食品安全及微生物检测技术

1、食品安全及微生物检测技术食品安全及微生物检测技术 Foodmate 2004/11/17Http:/几个问题：一、食品安全和控制二、微生物基础知识三、微生物检测的基本技术四、培养基制作及原理、现象五、常见生化反应，血清学反应六、新的仪器和方法七、食品技术网络交流Http:/1.1 食物、食品与食品工业1.2 食品安全和技术壁垒1.3 食品安全事件和食品危害物1.4 三个阶段：食品安全管理一、食品安全和控制Http:/食物是人体生长发育、更新细胞、修补组织、调节机能必不可少的营养物质，也是产生热量保持体温、进行体力活动的能量来源。食品经过加工制作的食物统称为食品 分类：食品分类的方法很多，可以按

2、保藏方法分、按原料种类分、按原料和加工方法分、按产品特点分。按保藏方法分类按保藏方法分类dehydrated garlic flake干藏类干藏类芋籽芋籽冷冻类冷冻类Canned Mushroom罐头类罐头类黄瓜黄瓜腌渍类腌渍类辐射制品辐射制品发酵制品发酵制品烟熏制品烟熏制品按原料种类分按原料种类分果蔬制品果蔬制品肉禽制品肉禽制品乳制品乳制品谷物制品谷物制品水产制品水产制品按加工方法分按加工方法分焙烤制品焙烤制品饮料饮料糖果糖果罐头制品罐头制品挤压制品挤压制品速冻制品（绿芦笋）速冻制品（绿芦笋）干制品干制品发酵制品发酵制品按产品特点分按产品特点分方便食品方便食品疗效食品疗效食品婴儿食品婴儿食品

3、工程食品工程食品（模拟食品）（模拟食品）快餐食品快餐食品休闲食品休闲食品功能食品功能食品（保健食品）（保健食品）l外观l风味l营养l卫生和要求l货架寿命l方便l功能性质l广义上讲，食品工业无论从哪个角度都是各个国家国民经济的基础或支柱之一。广义食品工业包括农业、食品制造、市场三个方面l整体而言，食品工业也是一个永不衰弱的行业，是一个非常稳定的行业，更是一个充满变化、有活力的行业l由于食品工业是国民经济的重要支柱产业和关系国计民生及关联农业、工业、流通等领域的大产业，因此，食品工业现代化水平是反映人民生活质量及国家文明程度的重要标志。l作为农产品面向市场的主要后续加工产业，食品工业在农产品加工中

4、占有最大比重，对推动农业产业化作用巨大。l1999年全世界食品工业的销售额为2.7万亿美元，居各行业之首。l我国2000年食品工业总产值、利税分别为8434.1亿元和1458.3亿元，占全国工业总产值、利税的9.8%和15.3%；年出口创汇136.7亿美元。l食品工业企业达19316个，就业人数达403.7万，占全国工业企业就业总人数的7.3%。l食品工业是整个工业中为国家提供积累和吸纳城乡就业人数最多、与农业关联度最强的产业。1.2 食品安全及技术壁垒食品安全及技术壁垒食品量的安全(Food security) 对经济学家来说， 食品安全通常被定义为有足够的收入购买必要的食品 在中国, 食品

5、安全较多地被定义为食品（或是更常见的是粮食）的自给自足。强调自给自足反映了当时合理的考虑: 历史上饱受饥荒之苦; 人口众多；中国的食品供应绝大多数依靠国内生产 以前担心缺乏外汇进口食品，现在无此必要。另外，中国也曾有过国外对中国实施贸易禁运的担忧; 但食品禁运很难实行。 吃饱的问题 民以食为天 深挖洞，广积粮，缓称王。 联产承包。要吃粮，找紫阳，要吃米，找万里。质的安全(Food safety)WTO贸易技术壁垒（TBT）协定规定:“在涉及国家安全问题、防止欺骗行为、保护人类健康和安全、保护生命和健康以及保护环境等情况下，允许各成员方实施与国际标准、导则或建议不尽一致的技术法规、标准和合格评定

6、程序”国际贸易：技术壁垒影响农业和食品工业竞争力非关税非关税措措 施施数量限制措施数量限制措施 贸易壁贸易壁垒措施垒措施关税措施关税措施技术贸易技术贸易壁垒措施壁垒措施TBT壁垒措施壁垒措施SPS壁垒措施壁垒措施GBs(ETBs） IT壁垒措施壁垒措施包装和标签要求包装和标签要求 原产地地理标识原产地地理标识计量单位制国际单位计量单位制国际单位(SI)(SI)制与英制，制与英制， 技术性贸易壁垒的含义技术性贸易壁垒的含义 技术性贸易壁垒技术性贸易壁垒: :系指在贸易领域采取的、系指在贸易领域采取的、对正常贸易起阻碍作用的所有技术性措对正常贸易起阻碍作用的所有技术性措施，主要表现为施，主要表现为

7、TBTTBT协协定定和和SPSSPS协协定定管辖的技术性贸易壁垒措施管辖的技术性贸易壁垒措施 TBT： Agreement on Technical Barriers to Trade 技术性贸易壁垒协定技术性贸易壁垒协定 SPS ：Agreement on the Applications of Sanitary and Phytosanitary Measures 实施卫生与植物卫生措施协定实施卫生与植物卫生措施协定 TBT协定协定涵盖涵盖所有产品，包括所有产品，包括工业品和农产品工业品和农产品（TBT第第1.31.3条）条） TBT协定协定不适用于不适用于SPS协定附件协定附件A A定义

8、的定义的SPS措施措施（TBT第第1.51.5条）条） 凡不属凡不属SPS协协定定管辖的，均属管辖的，均属TBT协协定定管辖管辖 （SPS第第1.41.4条）条） 技术法规技术法规（附件（附件1 1第第1 1条）条） 标准标准（附件（附件1 1第第2 2条）条） 合格评定程序合格评定程序（附件（附件1 1第第3 3条）条）技术法规技术法规强制性要求标准标准自愿性要求技术要求技术要求 用于描述产品特征或相关工艺和生产用于描述产品特征或相关工艺和生产方法、服务或材料的一系列特征或数方法、服务或材料的一系列特征或数量要求。这些特征涉及的内容可以包量要求。这些特征涉及的内容可以包括大小、尺寸、重量、功

