酵母单杂交技术

1、. .酵母单杂交(yeast one hybrid)技术(2021-03-23 05:24:00)标签： 酵母单杂交 gal4蛋白 酵母双杂交技术 报告基因 文化分类： 分子生物学专业酵母单杂交(yeast one hybrid)技术，是体外分析DNA与细胞内蛋白质相互作用的一种方法，通过对酵母细胞内报告基因表达状况的分析，来鉴别DNA结合位点并发现潜在的结合蛋白基因，或对DNA结合位点进展分析。运用此技术，能筛选到与DNA结合的蛋白质，并可直接从基因文库中得到编码该蛋白质的核苷酸序列，而无需复杂的蛋白质别离纯化操

2、作，故在蛋白研究中，具有一定的优势；而且，酵母属真核细胞，通过酵母系统得到的结果，比其他体外技术获得的结果，更能表达真核细胞内基因表达调控的真实情况。1 酵母单杂交技术的原理酵母单杂交技术，最早是1993年由Liet al从酵母双杂交技术开展而来，酵母双杂交技术通过对报告基因的表型进展检测以实现对蛋白质间相互作用的研究，而酵母单杂交技术那么通过对报告基因的表型检测，分析DNA、蛋白之间的相互作用，以研究真核细胞内的基因表达调控。目前认为真核生物的转录起始，需要转录因子的参与。这些转录因子通常由一个DNA特异性结合功能域和一个或多个与其他调控蛋白相互作用的激活功能域组成，即DNA结合构造域(DN

3、A-binding domain, BD)和转录激活构造域(activation domain, AD)。用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白即是一种典型的转录因子。研究说明GAL4的DNA结合构造域，靠近羧基端,含有几个锌指构造,可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS);而转录激活构造域，可与RNA聚合酶或转录因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。在这一过程中，DNA结合构造域和转录激活构造域可完全独立地发挥作用。据此，我们可将GAL4的DNA结合构造域置换为其他蛋白，只要它能与我们想要了解的目的基因相互作用，就照样可以通过其转录激活构造域激活RNA聚合酶，从而启动对下游报告基

4、因的转录。正是基于这一理论，酵母单杂交系统由2局部组成：(1)将文库蛋白片段，与GAL4转录激活域融合表达的cDNA文库质粒；(2)含有目的基因和下游报告基因的报告质粒。在实验中,首先将报告质粒整合入酵母基因组,产生带有目的基因的酵母报告株;再将文库质粒转化入报告株;假设存在文库蛋白与目的基因的相互作用,可通过对报告基因的表达，将文库蛋白的基因筛选出来.2 酵母单杂交技术的应用酵母单杂交技术是建立在许多真核转录因子在构造和功能上，是由独立的DNA结合构造域和DNA激活构造域组成的根底上，这使得研究者可以构建不同的基因融合体，在酵母中表达融合蛋白，以同时结合特异的目的基因和激活转录。理论上，在酵

5、母单杂交技术中，任何目的基因都可捕获能与目标因子特异结合的蛋白。目前,酵母单杂交技术的应用可以归纳为以下二类:2.1 鉴别DNA结合位点，并发现潜在的结合蛋白基因目前对于酵母单杂交技术的应用主要表达在这些方面。Chewet al应用酵母单杂交技术证实了在大鼠脑中存在的COUP-TF、EAR2和NURR1等蛋白质，是GRIK5基因的内含子结合蛋白，从而进一步验证了多种核孤儿受体，可通过与内含子序列结合，发挥其调控神经递质受体基因作用的假设。Weiet al1999年运用此技术，确定了特异性结合于海胆胚胎孵化酶(SpHE)基因调控区域的反式激活因子SpEst4。Siewekeet al运用酵母单杂

