饲 料 级 复 合 酶 制 剂06新

1、 Q/SLH山东六和农牧科技园有限公司发 布2006-10-01实施2006-09-01发布饲 料 级 复 合 酶 制 剂Compound Enzyme Preparation for FeedstuffQ/SLH002-2006山东六和农牧科技园有限公司企业标准前 言本标准有效期限三年，到期复审。本标准的附录A、B、C、D、E为规范性附录。本标准由山东六和农牧科技园有限公司提出。本标准起草单位：山东六和农牧科技园有限公司。本标准主要起草人：范志恒饲 料 级 复 合 酶 制 剂1 范围本标准规定了饲料用复合酶制剂的产品分类、技术要求、检验方法、检验规则及标志、标签、包装、运输和贮存。本标准适用

2、于本企业以黑曲霉等菌种用发酵法生产并根据饲料原料和动物消化生理的不同而特定复配的复合酶制剂。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。QB/T 1803-1993 工业酶制剂通用试验方法GB 4789.3-1994 食品卫生微生物学检验-大肠菌群测定GB/5917-1986 配合饲料粉碎粒度测定法 GB/T 6435-1986 饲料水分的测定方法 GB 10648-1

3、999 饲料标签 GB 13078-2001 饲料卫生标准 GB/T 13079-1999 饲料中总砷的测定方法 GB/T 13080-1991 饲料中铅的测定方法 GB/T 13082-1991 饲料中镉的测定方法 GB/T 13091-1991 饲料中沙门氏菌的检验方法 GB 15193.1-1994 食品安全性毒理学评价程序和方法GB/T 17480-1998 饲料中黄曲霉毒素B1的测定方法酶联免疫吸附法3 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1 饲料用复合酶制剂是指以黑曲霉等菌种用发酵法生产并根据饲料原料和动物消化生理的不同而特定复配的复合酶制剂，含有木聚糖酶、果胶酶、酸性蛋白酶

4、等主要功效酶成分。 4 产品分类表1 产品分类及适用对象 适用对象品名 猪 猪用玉米豆粕型复合酶制剂 禽禽用玉米豆粕型复合酶制剂 禽禽用小麦型复合酶制剂 鱼、虾等水产动物水产用型复合酶制剂 畜、禽及水产等动物通用型复合酶制剂5 技术要求5.1 感官指标 色泽一致，粒度均匀，无发霉变质、结块及异味异臭。5.2 卫生指标卫生指标应符合GB13078的要求及表2的规定。表2 卫生指标项目指标砷,mg/Kg(以As计)3.0铅, mg/Kg(以Pb计)10.0镉, mg/Kg (以Cd计)0.5沙门氏杆菌不得检出大肠菌群，个/100g3000黄曲霉毒素B1,ug/Kg105.3 技术指标技术指标应符合

5、表3规定。表3 技术指标 产品类型 项目猪用型禽用型水产用型通用型玉米豆粕玉米豆粕小麦酶活力u/g木聚糖酶2000020000600002000030000酸性蛋白酶2000果胶酶20002400甘露聚糖酶350300纤维素酶700320葡聚糖酶3800020000淀粉酶100酶活力保存率% （25保存1年）70水分% 12粒度(40目标准筛通过率)% 806 抽样6.1 组批 原料不变，同一配方同一工艺同一生产日连续生产的产品为一个批次。6.2 抽样按照GB/T14699.1的规定参照执行。7 检验方法7.1 感官 称取样品50g,用肉眼观察、鼻子嗅闻、手触摸。 7.2 酸性蛋白酶、淀粉酶活

6、力按QB/T 1803-1993执行。7.3 酶活力保存率试验方法按QB/T 1803-1993执行。7.4 水分 按GB/T 6435-1986执行。7.5 粒度 按GB/T 5917-1986执行。7.6 砷 按GB/T 13079-1999执行。7.7 铅 按GB/T 13080-1991执行。7.8 镉 按GB/T 13082-1991执行。7.9 沙门氏菌 按GB/T 13091-1991执行。7.10 大肠菌群 按GB 4789.3-1994执行。7.11 黄曲霉毒素B1 按GB/T 17480-1998执行。7.12 木聚糖酶活力按附录A执行。7.13 果胶酶活力按附录B执行。7