9、能等。括大小、尺寸、重量、功能等。 合格评定程序：合格评定程序：任何直接或间接用以确定任何直接或间接用以确定某一产品是否满足技术法规或标准中的相某一产品是否满足技术法规或标准中的相关要求的程序。关要求的程序。 合格评定程序包括：合格评定程序包括：抽样、检验和检查；抽样、检验和检查；评估、验证和合格保证；注册、认可和批评估、验证和合格保证；注册、认可和批准以及各项的组合。准以及各项的组合。由食品、饮料、饲料中的添加剂、污染物由食品、饮料、饲料中的添加剂、污染物、毒素、致病有机体造成的风险、毒素、致病有机体造成的风险;因虫害的传入、定居或传播所造成的损害因虫害的传入、定居或传播所造成的损害国家国家

10、人类生命人类生命 植物或动物携带的病害造成的风险植物或动物携带的病害造成的风险;人类或动物生命人类或动物生命 保护保护:免遭免遭 :动物或植物生命动物或植物生命虫害、病害、致病有机体造成的风险虫害、病害、致病有机体造成的风险; 产品标准产品标准 检疫措施检疫措施 加工要求加工要求 认证认证 检验检验 测试测试 健康健康标签标签所有具有上述所有具有上述SPSSPS目的的措施，包括目的的措施，包括: :化学危害：生物毒素、农药残留、兽药残留、食品添加剂、重金属物理危害：玻璃、金属异物等1.3 食品危害物食品危害物生物危害：微生物、寄生虫危害（Hazard）： 指存在于食品中的具有潜在损害的生物、化

11、学和物理因子。瘦肉精 毒大米蔬菜农残.食品安全问题食品安全问题大肠杆菌大肠杆菌 O157:H7吊白块吊白块疯牛病疯牛病二恶英二恶英阜阳奶粉事件毛发水酱油三无产品： 无商标、无生产日期、无生产地址 无毒 无害 无营养微生物危害微生物危害美国，每年约有7200万人发生食源性疾病，造成3500亿美元的损失2001年，江苏、安徽等地，肠出血性大肠杆菌O157:H7，造成177人死亡，中毒人数超过2万人1999年，宁夏，沙门氏菌污染肉品，食物中毒暴发，发病人数上千人80年代，上海，毛蚶，甲型肝炎爆发，累及30万人0500010000150002000025000300003500040000450001

12、9801982198419861988199019921994空肠弯曲菌空肠弯曲菌沙门氏菌沙门氏菌0 02000200040004000600060008000800010000100001200012000140001400019841984198519851986198619871987198819881989198919901990199119911992199219931993199419941995199519961996摘自：摘自：NNDSS（国际疾病监督系统）（国际疾病监督系统）空肠弯曲菌空肠弯曲菌沙门氏菌沙门氏菌0 0202040406060808010010012012014

13、014019851985198719871989198919911991199319931995199519971997发生率发生率 (例例/100000)英格兰&威尔士英格兰&威尔士丹麦丹麦瑞士瑞士以色列以色列冰岛冰岛芬兰芬兰瑞典瑞典挪威挪威 斯洛伐克 斯洛伐克苏格兰苏格兰沙门氏菌（禽、畜肉）沙门氏菌（禽、畜肉）副溶血性弧菌（水产品）副溶血性弧菌（水产品）蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌（剩饭）蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌（剩饭）肉毒梭菌（发酵制品、肉制品）肉毒梭菌（发酵制品、肉制品）单核细胞增生李斯特菌（乳制品、冷藏食品）单核细胞增生李斯特菌（乳制品、冷藏食品）大肠杆菌大肠杆菌

14、O157:H7（肉制品）等。（肉制品）等。我国微生物性食物中毒常见的致病菌和食物：我国微生物性食物中毒常见的致病菌和食物：全国食品污染物监测网全国食品污染物监测网食源性致病菌主动监测食源性致病菌主动监测四年结果统计分析（2000、2001、2002、2003）1 1 61611 1 45457 700000 035356 61818232350502003年年2.062.061.71.70 0冰激凌冰激凌11.6711.678.578.57蔬菜蔬菜83.880 0水产品水产品0.750.750.590.590.220.22生奶生奶82.982.272.2

15、7熟肉熟肉18.318.312.9612.969.569.56生肉生肉20022002年年20012001年年20002000年年05101520252000200120022003生肉熟肉生奶水产品蔬菜冰激凌13.820.417.424.602003年年9.765.505.503.61总阳性率总阳性率0.520.820.61O157:H75.761.290.96单核细胞增生单核细胞增生李斯特氏菌李斯特氏菌3.593.42.23沙门氏菌沙门氏菌20022002年年20012001年年20002000年年02468101214162000200120022003沙门氏菌单核细胞增生O157:H7

16、总阳性率连续监测对食源性致病菌暴发流行有预警意义。大肠肝菌O157:H7在 局部流行区与非流行区阳性率与毒力不同。连续四年的监测数据显示三种致病菌对食品的污染普遍存在，污染最为严重的为肉与肉制品、水产品 。大肠肝菌O157:H7的污染率变化不大，沙门氏菌、李斯特氏菌的污染率持续增长根据WHO估计：发达国家食源性疾病的漏报率在90%以上发展中国家食源性疾病的漏报率95%以上“冰山一角冰山一角”l安全卫生惯例，行为规范（Practices） 着重生产及加工的整体卫生l危害分析和控制（HACCP） 着重食品中的病原、危害控制l风险评估，风险分析（Risk analysis）着重整个食品链三次浪潮：惯

17、例、危害、风险行为规范行为规范 GHP; GMP; SSOP; The WHO Golden Rules for Safe Food Preparation; The WHO Five keys to safer food;Five keys to safer food; USDA/FDA Four steps to Food safety. USDA/FDA Four steps to Food safety.lGHP是遵循国际食品法典委员会制定的食品卫生通则而建立的规范 ;l国际食品法典委员会（CAC）于1969年制定食品卫生通则，到1999年已经作了第4次修订 ;l良好卫生规范涉及世界各

