结构与性能学习教案

1、会计学1结构结构(jigu)与性能与性能第一页，共48页。 测定氨基酸顺序的意义：氨基酸顺序是决定蛋白质生物活性的分子基础氨基酸顺序将决定蛋白质的二级结构构象和三级结构；而其与三级结构之间的相互关系的分析，更揭露了控制多肽链折叠(zhdi)的一些规律如果蛋白质具有生理活性的话，氨基酸顺序的异常可能导致其功能异常和疾病氨基酸顺序指明该蛋白质的进化史第1页/共48页第二页，共48页。1 1、测定、测定(cdng)(cdng)蛋白质的一级结构的要蛋白质的一级结构的要求求第2页/共48页第三页，共48页。测定方法很多，如总氮量法，福林酚试剂法，双缩脲法，紫外吸收法等。近来已有专用的蛋白质分析仪，但经典

2、的凯氏定氮法仍是食品，饲料分析，种子鉴定及营养和生化研究中最广泛应用且具有足够精度(jn d)的方法。 蛋白质含量(hnling)测定：第3页/共48页第四页，共48页。蛋白质是一类含氮有机化合物，除含有碳、氢、氧外，还有氮和少量的硫。某些蛋白质还含有其他(qt)一些元素，主要是磷、铁、碘、碘、锌和铜等。这些元素在蛋白质中的组成百分比约为： 碳 50 氢 7 氧 23 氮 16% 硫 03 其他(qt) 微 量第4页/共48页第五页，共48页。蛋白质含量的测定： 凯氏定氮法 (测定氮的经典方法) 优点：对原料无选择性，仪器简单，方法也简单； 缺点：易将无机氮(如核酸中的氮) 都归入蛋白质中,不

3、精确。 一般，样品含氮量平均在16%，取其倒数100/16=6.25，即为蛋白质换算系数(xsh)，其含义是样品中每存在1g元素氮，就说明含有6.25g 蛋白质）。三聚氰胺（化学式：C3H6N6）第5页/共48页第六页，共48页。实验(shyn)原理 : 有机物中的氮在强热和CuSO4，浓H2SO4 作用下，消化(xiohu)生成（NH4）2SO4 反应式为： H2SO4=SO2+H2O+O R.3 NH32+mH2O 2NH3+H2SO4=(NH4)2SO4 在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放(shfng)出NH3 ，收集于 H3BO3 溶液中反应式为: 2NH4+OH-=NH3+H2O

4、NH3+H3BO3=NH4+H2BO3-再用已知浓度的HCI标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，即得蛋白质的含量反应式为： H2BO3-+H+=H3BO3第6页/共48页第七页，共48页。第7页/共48页第八页，共48页。第8页/共48页第九页，共48页。第9页/共48页第十页，共48页。-OOCCHCH2SHNH3+CH2OCClO-OOCCHCH2SNH3+OCCH2OCH2ClCH2-OOCCHCH2SNH3+ICH2CNH2OCH2CNH2O-OOCCHCH2SNH3+第10页/共48页第十一页，共48页。目前各大公司如Beckman，Perkin

5、Elmer，Waters等都有各自的自动(zdng)进样、氨基酸分析和定量报告联为一体的商品化氨基酸自动(zdng)分析仪出售。第11页/共48页第十二页，共48页。(4)分析(fnx)多肽链的N-末端和C-末端末端氨基酸的测定：N-端氨基酸和C-端氨基酸。在肽链氨基酸顺序(shnx)分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。第12页/共48页第十三页，共48页。第13页/共48页第十四页，共48页。第14页/共48页第十五页，共48页。第15页/共48页第十六页，共48页。第16页/共48页第十七页，共48页。 酶解法(ji f):胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶第17