7、.14 甘露聚糖酶活力按附录C执行。7.15 纤维素酶活力按附录D执行。7.16 葡聚糖酶活力按附录E执行。8 检验规则8.1 检验分类 检验分出厂检验和型式检验。 8.2 出厂检验8.2.1 出厂检验项目 感官指标、酶活力、水分、包装。 8.2.2 判定方法 对抽取的样品按出厂检验项目进行检验，如果检验结果中有任何一项指标不合格时，应重新取样进行复检，取样范围或样品数量是第一次的两倍；复检结果中仍有指标不合格，则整批产品判定为不合格，不能出库。8.2.3 出厂检验由本企业化验室进行。 8.3 型式检验8.3.1 型式检验指对产品质量、包装、标签进行全面检查。8.3.2 型式检验每年进行一次。

8、有下列情况之一必须进行型式检验。8.3.2.1 正式生产后，原料配方改变；8.3.2.2 正式生产后，工艺设备有较大改进；8.3.2.3 正式生产的产品停产3个月以上，重新恢复生产时；8.3.2.4 国家质量监督机构提出进行型式检验的要求；8.3.2.5 产品批准文号的发放和到期复审时。8.3.3 型式检验由本企业委托法定检验机构进行。 8.4 经出厂检验合格的产品，由质检科签发“产品质量检验合格证”方可出厂。8.5 若供需双方对产品质量发生争议时，可由双方协商，或选定法定质检机构按照本标准进行检验或判定，予以仲裁。9 标志、标签、包装、运输、贮存9.1 标志 产品外包装需注明：品名、规格、注

9、册商标、生产厂家等，并采用鲜明的标志和检验合格证。9.2 标签产品标签按GB 10648执行。9.3 包装产品包装应密封、防水、避光、牢固。9.4 运输 产品含有生物活性物质，运输过程中需有遮盖物，避免暴晒、雨淋及受热，搬运装卸时小心轻放，不得与有毒有害或其它污染物品混装混运。9.5 贮存 产品需于阴凉、干燥、避光处贮存。贮存仓库需保持清洁、阴凉、干燥、通风，防受热受潮。在阴凉干燥处，保质期为一年。 附录A（规范性附录）木聚糖酶酶活力测定方法A1 酶活力定义1g酶粉于40，pH5.0条件下，1min水解木聚糖生成相当于1g木糖还原物质，即为1个酶活力单位，以u/g表示。A2 试剂和溶液本方法中

10、所用试剂，在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂和符合GBT 6682中规定的三级水。 A2.1 pH5.00磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液A液（0.05M柠檬酸溶液）：称取10.51g柠檬酸（C6H8O7·H2O）于1000ml容量瓶中，用蒸馏水溶解定容至1000ml。B液（0.1M磷酸氢二钠溶液）：称取35.81g磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）于1000ml容量瓶中，用蒸馏水溶解定容至1000ml。将A、B两液混合，用精密pH计测定其pH值，必要时用3M盐酸溶液或3M氢氧化钠溶液调节pH值为5.00。 A2.2 DNS试剂 称取酒石酸钾钠182.0g，溶于500ml蒸馏

11、水中，加热（不得超过50），依次加入3,5二硝基水杨酸6.3g，氢氧化钠21.0g（21.0g NaoH/300ml蒸馏水），苯酚5.0g，无水亚硫酸钠5.0g，搅拌至溶液清澈透明。冷却后用蒸馏水定容至1000ml，储存于棕色瓶中，室温保存710天后使用。如需要可用烧结玻璃过滤器过滤。 A2.3 木聚糖溶液(10.00mg/ml) 准确称量1.000g木聚糖（SIGMA X4252，山毛榉），先用80ml缓冲液（A2.1）溶解，搅拌并加热直至完全溶解呈透明，冷却后移入100ml容量瓶，加20ml缓冲液（A2.1），用蒸馏水定容至100ml。 A2.4 木糖标准液(1mg/ml) 准确称量100