18、国范围内应当遵循的食品安全和食品适宜性的各项要求，其目的是使食品生产涉及的所有条件和措施能确保食物链中各个阶段食品的安全性和适宜性; 审查的范围有审查的范围有：初级产品的生产; 食品生产经营企业的设计;食品生产企业的操作规程;食品生产经营操作的控制及其规范;食品生产经营企业的维护及卫生管理;个人卫生;运输;产品信息;培训.l美国于1963年正式将其引入药品生产;l美国于1969年制定了适用于食品生产的GMP;l1969年第22届世界卫生大会上，WHO建议各成员国的药品生产采用GMP，以保证药品质量;l GMP有3种,即药品GMP、食品GMP及医疗器械GMP；lGMP是生产和质量控制程序结合，以

19、保证产品生产的一致性，达到其规格要求 。l食品食品GMP的管理要素包含四个的管理要素包含四个M：l人员（人员（Man） 要由适任的人员来制造与管理。要由适任的人员来制造与管理。l原料（原料（Material） 要选用良好的原材料来制造。要选用良好的原材料来制造。l设备（设备（Machine） 要采用标准的厂房和机器设备。要采用标准的厂房和机器设备。l方法（方法（Method） 要遵照既定的最适方法来制造。要遵照既定的最适方法来制造。基本内基本内容编号容编号国家标准类卫生规国家标准类卫生规范范出口食品企业卫生要出口食品企业卫生要求及卫生注册规范求及卫生注册规范美国的美国的GMP法规法规1原材料采

20、购、运输原材料采购、运输、贮藏的卫生、贮藏的卫生卫生质量管理卫生质量管理人员卫生人员卫生2工厂设计与设施卫工厂设计与设施卫生生厂区环境卫生厂区环境卫生厂房和场地厂房和场地3工厂的卫生管理工厂的卫生管理车间及设备设施卫车间及设备设施卫生生卫生管理卫生管理4个人卫生与健康要个人卫生与健康要求求原料、辅料机加工原料、辅料机加工用水卫生用水卫生卫生设施和管理卫生设施和管理5加工过程中的卫生加工过程中的卫生加工检验人员卫生加工检验人员卫生设备和工器具设备和工器具6成品贮藏、运输卫成品贮藏、运输卫生生加工卫生加工卫生加工和控制加工和控制7卫生与质量检验管卫生与质量检验管理理包装、储存、运输包装、储存、运输

21、卫生卫生仓储和销售仓储和销售8 卫生检验管理卫生检验管理 lSSOP是一个书面方法，由企业根据GMP制定 ；lSSOP的目的是防止产品受到各种危害的污染；控制不当温度条件而引起的微生物生长；以及保证维护和保养设备的程序到位。 一份SSOP书面计划包括多个卫生标准操作程序，每个卫生标准操作程序书写内容又大致包括5个方面： 标准的要求； 卫生标准操作程序； 监测； 修正措施； 记录。1)水和冰的安全性2)食品接触表面的清洁和卫生3)防止交叉污染4)洗手, 手的消毒和卫生间设施的维护5)防止外来污染物造成的掺假6)有毒化合物的处理, 贮存和使用7)雇员的健康状况8)昆虫与鼠类的扑灭及控制SSOP 指

22、企业为了达到GMP所规定的要求，保证所加工的食品符合卫生要求而制定的指导食品生产加工过程中如何实施清洗、消毒和卫生保持的作业指导文件。它没有GMP的强制性，是企业内部的管理性文件。 GMP 的规定是原则性的，包括硬件和软件两个方面，是相关食品加工企业必须达到的基本条件。SSOP 的规定是具体的，主要是指导卫生操作和卫生管理的具体实施，相当于ISO9000质量体系中过程控制程序中的“作业指导书”。制定SSOP计划的依据是GMP，GMP是SSOP的法律基础，使企业达到GMP的要求，生产出安全卫生的食品是制定和执行SSOP的最终目的。 其内容包括:选择安全加工的食品;彻底烹调食物;做好的食物应立即食

23、用;小心存放已烹调好的食物;剩余的食物在食用前要重新完全加热;避免生食物与熟食接触;反复洗手;保持厨房所有表面的清洁;防止食物受到昆虫、鼠害及其他动物的污染；使用安全的水。其内容包括:保持清洁：生食与熟食分开；彻底烹调食物;在安全温度下保存食物；使用安全的水和安全的原料。其内容包括:清洁；防止交叉污染；烹调；冷藏。危害分析关键控制点是一个鉴别、评价和控制食品安全危害的系统 ;危害分析关键控制点是一个世界公认的、系统的预防方法，通过预测和预防而不是依赖于终末产品的监督和检验来消除微生物、化学和物理性危害。azard nalysis and ritical ontroloint 危害 分析 与 关

24、键 控制 点食品安全卫生预防控制体系。60年代末始创于美国宇航食品年代末始创于美国宇航食品93年年 EU 委员会委员会HACCP决议决议/指令指令美国美国 95年年 颁布水产品颁布水产品HACCP法规法规97年年 CAC 颁布颁布HACCP法规法规美国美国 97年年 颁布禽、肉法规颁布禽、肉法规美国美国 2001年年 颁布果蔬汁颁布果蔬汁HACCP法规法规92年美国年美国NACMCF提出提出HACCP应用原则应用原则养殖业、饲料加工业、餐饮业、行政管理养殖业、饲料加工业、餐饮业、行政管理1973美国发布低酸罐头美国发布低酸罐头HACCP法规法规我国我国2002年发布食品企业年发布食品企业HAC

25、CP管理规定管理规定美国国家食品微生物学标准顾问委员会 1. 危害分析与预防控制措施(HA) 2. 确定关键控制点(CCP) 3. 建立所确定的关键控制点极限值(CL) 4. 对关键控制点进行监控(M) 5. 建立纠偏程序(CA) 6. 建立有效的记录及保存系统(R) 7. 建立验证程序(V)lHACCP体系是一种预防性控制体系，而非反应性的体系；lHACCP不是一个孤立的体系，必须建立在GMP和SSOP基础之上；lHACCP体系具有特异性；lHACCP体系不是一个零风险的体系，但它是目前国际上公认的控制食品安全危害的最有效的体系；lHACCP和ISO9000一样需要持续改进lGMP、SSOP

