度，单位为纳摩尔每克血红蛋白（nmol/gHb）；n根据工作曲线计算得到的样品中MVH的含量，单位为纳摩尔（nmol）； m称取血红蛋白样品的重量，单位为克（g）。9 说明9.1 本法的检出限为 0.05 nmol/mL，定量下限为 0.168 nmol/mL，测定范围为 0.168 nmol/mL8.0 nmol/mL。（以 0.1 g 血红蛋白粉末量计）血中 N-甲基氨甲酰血红蛋白加合物（NMHb）的最低检出浓度为 2.5 nmol/gHb，最低定量浓度为 8.4 nmol/gHb。方法批内精密度