12、mg木糖（含量99%）（预先在105干燥至恒重）于100ml容量瓶中，用缓冲液（A2.1）溶解定容至100ml。A3 仪器、设备 A3.1 分析天平 A3.2 恒温水浴锅40±0.2 A3.3 分光光度计 A3.4 秒表 A4 测定步骤 A4.1 木糖标准曲线的绘制 分别精密量取1mg/ml木糖标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2ml依次加入七支25ml比色管中，以缓冲液（A2.1）补加到2.0ml，制备成浓度为01200g/ml的标准液，再各加入DNS试剂1.5ml，在沸水中煮沸7min（样品放入重新沸腾时算起），流水冷却。加蒸馏水21.5ml摇匀，于550n

13、m波长处进行比色测定，测定吸光度值。以木糖浓度（µg/ml）为横坐标，以吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。每一次配制DNS试剂，都要重新绘制标准曲线。 A4.2 测定精确称取酶粉1.0g先用少量pH5.0缓冲液溶解，并用玻璃棒捣碎，将上层清液倾入适当的容量瓶中，沉渣部分再用上述缓冲液溶解，如此反复34次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度，过滤，滤液供测定用。吸光度控制在0.20.4范围内。精密量取待测酶液1.0ml于25ml比色管中（每个样品三个平行），在40水浴中预热2min后加入1.0ml经预热的木聚糖溶液（A2.3）并混匀， 40水浴保温30min后立即加入1.5ml DN

14、S试剂终止反应，迅速放置沸水浴中煮沸7min（样品放入重新沸腾时算起），流水冷却，加蒸馏水21.5ml，摇匀后于550nm波长处进行比色测定。酶空白：于25ml比色管中加入1.0ml酶液，再加入1.5ml DNS试剂，摇匀。再加入1.0ml木聚糖溶液并混匀。40水浴保温30min后置沸水浴中煮沸7min（样品放入重新沸腾时算起），流水冷却，加蒸馏水21.5ml，摇匀后于550nm波长处进行比色测定。 A4.3 计算X=（W×N）÷（T×M）式中 X样品的酶活力（u/g）W用回归方程计算出相当的木糖µg数 W=（A-b）÷KN酶液的稀释倍数T反应

15、时间30min,以1min计M样品重量（g）所得结果表示至整数。附录B（规范性附录）果胶酶酶活力测定方法B1 酶活力定义1g酶粉于40，pH5.0条件下，1min水解果胶生成相当于1g半乳糖醛酸还原物质，即为1个酶活力单位，以u/g表示。B2 试剂和溶液本方法中所用试剂，在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂和符合GBT 6682中规定的三级水。 B2.1 pH5.00磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液 A液（0.05M柠檬酸溶液）：称取10.51g柠檬酸（C6H8O7·H2O）于1000ml容量瓶中，用蒸馏水溶解定容至1000ml。B液（0.1M磷酸氢二钠溶液）：称取35.81g磷酸氢二钠（Na

16、2HPO4·12H2O）于1000ml容量瓶中，用蒸馏水溶解定容至1000ml。将A、B两液混合，用精密pH计测定其pH值，必要时用3M盐酸溶液或3M氢氧化钠溶液调节pH值为5.00。B2.2 DNS试剂称取20.0g 3,5-二硝基水杨酸溶解于约800ml蒸馏水中，不断搅拌下逐渐加入300ml氢氧化钠溶液（32.0g NaoH/300ml蒸馏水），同时不断搅拌，水浴加热（溶液温度不要超过48）直到溶液清澈透明。在不断搅拌下逐渐加入600g酒石酸钾钠。如需要可加热（溶液温度不要超过48）直到溶液清澈透明。用蒸馏水定容至2000ml。置深色瓶中室温保存710天后使用，如需要可用烧结玻璃