26、 是制定和实施HACCP计划的基础和前提。没有GMP、SSOP，实施HACCP计划将成为一句空话。SSOP计划中的某些内容也可以列入HACCP计划内加以重点控制。 lGMP、SSOP控制的是一般的食品卫生方面的危害，HACCP重点控制食品安全方面的显著性危害。l仅仅满足GMP和SSOP的要求，企业要靠繁杂的、低效率和不经济的最终产品检验来减少食品安全危害给消费者带来的健康伤害（即所谓的事后检验）；而企业在满足GMP和SSOP的基础上实施HACCP计划，可以将显著的食品安全危害控制和消灭在加工之前或加工过程之中（即所谓的事先预防）。lGMP、SSOP、HACCP的最终目的都是为了使企业具有充分、

27、可靠的食品安全卫生质量保证体系，生产加工出安全卫生的食品，保障食品消费者的食用安全和身体健康。 GMPSSOPHACCP风险分析 :Risk Analysis.风险分析（Risk Analysis）的概念于80年代末被应用于食品安全管理 ;1997年，在意大利罗马召开的FAO/WHO食品标准、食物化学及食品贸易会议上作出了“在评价时继续以适当的科学原则为基础并遵循风险评估的决定” 风险（Risk）指人群暴露于食品危害后造成不良影响的可能性和严重性。l食品风险分析是针对国际食品安全性应运而生的一种宏观管理模式 ；l风险分析是保证食品安全的一种新模式，同时也是一门正在发展中的新兴学科；l风险分析已

28、被认认为是制定食品安全标准的基础。 l风险分析包括三部分：风险评估、风险管理、风险信息交流 。 l风险评估是利用现有的科学资料，对食品中某种生物、化学或物理因素的暴露对人体健康产生的不良后果进行识别、确认和定量。它分为4个阶段：危害识别、危害特征描述、暴露评估以及风险描述。 l风险管理是根据风险评估的结果，同时考虑社会、经济等方面的有关因素，对各种管理措施的方案进行权衡，并且在需要时加以选择和实施。风险管理的首要目标是通过选择和实施适当的措施，尽可能有效地控制食品风险，从而保障公众健康。措施包括制定最高限量，制定食品标签标准，实施公众教育计划，通过使用其他物质、或者改善农业或生产规范以减少某些

29、化学物质的使用。l风险管理可以分为4个部分：风险评价、风险管理选择评估、执行管理决定、以及监控和审查。 l风险情况交流是指在风险评估人员、风险管理人员、消费者和其他有关的团体之间就与风险有关的信息和意见进行相互交流。风险情况交流应当包括国际组织(包括CAC、FAO和WHO、WTO)、政府机构、企业、消费者和消费者组织、学术界和研究机构、以及媒体。其中一个特别重要的方面，就是将专家进行风险评估的结果以及政府采取的有关管理措施告知公众或某些特定人群(如老人、儿童、以及免疫缺陷症、过敏症、营养缺乏症患者)，以及建议消费者可以采取的自愿性和保护措施等。 l风险分析是一种宏观管理模式，是政府行为；是制定

30、食品标准的基础。lHACCP是一种“预防性”的风险管理措施 ，是企业行为。第一次浪潮以GHP为代表,重点是食品生产加工的一般卫生原则，第二次浪潮（HACCP）的重点是鉴别、评价和控制食品中危害因子；第三次浪潮（Risk analysis）的重点是人类健康和整个食物链 2.1 认识微生物2.2 常见微生物指标菌及致病菌 2.3 微生物检测的一般流程二、微生物基础知识Http:/微生物是一个通称：种类多、分布广繁殖快适应性强易变异形体微小，结构简单的低等生物。病毒、细菌、放线菌、真菌2.1 认识微生物认识微生物真核细胞型微生物真核细胞型微生物细胞核分化程度高，有核膜和核仁，细胞器完整。如真菌。原核

31、细胞型微生物原核细胞型微生物细胞核的分化较低，仅有原始核，无核膜、核仁。细胞器很不完善。DNA和RNA同时存在。这类微生物众多，有细菌、放线菌、支原体、衣原体、立克次体、螺旋体。非细胞型微生物非细胞型微生物是最小的一类微生物。无典型的细胞结构，只能在活细胞内生长繁殖。核酸类型为DNA或RNA。病毒属之。脑膜炎奈瑟菌脑膜炎奈瑟菌双球菌双球菌(diplococcus)肺炎链球菌肺炎链球菌链球菌链球菌(streptococcus)葡萄球菌葡萄球菌(streptococcus)四联球菌四联球菌(tetrad)八叠球菌八叠球菌(sarcina)不同杆菌的大小、长短、粗细很不一致。不同杆菌的大小、长短、粗

32、细很不一致。炭疽芽胞杆菌 3-10 m大中大肠埃希菌 2-3 m小布鲁菌 0.6-1.5 m杆菌的形态多样杆菌的形态多样两端齐平炭疽芽胞杆菌炭疽芽胞杆菌两端尖细白喉棒状杆菌白喉棒状杆菌杆菌的形态多样杆菌的形态多样分枝杆菌分枝杆菌双歧杆菌双歧杆菌弧菌弧菌螺菌螺菌螺杆菌螺杆菌微生物从不知到知的过程微生物从不知到知的过程酿酒、天花，列文虎克、巴斯德、 科赫 远古人类发现，吃剩的米粥数日后变成了醇香可口的饮料人类最早发明的酒酒池肉林史记列文虎克列文虎克 荷兰荷兰1673年年自制显微镜自制显微镜“小动物小动物”的微生物世界的微生物世界法国科学家巴斯德法国科学家巴斯德 彻底否定了自然发生说证实发酵由微生物