6、交技术对转录辅助因子进展了筛选。Huanget al为别离与人-珠蛋白基因上游沉默子片段相互作用的蛋白，运用酵母单杂交技术，利用人肝cDNA文库进展筛选，得到能与其结合的蛋白RPL3(ribosomal protein L3),并通过电泳迁移率变动实验(EMSA)和竞争抑制实验，证实其确有结合该沉默子活性,进而说明RPL3通过与人-珠蛋白基因上游沉默子结合，在胚胎阶段的沉默人-珠蛋白基因表达中扮演了重要角色。Liaoet al于2002年运用酵母单杂交技术筛选出了能与大鼠谷胱甘肽S-转移酶(GST) P增强子GPE核心序列相互作用的转录因子，经对2个阳性克隆pYGPE1和pYGPE2的鉴定，发

7、现pYGPE1的插入片段与大鼠原癌基因c-juncDNA具有99 %同源性，其编码的氨基酸残基序列与大鼠c-jun蛋白具有100 %同源性，pYGPE2的插入片段与大鼠线粒体腺苷酸转位酶cDNA具有99 %同源性,其编码的氨基酸序列与大鼠腺苷酸转位酶具有100 %同源性，并由此得出结论，c-jun蛋白和线粒体腺苷酸转位酶，可能是作用于GPE的反式激活因子.2.2 对DNA结合构造域进展分析如果能得到DNA结合构造域的构造信息,就可以用酵母单杂交技术对该构造进展分析。 早在1993年，就有人用酵母单杂交技术，对2个不同的锌指蛋白的DNA结合构造域进展了分析。Lisowskyet al在1999年

8、使用酵母单杂交技术，利用一个“GC富集区序列筛选出一种新的具有转录激活活性的锌指蛋白，由于其结合的序列富含“GC，故命名为GC-box 结合蛋白。Maket al运用此技术测试哺乳动物具有根本的螺旋-环-螺旋(bHLH)构造的转录因子,通过对肌调节因子4(MRF4)的研究，证实其具有转录活性，并进一步证明运用酵母单杂交技术，能在哺乳动物cDNA文库中筛选出与E-box DNA相互作用的新的bHLH蛋白。Nishiyamaet al运用酵母单杂交技术并结合点突变方法对转录活性片段Elf-1进展分析，确定具有转录活性的区域位于第87-175碱基区。3 存在问题及解决方法3.1在鉴别DNA结合位点中

9、存在的缺陷由于细胞技术的先天局限性,即影响因子多，因此，可能有内源性的酵母表达激活物与DNA结合位点结合,并激活报告基因的表达，那么相应的目的基因片段可能因此而被漏检。这个问题在试图鉴定某基因组中所有的DNA结合位点时，就会暴露出来。此缺陷的补救，需要一个更加随机的文库。例如，可以用含有更多的已突变的片段构建一个随机剪切的DNA片段库。另一个比较关心的问题，就是此技术的检测灵敏度，有报道显示此系统对于HIS3基因表达是非常灵敏的，即使是很弱的、甚或非特异性的相互作用都能被检测到，这些非特异的相互作用可通过其他技术防止，但这也可能导致此方法灵敏度的过度下降。3.2在DNA结合构造域分析中存在的缺

10、陷用酵母单杂交技术分析突变导致DNA结合构造域改变的局限，在于此方法的灵敏度依靠DNA结合构造域功能选择,只有当突变影响了DNA结合构造域的功能时,才能被发现。 改进的方法，是在培养基中选择适宜的半乳糖浓度，以减少杂交激活子的激活活性，或用不同的阴性对照等方法。总之,随着生物化学及分子生物学技术的不断开展，越来越多的大分子间相互作用被人们所认识，这将有助于人们说明生物体内各种生物学过程的发生情况，并可能由此发现新的基因工程药物。酵母单杂交技术作为一种研究生物大分子间的相互作用的体外、细胞内技术，从1993年开展至今，已有近20 年时间，虽然有关的报道不是很多，但在生物学研究领域，特别是在研究D