17、过滤器过滤。有效期为6个月。DNS试剂在使用前，每100ml DNS溶液中加入0.3ml葡萄糖溶液（1.5g无水葡萄糖用蒸馏水溶解、定容至100ml）。现用现配。B2.3 2%（w/v）果胶底物准确称2.000g果胶（SIGMA P9135 Pectin, From Citrus Fruits）于100ml容量瓶中，用适量磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（B2.1）磁力搅拌直至完全溶解，用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（B2.1）定容至100ml。B3 仪器、设备B3.1 分析天平 B3.2 磁力搅拌器 B3.3 恒温水浴锅40±0.2 B3.4 分光光度计 B3.5 秒表B4 测定步骤B4.1

18、标准曲线准确称取1.0000g D-半乳糖醛酸（C6H10O7· H2O）于100ml容量瓶中，用蒸馏水溶解并定容至100ml，制备成浓度为10mg/ml标准贮备液。用蒸馏水稀释标准贮备液制备成浓度为08000g/ml的标准液，按如下所示：0g/ml 0ml贮备液用蒸馏水定容至10ml；1000g/ml 1ml贮备液用蒸馏水定容至10ml；3000g/ml 3ml贮备液用蒸馏水定容至10ml；5000g/ml 5ml贮备液用蒸馏水定容至10ml；8000g/ml 8ml贮备液用蒸馏水定容至10ml；精密量取0.2ml标准液和2.0ml缓冲液于25ml比色管中，混匀。加3.0mlDNS

19、试剂，混匀并放入强烈沸腾的水浴中煮沸整五分钟，迅速将比色管流水冷却终止显色反应，加10ml蒸馏水，混匀。以试剂空白为对照于540nm测定其吸光度值。以半乳糖醛酸的浓度（µg/ml）为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。每次配制新的DNS试剂需做新的标准曲线。B4.2 测定精确称取酶粉1.0g先用少量pH5.0缓冲液溶解，并用玻璃棒捣碎，将上层清液倾入适当的容量瓶中，沉渣部分再用上述缓冲液溶解，如此反复34次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度，过滤，滤液供测定用。吸光度控制在0.20.4范围内。精密量取0.2ml酶液于25ml比色管中。加入2.0ml经40水浴预热的果胶底物

20、（B2.3）并混匀，40水浴保温30min。加入3.0ml DNS试剂，混匀并放入强烈沸腾的水浴中煮沸整5分钟。迅速将比色管流水冷却终止显色反应。加10ml蒸馏水，混匀，4000rpm离心10min，上清液于540nm测定其吸光度值。酶空白：0.2ml酶液加入3.0ml DNS试剂并混匀，再加入2.0ml果胶底物，混匀，40水浴保温30min后，放入强烈沸腾的水浴中煮沸整五分钟。迅速将比色管流水冷却终止显色反应。加入10ml蒸馏水，混匀，4000rpm离心10min，上清液于540nm测定其吸光度值。B5 计算X=（W×N）÷（T×M）式中 X样品的酶活力（u/g

21、）W用回归方程计算出相当的半乳糖醛酸还原物µg数 W=（A-b）÷KN酶液的稀释倍数T反应时间30min,以1min计M样品重量（g）所得结果表示至整数。附录C（规范性附录）甘露聚糖酶酶活力测定方法C1 酶活力定义1g酶粉于40，pH5.0条件下，1min水解角豆胶生成相当于1g甘露糖还原物质，即为1个酶活力单位，以u/g表示。C2 试剂和溶液本方法中所用试剂，在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂和符合GBT 6682中规定的三级水。C2.1 pH5.00磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液A液（0.05M柠檬酸溶液）：称取10.51g柠檬酸（C6H8O7·H2O）于1000m