33、引起免疫学预防接种发明巴氏消毒法无菌营养液出现微生物无菌营养液无生命出现加热无菌营养液无生命出现巴巴 斯斯 德德 的的雁颈瓶实验雁颈瓶实验巴斯德发现免疫现象几星期后42-43oC下培养的老龄炭疽菌获免疫力37oC下培养的新鲜炭疽菌减毒疫苗： 炭疽杆菌：1881 狂犬病疫苗：1885，9岁男孩梅斯特 Meister在60个小时前被狗咬了14次。巴斯德用在干燥空气中保存了15天的兔脊髓提炼的疫苗进行皮下注射。在后来的10天中又注射了12次增强病毒疫苗。在以后的15个月中狂犬病疫苗救治了2500名被狗咬伤的人。1940 第一次用科学的方法证明某种特定的微生物是某种特定疾病的病原。 培养出炭疽杆菌、霍

34、乱弧菌、结核杆菌等病原微生物德国科学家科赫德国科学家科赫要判定一种病原体，必须同时满足四个条件：第一，必须在所有病人身上发现病原体；第二，必须从病人身上分离并培养出病原体；第三，把培养出的病原体接种给动物， 动物应该出现与病人相同的症状；第四，从出现症状的动物身上能够分离培养出同一种病原体。科赫原则科赫原则 和和 SARS病原病原2003年2月18日，中国疾病预防中心认为非典型肺炎病原体为衣原体。 他们是通过电镜从2例尸解标本中发现衣原体样颗粒。正确么？2.2 2.2 常见卫生指标及致病菌常见卫生指标及致病菌细菌总数大肠菌群和粪大肠菌群/耐热大肠菌群肠道杆菌大肠杆菌沙门氏菌金黄色葡萄球菌单增李

35、斯特氏菌肉毒梭菌致病性弧菌霉菌和酵母菌2.2.1 细菌总数：菌落总数菌落菌落(colony)：生长在固体培养基上：生长在固体培养基上，来源于一个细胞，肉眼可见的细胞，来源于一个细胞，肉眼可见的细胞群体。群体。菌落形成单位菌落形成单位CFU(colony forming unit) 平板菌落计数平板菌落计数TPC(total plate count)菌落总数菌落总数(total colony number)：通过平板菌落计数：通过平板菌落计数的方法，对被检样品单位重量、容积、面积的活菌的方法，对被检样品单位重量、容积、面积的活菌在普通营养琼脂平板上形成的菌落进行计数，所得在普通营养琼脂平板上形成

36、的菌落进行计数，所得到的所有嗜中温的、需氧和兼性厌氧的细菌菌落总到的所有嗜中温的、需氧和兼性厌氧的细菌菌落总数。是活的细胞总数。数。是活的细胞总数。细菌总数细菌总数(total bacteria number)是死的、活的细胞是死的、活的细胞的总数。的总数。指标说明：指标说明：某产品出口欧盟，欧盟的要求：细菌总数：m: 10000M: 100000n: 5c: 2梯度问题：编号编号 10倍倍 100倍倍 1000倍倍 结果结果 1 360 380 200 243 146 1912.2.2大肠菌群大肠菌群卫生指标和意义卫生指标和意义定义定义MPN值：值：Most Probable Number

37、Method报告：大肠菌群报告：大肠菌群MPN3/克克 3个大肠菌群/1L饮水 100个细菌总数/1ml饮水我国饮用水卫生标准：平板计数问题：平板计数问题：8大肠菌群固体培养基测定法8.2.1选取适宜的三个连续稀释度的样品液,每个稀释度接种两个灭菌平皿,每皿1mL。另取1mL稀释剂加入一个灭菌平皿中,作空白对照。8.2.2将冷至450.5的结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)1015mL倾注于每个平皿中。小心旋转平皿,将培养基与样液充分混匀。8.2.3待琼脂凝固后,再加34mL VRBA覆盖平板表层。8.2.4翻转平板,置于361培养1824h。8.2.5选用有30150个菌落的平板,计数平板上出

38、现的典型大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环。菌落直径为0.5mm或更大。8.2.6证实从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落,移种于BGLB肉汤管内, 361培养24h和48h,观察产气情况。将出现产气的肉汤管判为大肠菌群阳性。对形成菌膜的阳性管,应进行革兰氏染色,以便排除革兰氏阳性杆菌。8.2.7结果报告经最后证实为阳性(产气,革兰氏阴性杆菌) 的试管百分比乘以于8.2.5条中计数的平板菌落数,再乘以稀释倍数,即为每克(毫升)样品中大肠菌群数。例：10*-4样品稀释液1mL,在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落,挑取其中10

39、个接种BGLB肉汤管,证实有6个阳性管,则该样品的大肠菌群数为：1006/1010*4/g(mL)6.010*5/g(mL)北美国家一般使用“粪大肠菌群”概念，如AOAC、FDA。SN中的“粪大肠菌群”概念为等同采用AOAC方法，故而使用粪大肠菌群概念；而欧洲使用“耐热大肠菌群”概念，较少使用“粪大肠菌群”。项目 依据耐热大肠菌群 NMKL、ISO粪大肠菌群 NMKL AOAC 定义在44.5培养，24h内能产酸产气的细菌在胰蛋白胨肉汤中于44.5，24h内产生吲哚的耐热大肠菌群于LST中36培养48h内产气，并于EC内培养4424h产气的一群细菌 作为一种卫生指标菌，耐热大肠菌群中很可能含有

40、粪源微生物，因此耐热大肠菌群的存在表明可能受到了粪便污染，可能存在大肠杆菌。但是，耐热大肠菌群的存在并不代表对人有什么直接的危害。作为粪便污染指标菌，耐热大肠菌群与大肠菌群、大肠杆菌相似，主要以其检出情况来判断食品是否受到了粪便污染。粪便是肠道排泄物，有健康者，也有肠道病患者或带菌者粪便，所以粪便中既有正常肠道菌，也可能有肠道致病菌（如沙门氏菌、志贺式菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌等）和食物中毒者。因此，食品既然受到粪便污染就有可能对食用者造成潜在的危害。通常情况下，耐热大肠菌与大肠菌群相比，在人和动物粪便中所占的比例较大，而且由于在自然界容易死亡等原因，耐热大肠菌群的存在可认为食品直接或间接的受到