11、NA-蛋白质相互作用方面他还是显示出了巨大的应用潜力，而且，由酵母单杂交技术衍生出的反向单杂交技术及单-双杂交技术更是拓宽了其应用范围。运用酵母单杂交技术，不但可以验证许多的DNA-蛋白质间相互作用，而且可以发现新的DNA-蛋白质间相互作用，并由此发现新的基因.相信随着酵母单杂交技术的不断开展和完善，必将在科研、临床及生产中得到更加广泛的应用.DNA-蛋白质之间的相互作用参与许多生物学过程，如基因转录和复制的调控等，其作用异常可导致疾病的发生。对于DNA与蛋白质间相互作用的研究，传统的方法是采用生物化学技术克隆出结合于DNA上的蛋白质基因。如以DNA亲和层析法纯化与特定DNA序列结合的蛋白质，

12、然后从已纯化的蛋白质基因序列中获得探针再进展cDNA 克隆；另一种方法是采用放射性标记的DNA或RNA作为探针筛选表达型文库，进而获得感兴趣的蛋白质的基因序列；也可采用噬菌体表型在体外鉴定结合于RNA的蛋白。尽管采用这些方法已经成功地克隆了许多基因，但体外条件使它们的应用受到了局限。此外，由于影响待检测的相互作用的各种条件十分复杂，实验过程中必须对各种条件进展仔细地调整。酵母单杂交体系yeast one-hybrid system为解决上述方法的局限性提供了新的途径。酵母单杂交体系是一种识别稳定结合于DNA上蛋白质的强有力的方法，其突出特点是可在酵母细胞内研究真核细胞DNA-蛋白质之间的相互作

13、用，并通过筛选DNA文库直接得到与靶序列相互作用的蛋白质基因序列。酵母单杂交体系的原理酵母单杂交体系是从酵母双杂交体系开展而来的。酵母双杂交体系是一种以酵母的遗传学分析为根底、研究蛋白质-蛋白质之间相互作用的实验体系。该体系的建立是根据下述原理：酵母转录因子主要是Gal4p的DNA结合功能区BD和转录激活功能区AD在物理上和功能上均分别处于相对独立的构造域中，因此，在酵母中表达的两个相互作用的蛋白质分别与转录因子的DNA结合构造域和转录激活构造域相融合，形成两个杂交体，即BD-X和AD-Y。单独的BD-X或AD-Y都不能启动下游报告基因的转录，但BD-X与AD-Y相互作用可以重新形成有功能的转

14、录因子，从而激活含有BD结合位点的启动子下游报告基因的表达。如果在表达性基因文库中存在AD-Y，那么用BD-X可直接从该文库中筛选出与之相互作用的AD-Y基因序列。在酵母单杂交体系中，省略了在酵母双杂交体系中采用的BD-X蛋白质杂交体，而用特异的DNA序列取代DNA Gal4p结合位点，该DNA序列在相关生物系统中是重要的蛋白质结合位点。靶DNA序列特异的结合蛋白BDPX与Gal4p的激活构造域可融合形成融合体，BDPX与其特异DNA结合位点之间通过相互作用可激活作为表型选择性标志的报告基因的表达。理论上，酵母单杂交体系可利用靶DNA序列，捕获具有与该元件特异结合的构造域的蛋白质。该体系不仅适

15、用于识别转录因子，也适用于研究参与转录抑制和DNA复制过程的蛋白质。酵母单杂交体系的实现方法国内外已经报道了一些酵母单杂交体系的具体实现方法。各种方法的区别在于所选用报告基因的差异，例如，选用HIS3还是LacZ作为筛选标志，报告基因是位于质粒上还是整合于染色体上等。具体实现方法的根本流程如下：构建含靶结合序列的报告载体转化酵母细胞检测根底报告表达筛选AD融合文库排除假阳性筛选出阳性克隆扩增阳性克隆，以证实DNA-蛋白质结合活性进一步分析首先识别的DNA结合位点，并尽可能准确地定位DNA的结合位点，然后将其插入报告基因启动子的上游。将此构建体引入酵母细胞，检测报告基因的根底转录活性。其余的步骤