22、l容量瓶中，用蒸馏水溶解定容至1000ml。B液（0.1M磷酸氢二钠溶液）：称取35.81g磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）于1000ml容量瓶中，用蒸馏水溶解定容至1000ml。将A、B两液混合，用精密pH计测定其pH值，必要时用3M盐酸溶液或3M氢氧化钠溶液调节pH值为5.00。C2.2 底物0.5%（W/V）角豆胶（Sigma G0753） 将1.0g 角豆胶加入180ml pH5.0缓冲液，80搅拌5分钟。用磁搅拌器加热至沸。在一冷室内用磁搅拌器冷却整夜。用缓冲液稀释至200ml。用离心法除去未溶解部分（9000rpm，15分钟 ）。将底物液分装并冰冻。冰冻的底物可用

23、数月。使用前，熔化底物并在沸水浴中加热至80，仔细搅拌。C2.3 DNS试剂称取20.0g 3,5-二硝基水杨酸悬浮于约800ml蒸馏水中，不断搅拌下逐渐加入300ml氢氧化钠溶液（32.0g NaoH/300ml蒸馏水），同时不断搅拌，水浴加热（溶液温度不要超过48）直到溶液清澈透明。在不断搅拌下逐渐加入600g酒石酸钾钠。如需要可加热（溶液温度不要超过48）直到溶液清澈透明。用蒸馏水定容至2000ml。置深色瓶中室温存放710天后使用，如需要可用烧结玻璃过滤器过滤。有效期为6个月。DNS试剂在使用前，每100ml DNS溶液中加入0.3ml葡萄糖溶液（1.5g无水葡萄糖用蒸馏水溶解、定容至

24、100ml）。现用现配。C3 仪器、设备分析天平、变温电炉、恒温水浴锅、分光光度计、秒表。C4 分析步骤C4.1 甘露糖标准曲线的绘制5.00g甘露糖（Sigma M2069）定容于100ml去离子水中制成储备液 。从储备液制成 5.0，4.0，2.0，1.0，0.5，0.25和0mg/ml稀释液 。取0.2ml稀释液 和2.0ml缓冲液加入比色管中，再各加入DNS试剂3ml，在沸水中煮沸5min，流水冷却，加10ml蒸馏水，混匀。 在540nm处进行比色测定，用空白管溶液调零点，记录吸光度值。以甘露糖浓度（µg/ml）为横坐标，以吸光度值为纵坐标绘制曲线。每一次配置DNS试剂，都要

25、重新绘制标准曲线。C4.2 待测酶液的制备精确称取酶粉1.0g先用少量pH5.0的缓冲液溶解，并用玻璃棒捣碎，将上层清液倾入适当的容量瓶中，沉渣部分再用上述缓冲液溶解，如此反复34次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度，过滤，滤液供测定用。吸光度控制在0.20.4范围内。C4.3 测定吸取0.2ml酶液于试管中，放入40恒温水浴锅内，加入2.0ml甘露聚糖底物（经40预热），搅拌并保温30分钟。加入3ml DNS，搅拌。煮沸反应混合体5分钟。流水冷却，加10ml蒸馏水，混匀，测540nm吸光度。酶空白则为酶液加入DNS后，混匀，再加底物混匀，40保温30分钟。C5 计算X=（W×

26、;N）÷（T×M）式中 X样品的酶活力（u/g）W用回归方程计算出相当的甘露糖还原物µg数 W=（A-b）÷KN酶液的稀释倍数T反应时间30min,以1min计M样品重量（g）所得结果表示至整数。 附录D（规范性附录）纤维素酶酶活力测定方法D1 酶活力定义1g酶粉于40，pH4.8条件下，1min水解CMC生成相当于1g葡萄糖还原物质，即为1个酶活力单位，以u/g表示。D2 试剂和溶液本方法中所用试剂，在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂和符合GBT 6682中规定的三级水。D2.1 pH4.8磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液称取磷酸氢二钠(Na2HPO4