41、了比较近期的粪便污染。因而，耐热大肠菌群在食品中的检出，与大肠菌群相比，说明食品受到了更为不清洁的加工，肠道致病菌和食物中毒菌的可能性更大。 2.2.3 肠道杆菌肠道杆菌(enteric bacilli)一大群居住在人和动物肠道中 生物学性状近似的革兰阴性杆菌属于肠杆菌科 多数是肠道的正常菌群，至少有30个菌属，120个以上的菌种少数为致病菌，是胃肠传染病的最重要病原菌肠杆菌科中与医学有关的常见菌族和菌属埃希菌族 埃希菌属 大肠杆菌 志贺菌属 痢疾志贺菌爱德华菌族 爱德华菌属 迟钝爱德华菌沙门菌族 沙门菌属 伤寒沙门菌 枸橼酸菌属 佛劳第枸橼酸菌克雷伯菌族 克雷伯菌属 肺炎克氏菌 肠杆菌属 产

42、气肠杆菌 哈夫尼亚菌属 蜂窝哈夫尼亚菌 沙雷菌属 粘质沙雷菌变形杆菌族 变形杆菌属 普通变形杆菌 摩根菌属 摩氏摩根菌属 普罗威登斯菌属 雷氏普罗威登斯菌耶尔森菌族 耶尔森菌属 鼠疫耶尔菌欧文菌族本 欧文菌属 草原居民欧文菌菌族 菌属（菌种数） 代表种乳糖发酵试验共同特性共同特性1、相似的形态染色、相似的形态染色2、简单的培养条件、简单的培养条件3、活泼的生化反应、活泼的生化反应重要试验初步鉴别肠道致病菌和肠道非致病菌肠道致病菌肠道非致病菌多数不发酵不发酵乳糖 多数发酵发酵乳糖5、抵抗力、抵抗力不强6、易变异、易变异溶源性转换生化反应性变异通过引起耐药性变异毒力性变异转导接合4、抗原构造复杂、

43、抗原构造复杂 2.2.4 大肠杆菌大肠杆菌(埃希氏菌属埃希氏菌属 Escherichine)是人类和动物肠道中的正常菌群出生后数小时就进入肠道，并终生伴随以大肠埃希氏菌（E.coli）最为重要在环境和食品卫生学上，常被用作粪便污染的检测指标卫生学指标卫生学指标 在分子生物学和基因工程实验中在分子生物学和基因工程实验中重要的实验材料和研究对象重要的实验材料和研究对象大肠杆菌也是重要的实验材料和研究对象大肠杆菌也是重要的实验材料和研究对象正常菌群，一般不致病正常菌群，一般不致病1、条件致病某些带有致病基因的血清型，引起肠道感染两大原因可以致病两大原因可以致病细菌居住部位改变引起的肠外感染：尿路感染

44、最常见2、致病菌株侵袭性大肠杆菌（EIEC）致泻性大肠杆菌肠毒素性大肠杆菌（ETEC）致病性大肠杆菌（EPEC）出血性大肠杆菌（EHEC）菌株 作用部位 所致疾病 致病机理 ETEC 小肠 旅行者腹泻 婴幼儿腹泻 ST、LT EPEC 小肠 婴儿腹泻 粘附和破坏上皮细胞 EIEC 大肠 痢疾样腹泻 侵袭和破坏 结肠粘膜上皮细胞 EHEC 大肠 出血性结肠炎 Vero 毒素 致病性大肠杆菌引起的腹泻致病性大肠杆菌引起的腹泻日本再度发生O157病菌感染事件 -新华网东京月日专电日本最近再度发生病原性大肠杆菌集体感染事件，到日为止，东京、千叶、埼玉、神奈川、茨木、群马等地已有人受到感染。 这次集体感

45、染于月日首先在千叶县柏市被发现。诊断和调查结果表明，患者是由于食用了一些工厂生产的不洁净的食品而被感染的。 日本曾于、年前首次发生病原性大肠杆菌集体感染事件。患者有发烧、恶心、呕吐等症状。2001年年4月月9日日17:29新华网报道新华网报道其中许多为人畜共患病一大群人与动物肠道中的寄生菌菌群菌型甚多，仅少数对人致病2.2.5 沙门氏菌沙门氏菌广泛存在于动物肠道、内脏中引起中毒的主要是动物源性食品菌名动力葡萄糖乳糖麦芽糖甘露醇蔗糖硫化氢吲哚甲基红VP枸橼酸盐甲型副伤寒沙门菌+/+乙型副伤寒沙门菌+鼠伤寒沙门菌+丙型副伤寒沙门菌+猪霍乱沙门菌+/+伤寒沙门菌+/+肠炎沙门菌+常见沙门菌的主要生化

46、特性常见沙门菌的主要生化特性1、致病物质：致病性与免疫性致病性与免疫性侵袭力：O抗原 VI抗原毒 素：内毒素2、所致疾病：伤寒副伤寒食物中毒败血症外毒素-肠毒素胆囊-肠道-粪排菌皮肤-血拴出血-玫瑰疹肾-尿肝脾-肿大骨髓-受抑制伤寒和付伤寒的致病过程伤寒和付伤寒的致病过程伤寒和付伤寒杆菌小肠上部粘膜肠系膜淋巴结 固有层淋巴结进入血液再次进入血液第一次菌血症第二次菌血症病愈后免疫力较牢固，主要是细胞免疫病愈后免疫力较牢固，主要是细胞免疫3、免疫性沙门氏菌的预防措施：SSOP、GMP控制个人卫生习惯，严格洗手、消毒以及防止粪便污染水源，加强加工用水的消毒。食用前充分加热以及防止交叉污染沙门氏菌在S