16、与酵母双杂交体系一样。两种由酵母单杂交体系衍生的技术1反向单杂交体系：尽管多种遗传学方法可识别DNA-蛋白质之间的相互作用，但至今尚未见到任何一种可识别使DNA-蛋白相互作用发生解离的分子或突变的遗传学体系。而反向单杂交系统那么具有上述功能。该体系的建立是根据以下两个根本条件：1在特定生长条件下，报告基因的表达产生对酵母生长有害的物质。2转录因子的等位基因的组成形式严格地调控报告基因的表达。在这种条件下，酵母菌株中表达的BDPX融合蛋白具有毒性负性选择，但由于DNA-蛋白质之间相互作用的消失，为酵母菌的生长提供了选择性生长优势。因此，通过酵母菌株的生长状况，即能识别BDPX与结合位点之间是否存

17、在相互作用。应用反向单杂交体系已验证了以往用其他方法发现的DNA-蛋白相互作用的解离。Brachmann等应用反向单杂交技术研究了p53编码区的突变，发现恶性肿瘤患者的p53基因存在等位基因的潜在突变。反向单杂交技术不仅能有效地分析阻碍DNA-蛋白质相互作用的因素，如突变体等；而且还可以从大的文库中特异地筛选出突变体。同时，还可应用这种遗传体系识别阻碍与大分子相互作用的其它的反式作用因子。2单-双杂交体系：酵母cDNA文库筛选过程中，由于DNA与蛋白质的非特异结合可出现假阳性克隆。由多个蛋白质组成的复合物往往参与基因启动子的转录调控过程，例如，在凝胶阻滞实验中常发现蛋白质复合物结合在一个或多个

18、调控元件上。这些复合物中的转录因子既能结合于启动子内特异的DNA序列上，又能与同一复合物中其它的转录因子相互作用。因此，如果DNA结合序列以及与DNA序列相互作用的转录因子均为的，那么，就可以应用一种新的酵母cDNA文库筛选体系，即酵母单-双杂交体系克隆新的转录因子。该体系既融合了酵母单杂交和双杂交体系的原理，又同时应用DNA-蛋白质以及蛋白质-蛋白质之间的两种相互作用筛选cDNA文库。因此采用酵母单-双杂交体系筛选文库能有效地减少假阳性克隆的出现，提高实验的严谨性。这是该体系优越于酵母单杂交体系和酵母双杂交体系的主要方面。但在应用酵母单-双杂交体系筛选文库时，必须事先DNA结合位点的序列以及

19、与待研究的蛋白质发生相互作用的蛋白质伴侣。酵母单杂交体系在研究DNA结合蛋白质中的应用目前，在研究DNA-蛋白质相互作用中，酵母单杂交体系主要有以下3种用途：1确定DNA-蛋白质之间是否存在相互作用；2别离编码结合于目的顺式调控元件或其他短DNA结合位点蛋白的新基因；3定位已经证实的具有相互作用的DNA结合蛋白的DNA结合构造域以及准确定位与DNA结合的核苷酸序列。迄今为止，应用酵母单杂交体系已经识别并验证了许多与目的DNA序列结合的蛋白质。Wei等采用酵母单杂交体系确定了特异性结合于海胆胚胎孵化酶(SpHE) 基因调控区域的反式激活因子SpEst4。Chew等的研究也证实了在大鼠脑中存在的COUP-TFI、EAR2和NURR1等蛋白质是GRIK5基因的内含子结合蛋白，从而进一步证实了多种核孤儿受体通过与内含子序列结合发挥其调控神经递质受体基因作用的假设。同时单杂交技术还被应用于识别金属反响结合因子。正向与反向单杂交体系的