6、页/共48页第十八页，共48页。第18页/共48页第十九页，共48页。 羟胺裂解法羟胺（NH2OH）在碱性条件下（pH 9.0）能专一性裂解-Asn-Gly-间的肽键，也能部分裂解-Asn-Leu-或-Asn-Ala-间的肽键；在酸性条件可以断裂-Asp-Pro-间的肽键，产率可达80%。 部分酸水解 一般认为酸水解没有什么专一性而被忽视，后来发现部分酸水解还是(hi shi)有一定的专一性。在稀酸的条件下，也即在高浓度胍的甲酸中（pH 2.5），可裂解-Asp-Pro-间的肽键，产率高达80%90%。在浓酸条件下，含羟基氨基酸氨基端肽键容易断裂。但是终究部分酸水解的专一性差，副反应多，此法比

7、较难掌握。第19页/共48页第二十页，共48页。NCSNHCHCOR2NCHCOR1HHNHS:CCHCOR1HNNHCHCOR2SNHCNHOCR1CHNH2CHCOR2NCOCHNHSCR1(6)测定每个肽段的氨基酸顺序(shnx)(自动序列分析仪测序)第20页/共48页第二十一页，共48页。第21页/共48页第二十二页，共48页。16肽，N端H C端S 法裂解(li ji)：QNS PS EQVE RLA HQWT 法裂解(li ji)：SEQ WTQN VERL APS HQ重叠法确定序列：HQWTQNSEQVER LAPS第22页/共48页第二十三页，共48页。一般采用胃蛋白酶处理没

8、有断开(dun ki)二硫键的多肽链；再利用双向电泳技术分离出各个肽段，用过甲酸处理后，将每个肽段进行组成及顺序分析；然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置。第23页/共48页第二十四页，共48页。蛋白质的化学修饰：是指在较温和的条件下，以可控制的方式使蛋白质蛋白质的化学修饰：是指在较温和的条件下，以可控制的方式使蛋白质与某种试剂（称化学修饰剂）起特异反应，以引起蛋白质中个别氨基酸与某种试剂（称化学修饰剂）起特异反应，以引起蛋白质中个别氨基酸侧链或功能团发生共价化学改变。侧链或功能团发生共价化学改变。 理想情况下，修饰试剂只是有选择地与某一特定的残基反应，很少或理想情况下，修饰试剂

9、只是有选择地与某一特定的残基反应，很少或几乎不引起蛋白质分子几乎不引起蛋白质分子(fnz)(fnz)的构象变化。在此基础上，从该基团的的构象变化。在此基础上，从该基团的修饰对蛋白质分子修饰对蛋白质分子(fnz)(fnz)的生物活性所造成的影响，就可以推测出被的生物活性所造成的影响，就可以推测出被修饰的残基在该蛋白质分子修饰的残基在该蛋白质分子(fnz)(fnz)中的功能。中的功能。 只有具有极性的氨基酸残基的侧链基团才能够进行化学修饰，这些基只有具有极性的氨基酸残基的侧链基团才能够进行化学修饰，这些基团的反应性取决于它们的亲核性。团的反应性取决于它们的亲核性。第24页/共48页第二十五页，共4

10、8页。(1) 探测蛋白质的必需氨基酸残基的性质和数目。蛋白质的化学修饰可以很快地揭示蛋白质分子中哪些侧链基团是表现酶活性所必需的。它可以帮助人们初步认识该蛋白质分子中哪些残基能处于活性部位并为其表现功能所必需。(2)用于蛋白质纯度分析与鉴定。(3)用于蛋白质一级序列的测定。序列分析时，首先必须了解N-末端的残基。多肽链N-末端残基的分析常用的修饰试剂有二硝基氟苯、丹氟酰氯，即二甲基氨基萘磺酰氯(DNS)和苯异硫氰酸酯(PITC)。PITC也是测定蛋白质序列的Edman降解法的关键试剂。此外，在氨基酸组成分析中的半胱氨酸残基的测定、二硫键的断裂、侧链基团的保护等均采用各种方法的化学修饰。(4)探