47、S平板上多数不分解乳糖2.2.6 志贺氏菌志贺氏菌 shigella是人类细菌性痢疾最为常见的病原菌，是人类细菌性痢疾最为常见的病原菌，通称痢疾杆菌通称痢疾杆菌dyseatery bacteria无荚膜、无鞭毛，有菌毛生化反应低于其他肠道杆菌，对酸敏感形态对理化因素的低抗力抗原与分类抗原与分类根据O抗原分类亚型111516，X，Y变种110型DCBA群宋氏志贺菌鲍氏志贺菌福氏志贺菌痢疾志贺菌 菌种分为4群39个血清型（包括亚型） 致病性致病性人类是唯一的患者和带菌者粪口传播感染灶局限于结肠粘膜层，一般不入血病后免疫期短，也不巩固 致病物质致病物质1、侵袭力：、侵袭力：菌毛有利于菌粘附至肠粘膜2

48、、毒、毒 素素：加重局部和全身症状内毒素作用于肠壁通透性增加粘膜炎症、溃疡局部全身内毒素血症外毒素（A群1型）与内毒素协同作用 临床表现临床表现急性细菌性痢疾急性细菌性痢疾急性典型：发热、腹痛、脓血粘液便非急性典型：小儿中毒型 成人易误漏诊慢性细菌性痢疾：病程迁移二月以上 中毒性痢疾病人2.2.7 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌急性化脓性感染食物中毒正常人带菌，30-80%通过工人手和呼吸道污染食品 金黄色葡萄球菌在生牛奶、熟肉制品及冰激凌等3类食品中的检出率为19.67%；前两种食品的污染率分别为25.13%和20.33%。浙江CDC 2000-2004年监控结果金葡感染染色观察在BP平板上的

49、典型菌落大阪市政府日宣布的调查结果显示，因食用日本雪印乳业公司大阪工厂生产的乳制品而中毒者已逾万人。在大阪府和京都府以及附近县，因食用雪印乳业公司大阪工厂生产的乳制品而中毒发病者已达人，其中有人被送往医院，目前还有人在医院接受治疗。据化验，该工厂生产的一些乳制品中含有黄色葡萄球菌，这种细菌可产生使人出现腹泻、呕吐症状的型肠毒素。该厂乳制品染菌是生产设备没有按规定定期清洗而造成的。目前，日本各地超市和食品店都已停止销售雪印牌乳制品，一些地方政府已下令禁止食用雪印牌食品。大阪雪印厂已被当地政府勒令无期限停产，并且大规模回收月下旬出厂的几种染菌食品。 总部设在北海道首府札幌市的雪印乳业公司是日本著名

50、乳制食品厂家。该公司在全国共拥有家工厂，其中家工厂加工生产牛奶、牛奶饮料、酸奶等奶品。 媒体关于日本雪印牛奶金黄色葡萄球菌中毒事件的报道日本因食用染菌乳制品中毒者已逾万人 (2000年7月6日12:39) 2.2.8 单增李斯特氏菌：单增李斯特氏菌：人、畜共患，4生长，冷藏食品预防措施：充分烹调产品，对于经过热处理的食品应防止交叉污染。耐盐，在10%的盐中也可生长 革兰氏阳性短小杆菌2.2.8 肉毒梭菌：肉毒梭菌：厌氧性梭状芽胞杆菌属肉毒毒素（神经毒素）腊肠、火腿、鱼及鱼制品和罐头食品 充分加热，控制产品中的pH值， 改变水活度值（0.93以下），但不能达到完全控制控制温度（冷藏）以及时间（巴

51、氏消毒后冷藏3.3以下）食品中添加盐或亚硝酸盐 主要包括霍乱弧菌、副溶性弧菌和创伤弧菌。 大多数弧菌源于海洋，是嗜盐菌，嗜温性。预防措施：l彻底烹调或预煮，并防止交叉污染l控制原料收购l产品的冷藏适宜 2.2.9 致病性弧菌：致病性弧菌：弧菌属（弧菌属（Vibrio）弧菌是一大群菌体短小，弯曲成弧形的革兰阴性菌形态与染色形态与染色涂片中呈穿梭样运动非常活泼液体中排列整齐呈鱼群状革兰染色阴性 弧型或逗点状， 单鞭毛霍乱弧菌（霍乱弧菌（V.cholerae）培养特性培养特性 耐碱不耐酸碱性琼脂平板上生长良好在pH8.89.0的碱性蛋白胨水根据O抗原不同抗原构造与分型抗原构造与分型现已有155个血清

52、群其中O1群、O139群引起霍乱 根据表型差异O1群霍乱弧菌的每一个血清型还可分为2 生物型古典生物型El Tor生物型霍乱弧菌考核问题霍乱弧菌考核问题抵抗力抵抗力El Tor生物型和其它非01群霍乱弧菌不耐酸不耐酸，在正常胃酸中仅能存活4分钟在外环境中的生存力较古典型为强水中存活长水中存活长，河水、井水、海水中1-3周怕热怕热，1001-2分钟死亡1霍乱肠毒素: 致病物质致病物质激活GS，使细胞内cAMP水平升高，主动分泌Na+、K+、HCO3和水，导致重的腹泻与呕吐B亚单位A亚单位与小肠粘膜上皮细胞GM1神经节苷脂受体结合，介导A亚单位进入细胞（结合亚单位）（毒性亚单位）霍乱肠毒素的作用机

53、理1234霍乱肠毒素的作用机理鞭毛运动鞭毛、菌毛鞭毛、菌毛普通菌毛有助于细菌穿过肠粘膜表面粘液层 而接近肠壁上皮细胞是细菌定居于小肠所必须的因子 剧烈腹泻和呕吐（米泔水样腹泻物）， 大量水分和电解质丧失 ，低容量性休 克及心力不齐和肾衰竭（死亡率高达60%）烈性肠道传染病，为我国的甲类法定传染病传播途径传播途径主要是通过污染的水源或食物经口摄入所致疾病所致疾病传染源传染源临床表现临床表现霍霍 乱乱病人、无症状感染者上吐下泻霍乱病人免疫性免疫性感染霍乱弧菌后，机体可获得牢固免疫力生物学特性生物学特性 在培养基中以含3.5%NaCl生长最为适宜在“我妻琼脂平板”上产生溶血现象副溶血弧菌（副溶血弧菌

