杆状病毒表达系统介导的猪圆环病毒2型基因工程疫苗的研究

1、杆状病毒表达系统介导的猪圆环病毒2型基因工程疫苗的研究 猪圆环病毒 概述PVC2疫苗的研究进展杆状病毒表达系统 概述杆状病毒表达系统介导的猪圆环病毒2型基因工程疫苗猪圆环病毒（porcine circovirus，PCV）在分类学上属圆环病毒科圆环病毒属，为已知的最小的动物病毒之一。病毒粒子直径1417nm，呈20面体对称结构，无囊膜，含有共价闭合的单股环状负链DNA，基因组大小约为1.76kb。PCV对外界理化因子的抵抗力相当强，即便在PH3的酸性环境及72的高温环境中也能存活一段时间，氯仿作用不失活，无血凝活性。现已知PCV有两个血清型，即PCV1和PCV2。PCV1为非致病性的病毒。PC

2、V2为致病性的病毒。猪对PCV2具有较强的易感性，感染猪可自鼻液、粪便等废物中排出病毒，经口腔、呼吸道途径感染不同年龄的猪。1.1猪圆环病毒 概述根据致病性、抗原性和核酸序列的差异，将PCV分为PCV1和PCV2。PCV1无致病性，1974年由德国学者Tischer从多株连续传代的PK-15细胞中最先发现，1982年证实该病毒来源于当初制备PK-15细胞的猪肾组织。后来证实该病毒只是一种可以感染猪的常规病毒，不会对感染猪造成危害。PCV-2却具有致病性，能引起猪表现多种临床症状。PCV-1基因组全长1759bp，PCV-2全长1768 bp或1767 bp，二者序列同源性小于80%，但PCV-

3、1毒株间的核酸序列同源性大于99%，PCV-2毒株间的核序列同源性大于96%。1.2PCV的基因结构PCV-1与PCV-2都有读码框ORF1，编码病毒复制蛋白。各毒株间的ORF1编码蛋白质序列间源性大于86%，在PCV各读码框编码的蛋白质中间源性最高。现已经证实，PVC有两个主要的阅读框，ORF1和ORF2，二者在长度上都大于600 bp。ORF1是最大的阅读框，编码病毒的复制蛋白（R bp），分子最大小为37KDA，与病毒的复制转录有关。ORF2编码病毒的结构蛋白，可以与PCV-2的抗血清反应，LiuQ等研究表明，位于12-18位及34-41位的氨基酸残基对PCV2-ORF2是重要的。ORF

4、2编码蛋白（Cbp）的两个抗原表位分别位于所编码的氨基酸的69-83处和117-131处，这两处对Cbp蛋白特异的。PVC2弱毒疫苗PVC2重组疫苗PVC2核酸疫苗PVC2灭活疫苗2.1PVC2疫苗的研究进展杆状病毒是一类具有囊膜包裹的双链环状DNA病毒，其基因组大小为80-180 kb，在自然界中以节肢动物作为专一性宿主进行感染和传播。杆状病毒区别于其他病毒的一个特点是其具有两种不同的病毒粒子形态：一种为出芽型的病毒粒子（budded virus, BV），主要介导细胞与细胞之间的系统感染，入侵细胞是通过受体介导的内吞作用；另一种为包埋型的病毒粒子（Occlusion- derived vi

5、rus, ODV），在病毒的口服感染过程中，以未知的方式入侵中肠上皮细胞。3.1杆状病毒简介杆状病毒表达系统因具有完备的翻译后加工修饰系统和高效表达外源基因的能力等特点,现已成功表达了近千种高价值蛋白.随着杆状病毒载体的不断改进,该系统获得重组病毒的几率已从最初的0.1%1%提高到现在的80%90%以上,并且出现了一些新的宿主域扩大的昆虫杆状病毒栽体和高水平表达重组蛋白的昆虫细胞系.杆状病毒载体将在未来药物研发、疫苗生产、基因治疗、重组杆状病毒杀虫剂等领域得到广泛应用。3.2杆状病毒表达系统(1)基因组大，可延伸，可容纳kb甚至更大的外源基因， (2) 能感染非分裂期的细胞，(3获得病毒粒子滴

6、度高，且很稳定， (4)操作简便， (5)杆状病毒仅感染无脊椎类动物，在哺乳动物细胞中不会进行表达，因此对人畜不具有害性，用于制备疫苗安全可靠。3.3杆状病毒表达系统的优点4.1转移载体pFastBacDual-Pph-OFR2的构建4.2转移载体pFastBacDual-2OFR2的构建4.3穿梭质粒Bacmid-2ORF2的构建4.4重组杆状病毒Ac-2ORF2的制备将获得的Bacmd一2ORF2利用脂质体转染法转染Sf9细胞，在27温箱培养72h后可以看到细胞有明显的病变，细胞变大变圆，收集培养物的上清获得重组的杆状病毒Ac一2ORF2 。4.5重组杆状病毒Ac-2ORF2感染昆虫细胞的

7、表达将获得的重组杆状病毒以10MOI感染Sf9昆虫细胞。结果在Pph和Pplo双启动子的启动下，ORFZ基因可以得到高效地表达4.6重组杆状病毒Ac-2ORF2在小鼠体内诱发的免疫将获得的第四代重组杆状病毒Ac一2ORF2以10M01转染单层的昆虫细胞，吸弃上清，用PBS将细胞洗三次，用PBS重悬细胞，并同弗氏佐剂等体积混合，冻融三次，制备细胞悬液。同样将野毒制备成10.7个。Cell ml。将上面四组细胞悬液分别免疫四组4一6周龄雌性BALB/c小鼠，每只肌肉注射200ul，免疫两次，间隔三周。在第三周和第六周采血检测ELISA抗体与中和抗体。5.2结论1、利用杆状病毒表达系统制备的两种疫苗均产生较好的免疫原性，其中亚单位疫苗的抗体水平更高，免疫原性更好。2、杆状病毒表达系统制备的亚单位疫苗并不呈剂量依赖性，其中5x10“个cell/mL齐量组的免疫保护性最好。其不成剂量依