11、测蛋白质分子的构象变化和运动性。探测某些基因的暴露程度，以分析蛋白质分子的构象变化，如利用5,5-二硫双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)测定不同去折叠(zhdi)状态的反应巯基数目，可以探测其去折叠(zhdi)的程度，还可以通过监测A412随时间的变化探测去折叠(zhdi)的动力学。(5)利用亲和标记探测活性部位局部区域的构象状态。有些化学试剂可专一性地修饰酶的活性部位的侧链基团，从而在活性部位引入探测基团(如具有荧光性或顺磁性基团)，以探明活性部位的构象状态及构象变化。第25页/共48页第二十六页，共48页。(6)探索蛋白质和酶作用的化学机理。通过化学修饰可以探明哪些侧链基团参与了酶的催化作用

12、，为探明其作用的化学机理和催化历程起了重要的作用，也为药物设计提供了分子基础。(7)利用共价交联技术(jsh)研究蛋白质分子的拓扑学、构象的运动性以及寡聚蛋白质的亚基结合状态。(8)利用蛋白质晶体的重金属衍生物(也属于一种化学修饰)，进行X衍射晶体结构分析。(9)用于蛋白质和酶分子的固定化。在蛋白质和酶分子的固定化技术(jsh)中，除部分用物理方法固定外，主要的还是采用化学方法的固定化。其本质是蛋白质和酶的化学修饰，其中包括载体偶联法和共价交联法。这类化学修饰希望只修饰非必需基团，设法避免必需基团的破坏，以保持蛋白质和酶的活性。(10)定向改造蛋白质分子的性质。用基因定点突变技术(jsh)，改

13、变蛋白质主链的化学结构，在蛋白质的肽链结构中删去、替换或增加某些氨基酸残基，以研究其结构与功能的关系，并可定向地进行蛋白质的改造。此外，还可以通过侧链基团的化学修饰，改造蛋白质分子的性质，如使其激活、失活，或使其稳定性提高等。总之蛋白质化学修饰仍然作为一种有效的研究手段广泛地应用于基础性研究和应用研究。第26页/共48页第二十七页，共48页。试剂试剂(shj)(shj)特点：含有特点：含有 结构，作用于侧链基团上的亲核基团，使之酰基化。结构，作用于侧链基团上的亲核基团，使之酰基化。可作用基团：氨基，巯基，醇羟基（可作用基团：氨基，巯基，醇羟基（SerSer、ThrThr），酚羟基（），酚羟基（

14、TyrTyr）。）。修饰剂：如乙酰咪唑、二异丙基磷酰氟、酸酐磺酰氯、硫代三氟乙酸乙酯和修饰剂：如乙酰咪唑、二异丙基磷酰氟、酸酐磺酰氯、硫代三氟乙酸乙酯和O-O-甲基异脲甲基异脲等。等。 在室温在室温(20(2025)25)，pH 4.5pH 4.59.09.0的条件下。的条件下。2 2、化学修饰的种类、化学修饰的种类(zhngli)(zhngli)乙酰咪唑OR-C-X第27页/共48页第二十八页，共48页。试剂特点：烷基上带活泼卤素，导致蛋白质分子的亲核基团（如试剂特点：烷基上带活泼卤素，导致蛋白质分子的亲核基团（如NH2NH2，-SH-SH，-COOH-COOH等）等）发生发生(fshng)

15、(fshng)烷基化。烷基化。可作用基团：氨基（可作用基团：氨基（LysLys，ArgArg），巯基（），巯基（CysCys），羧基（），羧基（AspAsp、GluGlu），甲硫基（），甲硫基（MetMet），），咪唑基（咪唑基（HisHis）。）。修饰剂：修饰剂：2 2，4 4二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺等。二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺等。 2,4-二硝基(xio j)氟苯碘代乙酸第28页/共48页第二十九页，共48页。试剂特点：具有试剂特点：具有(jyu)氧化性或还原性。氧化性或还原性。氧化剂：氧化剂：H2O2 ，N-溴代琥珀酰亚胺溴代琥珀酰亚胺可被氧化的侧链基团：巯基，甲硫基，吲哚基（色