54、（V. V. parahaemolyticus parahaemolyticus ）防治防治致病性致病性 食物中毒，该菌经烹饪不当的海产品或盐腌制品所传，播潜伏期572小时，可产生自限性腹泻至中度霍乱样病症。治疗可用抗菌药物食品卫生管理l03年共采集41份鱼虾标本，检出副溶血性弧菌24份，检出率为58.58%。l其中鱼类中副溶血性弧菌的检出率为42.86%（9/21）；虾类副溶血性弧菌检出率为75%（15/20）。在三份市场活虾的副溶血性弧菌的污染量达24000 MPN/100g、15000和11000MPN/100g。l监测结果表明主要肠道病原菌的菌相为副溶血性弧菌，占总病原菌的85.65%

55、。显示目前我省城市居民肠道病原菌以弧菌为主浙江浙江CDC系统系统2003年年 海水产品副溶血性弧菌定量检测海水产品副溶血性弧菌定量检测2.2.10 2.2.10 霉菌和酵母霉菌和酵母评价食品卫生质量的指示菌造成腐败变质pH低、湿度低、含盐和含糖高的食品产黄青霉菌落细菌生长抑制区域正常细菌生长区域2.3 微生物检测的一般流程微生物检测的一般流程致病菌检测：增菌（直接增菌或选择性增菌）-筛选-纯化-生化反应和血清学反应大大肠肠杆杆菌菌检检验验流流程程均质，接种9支LST发酵管接种EC发酵管EMB平板划线可疑菌落斜面纯化生化反应：I M V iC报告结果培养48小时培养48小时培养24小时培养24小

56、时96小时1天天+2天天+1天天+1天天+4天天=10天天三、三、 微生物检测的基本技术微生物检测的基本技术3.1、微生物实验的准备3.2、微生物实验的基本操作3.3、微生物实验的观察3.4、空气监测和表面样品3.5、菌种的保藏Http:/3.1、微生物实验的准备、微生物实验的准备3.1.1 玻璃器皿的洗刷与准备3.1.2 消毒与灭菌3.1.1玻璃器皿的洗刷与准备玻璃器皿的洗刷与准备(一)洁净剂及使用范围(二)洗涤液的制备及使用注意事项(三)洗涤玻璃仪器的步骤与要求(四)玻璃仪器的干燥(五)玻璃器皿的包装和灭菌（一）洁净剂及使用范围（一）洁净剂及使用范围最常用的洁净剂是肥皂，肥皂液（特制商品）

57、，洗衣粉，去污粉，洗液，有机溶剂等。肥皂，肥皂液，洗衣粉，去污粉，用于可以用刷子直接刷洗的仪器，如烧杯，三角瓶，试剂瓶等； 洗液多用于不便用于刷子洗刷的仪器，如滴定管，移液管，容量瓶，蒸馏器等特殊形状的仪器，也用于洗涤长久不用的杯皿器具 和刷子刷不下的结垢。用洗液洗涤仪器，是利用洗液本身与污物起化学反应的作用，将污物去除。因此需要浸泡一定的机会充分作用； 有机溶剂是针对污物属 于某种类型的油腻性，而借助有机溶剂能溶解油脂的作用洗除之，或借助某些有机溶剂能与水混合而又发挥快的特殊性，冲洗一下带水的仪器将水洗去。如，甲苯，二甲苯，汽油等可以洗油垢，酒精，乙醚，丙酮可以冲洗刚洗净而带水的仪器。( (

58、二）洗涤液的制备及使用注意事项二）洗涤液的制备及使用注意事项洗涤液简称洗液，根据不同的要求有各种不同的洗液 。将较常用的几种介绍如下。1.强酸氧化剂洗液强酸氧化剂洗液是用重铬酸甲（K2Cr2O7）和浓硫酸（H2SO4)配成。K2Cr2O7在酸性溶液中，有很强的氧化能力， 对玻璃仪器又及少有侵蚀作用。所以这种洗液在实验室内使用最广泛。配制浓度各有不同，从512%的各种浓度都有。配制方法大致相同：取一定量的K2Cr2O7（工业品即可），先用约12倍的水加热溶解，稍冷后，将工业品浓H2SO4所需体积数徐徐加入K2Cr2O7不溶液中（千万不能将水或溶液加入H2SO4中），边倒边用玻璃棒搅拌，并注意不要

59、溅出，混合均匀，俟冷却后，装入洗液瓶备用。新配制的洗液为红褐色，氧化能力很强。当洗液用久后变为黑绿色，即说明洗液无氧化洗涤力。例如,配制12%的洗液500mL。取60克工业品K2Cr2O7置于100mL水中（加水量不是固定不变的，以能溶解为度），加热溶解，冷却，徐徐加入浓H2SO4mL，边加边搅拌，冷后装瓶备用。这种洗液在使用时要切实注意不能溅到身上，以防“烧”破衣服和损伤皮肤。洗液倒入要洗的仪器中，应使仪器周壁全浸洗后稍停一会再倒回洗液瓶。第一次用少量水冲洗刚浸洗过的仪器后，废水不要倒在水池里和下水道里，长久会腐蚀水池和下水道，应倒在废液缸中，缸满后倒在垃圾里，如果无废液缸，倒入水池时，要边

60、倒边用大量的水冲洗。.碱性洗液碱性洗液用于洗涤有油污物的仪器，用此洗液是采用长时间（小时以上）浸泡法，或者浸煮法。从碱洗液中捞取仪器时，要戴乳胶手套，以免烧伤皮肤。常用的碱洗液有：碳酸钠液（Na2CO3,即纯碱），碳酸氢钠（Na2HCO3,小苏打），磷酸钠（Na3PO4,磷酸三钠）液，磷酸氢二钠（Na2HPO4)液等。. 碱性高锰酸钾洗液用碱性高锰酸钾作洗液，作用缓慢，适合用于洗涤有油污的器皿。配法：取高锰酸钾（KMnO4)4克加少量水溶解后，再加入氢氧化钠（NaOH)mL。.纯酸纯碱洗液根据器皿污垢的性质，直接用浓硫酸（HCL）或浓硫酸（H2SO4)、浓硝酸(HNO3)浸泡或浸煮器皿（温度不宜太高，否者浓酸