27、3;2H2O)17.56g,柠檬酸(C6H8O7·H2O)10.65g,分别用蒸馏水溶解后混合均匀定容至1000ml。用精密pH计测定其pH值，必要时用3M盐酸溶液或3M氢氧化钠溶液调节pH值为4.8。D2.2 DNS试剂 称取酒石酸钾钠182.0g，溶于500ml蒸馏水中，加热（不得超过50），依次加入3,5-二硝基水杨酸6.3g，氢氧化钠21.0g（21.0g NaoH/300ml蒸馏水），苯酚5.0g，无水亚硫酸钠5.0g，搅拌至溶液清澈透明。冷却后用蒸馏水定容至1000ml，储存于棕色瓶中，室温保存710天后使用。如需要可用烧结玻璃过滤器过滤。D2.3 10.00mg/mlC

28、MC溶液准确称量1.000g羟甲基纤维素钠(CMCNa)（中国医药公司上海化学试剂公司出品，规格300800厘泊）用适量的缓冲液溶解，移入100ml容量瓶，用上述缓冲液定容至100ml。此溶液在冰箱内贮存，有效期为一周。D2.4 1mg/ml葡萄糖标准液准确称量100mg葡萄糖（预先在105干燥至恒重）用少量蒸馏水溶解，定容至100ml。D3 分析步骤D3.1 葡萄糖标准曲线的绘制分别取1mg/ml葡萄糖标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2依次加入七支25ml比色管中，以蒸馏水补加到2.0ml，再各加入DNS试剂1.5ml，在沸水中煮沸7min，流水冷却。加蒸馏水21.5

29、ml摇匀，在550nm处进行比色测定，用空白管溶液调零点，记录吸光度值。以葡萄糖浓度（µg/ml）为横坐标，以吸光度值为纵坐标绘制曲线。每一次配置DNS试剂，都要重新绘制标准曲线。D3.2 待测酶液的制备精确称取酶粉1.0g先用少量pH4.8的缓冲液溶解，并用玻璃棒捣碎，将上层清液倾入适当的容量瓶中，沉渣部分再用上述缓冲液溶解，如此反复34次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度，过滤，滤液供测定用。吸光度控制在0.240.28范围内。D4 测定于25ml比色管中加入1ml适当稀释的酶液（每个样品三个平行）在40水浴锅中预热2min后加入1.00ml经预热的CMC溶液，计时，40

30、水浴保温30min后立即加入1.5ml DNS试剂终止反应，再置沸水中煮沸7min（样品放入重新沸腾时算起），流水冷却，加蒸馏水21.5ml摇匀。同时进行空白对照测定，于25ml比色管中加入1ml酶液，1.5ml DNS试剂，摇匀，在40水浴锅中预热2min后加入1.00ml经预热的CMC溶液，计时，4030min后立即置沸水中煮沸7min，流水冷却，加蒸馏水21.5ml摇匀。按照作标准曲线时同样的操作测定吸光度值，用回归方程计算出相应的葡萄糖含量。D5 计算X=（W×N）÷（T×M）式中 X样品的酶活力（u/g）W用回归方程计算出相当的葡萄糖还原物µg

31、数 W=（A-b）÷KN酶液的稀释倍数T反应时间30min,以1min计M样品重量（g）所得结果表示至整数。附录E（规范性附录）葡聚糖酶酶活力测定方法E1 酶活力定义1g酶粉于40，pH5.0条件下，1min水解葡聚糖生成相当于1g葡萄糖还原物质，即为1个酶活力单位，以u/g表示。E2 试剂和溶液本方法中所用试剂，在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂和符合GBT 6682中规定的三级水。E2.1 pH5.00磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液A液（0.05M柠檬酸溶液）：称取10.51g柠檬酸（C6H8O7·H2O）于1000ml容量瓶中，用蒸馏水溶解定容至1000ml。B液（0.1M磷酸氢二钠溶液）：称取35.81g磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）于1000ml容量瓶中，用蒸馏水溶解定容至1000ml。将A、B两液混合，用精密pH计测定其pH值，必要时用3M盐酸溶液或3M氢氧化钠溶液调节pH值为5.00。E2.2 DNS试剂称取酒石酸钾钠182.0g，溶于500ml蒸馏水中，加热（不得超过50），依次加入3,5-二硝基水杨酸6.3g，氢氧化钠21.0g（21.0g NaoH/300ml蒸馏水），苯酚5.0