16、氨酸可被氧化的侧链基团：巯基，甲硫基，吲哚基（色氨酸Trp）、咪唑基，酚）、咪唑基，酚基等。基等。还原剂：还原剂：2巯基乙醇、巯基乙醇、DTT等。等。可被还原的侧链基团：二硫键。可被还原的侧链基团：二硫键。连四硫酸盐氧化连四硫酸盐氧化(ynghu)巯基，巯基，DTT还原逆回，用于保护巯基还原逆回，用于保护巯基第29页/共48页第三十页，共48页。酚羟基在酚羟基在3和和5位上很容易发生亲电取代的碘化和硝化反应位上很容易发生亲电取代的碘化和硝化反应(fnyng)试剂：卤（碘）化，硝化试剂。试剂：卤（碘）化，硝化试剂。碘代：碘代： I2 + HI 硝化：硝化： (NO2)4C + +(NO2)3CH

17、 （四硝基甲烷）（四硝基甲烷）四硝基甲烷(TNM) 作用于酪氨酸的酚羟基，形成3-硝基酪氨酸的衍生物。这种产物(chnw)有特殊的光谱，可用于直接的定量测定。第30页/共48页第三十一页，共48页。另外还有一些蛋白质与化学试剂的重要反应，如溴化氰裂解，在自发(zf)和诱导重排的条件下主要导致肽键的断裂。溴化氰(CNBr)裂解甲硫氨酸残基的羧基侧链肽键的反应机理如下图所示：第31页/共48页第三十二页，共48页。第32页/共48页第三十三页，共48页。3 3、特定、特定(tdng)(tdng)氨基酸残基侧链基团的化学氨基酸残基侧链基团的化学修饰修饰1) 1) 氨基的化学修饰：氨基的化学修饰：来源

18、：来源：Lys, Arg, His, GlnLys, Arg, His, Gln修饰反应修饰反应(fnyng)(fnyng)：酰基化与烷基化：酰基化与烷基化酰基化修饰剂酰基化修饰剂: : 三硝基苯磺酸（三硝基苯磺酸（TNBSTNBS）、丹磺酰氯（）、丹磺酰氯（DNSDNS）烷基化修饰剂：烷基化修饰剂：2 2，4 4二硝基氟苯（二硝基氟苯（DNFBDNFB）、碘乙酸、碘乙酰胺、亚硝酸等）、碘乙酸、碘乙酰胺、亚硝酸等第33页/共48页第三十四页，共48页。 2) 2) 羧基的化学修饰羧基的化学修饰修饰羧基的反应专一性较差。修饰羧基的反应专一性较差。常用水溶性碳化二亚胺（常用水溶性碳化二亚胺（EDC

19、EDC）修饰天冬氨酸和谷氨酸。可定量测定酶分子）修饰天冬氨酸和谷氨酸。可定量测定酶分子(fnz)(fnz)中羧基的数目。中羧基的数目。 + + 水溶性碳化二亚胺水溶性碳化二亚胺第34页/共48页第三十五页，共48页。化学(huxu)接枝EDCHCl与丝素蛋白分子侧链上的-COOH发生反应(fnyng)，形成氨基反应(fnyng)活性的O-酰基脲中间体，N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的加入将该中间体转化为具有氨基反应(fnyng)活性的NHS酯，它能够与抗菌肽分子（图中p）上的-NH2发生反应(fnyng)，通过酰胺键形成这两种化合物的键合物。第35页/共48页第三十六页，共48页。3)3)胍基的

20、化学修饰胍基的化学修饰来源：来源：ArgArg修饰反应修饰反应(fnyng)(fnyng)：本质上是羰基对氨基酰基化。：本质上是羰基对氨基酰基化。修饰剂：修饰剂： 丁二酮丁二酮 二羰基化合物二羰基化合物 1 1，2 2环己二酮环己二酮 苯乙二醛苯乙二醛H2NCHCCH2OHOCH2CH2NHCNH2NH精氨酸（精氨酸（ - -氨基氨基(nj)-(nj)- - -胍基戊酸）胍基戊酸）第36页/共48页第三十七页，共48页。4)4)巯基的化学修饰巯基的化学修饰(xish)(xish) 来源：来源：CysCys 修饰修饰(xish)(xish)反应反应: :烷基化烷基化 修饰修饰(xish)(xis

21、h)剂：碘乙酸剂：碘乙酸(IAA) (IAA) 碘乙酰胺碘乙酰胺(IAM) (IAM) E-SH + R-X E-SH + R-X E-SR +HX E-SR +HXN-N-乙基马来酰亚胺（乙基马来酰亚胺（NEMNEM）（常用的专一修饰）（常用的专一修饰(xish)(xish)巯基试剂）巯基试剂）E ESH SH 第37页/共48页第三十八页，共48页。5) 5) 二硫键的化学修饰二硫键的化学修饰还原还原(hun yun)(hun yun)：巯基乙醇、二硫：巯基乙醇、二硫苏糖醇（苏糖醇（DTTDTT）第38页/共48页第三十九页，共48页。氧化氧化(ynghu)(ynghu)：过甲酸：过甲酸:

22、 : Performic acidPerformic acid第39页/共48页第四十页，共48页。 6) 6)咪唑基的化学修饰咪唑基的化学修饰 来源：来源：HisHis 修饰反应修饰反应: :酰基化与烷基化酰基化与烷基化 酰基化修饰剂酰基化修饰剂: : 常用焦碳酸常用焦碳酸(tn sun)(tn sun)二乙酯（二乙酯（diethyl paracarbonatediethyl paracarbonate） + + + C2H5OH +CO2+ C2H5OH +CO2 烷基化修饰剂：碘乙酸烷基化修饰剂：碘乙酸 + ICH2COOH + HI第40页/共48页第四十一页，共48页。7 7）酚羟基

23、的化学修饰）酚羟基的化学修饰来源：来源：TyrTyr修饰反应修饰反应(fnyng)(fnyng)：芳香环取代反应：芳香环取代反应(fnyng)(fnyng)修饰剂：碘、硝化试剂（四硝基甲烷）修饰剂：碘、硝化试剂（四硝基甲烷）第41页/共48页第四十二页，共48页。8 8）吲哚基的化学修饰）吲哚基的化学修饰(xish)(xish) 来源：来源：TrpTrp 修饰修饰(xish)(xish)反应：氧化反应反应：氧化反应 修饰修饰(xish)(xish)剂：剂： N- N-溴代琥珀溴代琥珀酰亚胺酰亚胺第42页/共48页第四十三页，共48页。氨基酸氨基酸侧链基团侧链基团修饰剂修饰剂LysLys氨基氨基

24、三硝基苯磺酸，三硝基苯磺酸，2 2，4 4二硝基氟苯、碘乙二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亚硝酸酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亚硝酸AspAsp、GluGlu羧基羧基水溶性碳化二亚胺水溶性碳化二亚胺ArgArg胍基胍基苯乙二醛，苯乙二醛，1,21,2环己二酮、丁二酮环己二酮、丁二酮CysCys巯基巯基碘乙酸、碘乙酰胺、碘乙酸、碘乙酰胺、N-N-乙基马来酰亚胺乙基马来酰亚胺二硫键二硫键巯基乙醇、巯基乙醇、DTTDTTHisHis咪唑基咪唑基焦碳酸二乙酯、碘乙酸焦碳酸二乙酯、碘乙酸TyrTyr酚羟基酚羟基碘、四硝基甲烷碘、四硝基甲烷TrpTrp吲哚基吲哚基N-N-溴代琥珀酰亚胺溴代琥珀酰亚胺 各种各种( zhn)( zhn)氨基酸侧链氨基酸侧链的修饰剂的修饰剂第43页/共48页第四十四页，共48页。 但解释修饰效果须十分小心，因为：但解释修饰效果须十分小心，因为：任何一种修饰剂不是绝对专一的。任何一种修饰剂不是绝对专一的。有些有