生物制药工艺学：第3章 酶工程2012

1、1第三章第三章 生物制药工艺技生物制药工艺技 术的发展术的发展2生物技术生物技术的四大支柱四大支柱基因工程细胞工程酶工程发酵工程生生物物技技术术（生物工程）用用“剪刀剪刀+ +糨糊糨糊”创创造新物种的工程造新物种的工程微观水平的嫁微观水平的嫁接技术接技术让工厂高效、让工厂高效、安静、美丽安静、美丽如画的工程如画的工程把微生物或细胞造把微生物或细胞造就成无数微型工厂，就成无数微型工厂，将神话变为现实的将神话变为现实的桥梁。桥梁。3第一代酶第一代酶酶制剂；酶制剂；第二代酶第二代酶固定化酶；固定化酶；第三代酶第三代酶固定化多酶（包含辅因子固定化多酶（包含辅因子 再生系统）。再生系统）。一、酶工程技术

2、一、酶工程技术 酶工程就是将酶或者微生物酶工程就是将酶或者微生物细胞细胞，动植物细胞，动植物细胞，细胞器细胞器等在一定的等在一定的生物反应生物反应装置中，利用酶所具有的生物催化功装置中，利用酶所具有的生物催化功能能, ,借助工程手段将相应的原料转化成有用物质并应用于社借助工程手段将相应的原料转化成有用物质并应用于社会生活的一门会生活的一门科学技术科学技术。4酶的分类n（一）蛋白酶（一）蛋白酶n（二）核酸类酶（二）核酸类酶（R酶）酶）n（三）国际系统分类法（三）国际系统分类法5酶催化作用特性n1高效性n2专一性n3反应条件温和n4. 酶活力可调节控制6酶的应用酶的应用|生物洗涤剂工业生物洗涤剂工

3、业|烘烤食品工业烘烤食品工业|酿酒工业酿酒工业|乳制品工业乳制品工业|糖工业糖工业|纺织工业纺织工业|制革工业制革工业|医疗和药品工业医疗和药品工业78酶的发酵生产n酶的生产是指经过预先设计，并且通过人工控制而获酶的生产是指经过预先设计，并且通过人工控制而获得所需要的酶的过程。得所需要的酶的过程。n提取法：提取法：最早采用并且沿用至今的一种方法。提取法最早采用并且沿用至今的一种方法。提取法采用各种技术，直接从动植物或微生物的细胞或组织采用各种技术，直接从动植物或微生物的细胞或组织中将酶提取出来。该法中将酶提取出来。该法简单易行，但必须要有充足的简单易行，但必须要有充足的原材料原材料。n发酵法：

4、发酵法：发酵法主要通过发酵法主要通过微生物发酵微生物发酵来获得人们所需来获得人们所需要的酶。要的酶。n化学合成法化学合成法 9微生物酶发酵生产概念微生物酶发酵生产概念n微生物酶是指在人工控制的条件下，有目的利微生物酶是指在人工控制的条件下，有目的利用微生物培养来生产所需要的酶，其技术包括用微生物培养来生产所需要的酶，其技术包括培养基和发酵方式的选择及发酵条件的控制管培养基和发酵方式的选择及发酵条件的控制管理等方面的内容。理等方面的内容。n生产流程生产流程n优良产酶菌种的筛选优良产酶菌种的筛选基因工程菌（细胞）基因工程菌（细胞）的构建的构建微生物酶的发酵生产微生物酶的发酵生产101 1、优良产酶

5、菌种的筛选、优良产酶菌种的筛选从动植物组织中分离提取从动植物组织中分离提取植物细胞培养产酶植物细胞培养产酶动物细胞培养产酶动物细胞培养产酶微生物发酵产酶微生物发酵产酶|酶的来源酶的来源11繁殖快、生活周期短、产酶量高，酶比活高；繁殖快、生活周期短、产酶量高，酶比活高；培养方法简单，原料来源丰富，经济效益高；培养方法简单，原料来源丰富，经济效益高；微生物菌株种类繁多，酶的品种齐全；微生物菌株种类繁多，酶的品种齐全；可以通过诱导、诱变及基因工程等方法培育出新的可以通过诱导、诱变及基因工程等方法培育出新的产酶量高的菌种；产酶量高的菌种；|微生物作为产酶生产来源的优点微生物作为产酶生产来源的优点12|

6、优良的产酶菌种应具备的优点优良的产酶菌种应具备的优点繁殖快、产酶量高繁殖快、产酶量高能在便宜的底物上生长良好能在便宜的底物上生长良好产酶性能稳定、菌株不易退化产酶性能稳定、菌株不易退化产生的酶容易分离纯化产生的酶容易分离纯化13|产酶菌种的筛选方法产酶菌种的筛选方法筛选步骤：筛选步骤：样品采集样品采集菌种分离菌种分离产酶性能测定产酶性能测定复筛复筛产酶菌种的检测：产酶菌种的检测：胞外酶的产酶菌株的检测胞外酶的产酶菌株的检测胞内酶的产酶菌株的检测胞内酶的产酶菌株的检测14微生物微生物n大肠杆菌：大肠杆菌：大肠杆菌也是最早用作基因工程的宿主菌；工业上生大肠杆菌也是最早用作基因工程的宿主菌；工业上生

7、产谷氨酸脱羧酶、天冬酰胺酶和制备天冬氨酸、苏氨酸及缬氨酸产谷氨酸脱羧酶、天冬酰胺酶和制备天冬氨酸、苏氨酸及缬氨酸等。等。工业发酵的重要菌种之一。生产淀粉酶、蛋白酶、工业发酵的重要菌种之一。生产淀粉酶、蛋白酶、5-核苷酸酶、某些氨基酸等。核苷酸酶、某些氨基酸等。产生一些酶类，如淀粉酶、果胶酶、脂肪酶等。在酿酒工产生一些酶类，如淀粉酶、果胶酶、脂肪酶等。在酿酒工业上常用做糖化菌。有些根霉还能产生乳酸、延胡索酸等有机酸。业上常用做糖化菌。有些根霉还能产生乳酸、延胡索酸等有机酸。制酱、酿酒、制醋的主要菌种。是生产酶制剂（蛋白酶、制酱、酿酒、制醋的主要菌种。是生产酶制剂（蛋白酶、淀粉酶、果胶酶）的菌种。

8、生产有机酸（如柠檬酸、葡萄糖酸淀粉酶、果胶酶）的菌种。生产有机酸（如柠檬酸、葡萄糖酸等）。农业上用作生产糖化饲料的菌种。等）。农业上用作生产糖化饲料的菌种。15动、植物细胞植物细胞植物细胞 用于色素、药物、香精、酶等次级代谢物的用于色素、药物、香精、酶等次级代谢物的 生产。生产。动物细胞动物细胞 用于疫苗、抗体、激素、多肽、酶等功能蛋白用于疫苗、抗体、激素、多肽、酶等功能蛋白的生产。的生产。162 2、基因工程菌（细胞）的构建、基因工程菌（细胞）的构建构建基因工程菌的目标构建基因工程菌的目标改善原有酶的各种性能：改善原有酶的各种性能：如提高酶产量、增加酶的稳定性、改变如提高酶产量、增加酶的稳定

9、性、改变酶的适应温度等酶的适应温度等扩充可安全使用的酶源扩充可安全使用的酶源17酶基因克隆及表达的基本步骤酶基因克隆及表达的基本步骤18克隆酶基因的宿主克隆酶基因的宿主载体系统应具备的特性载体系统应具备的特性所希望的酶占细胞总蛋白量的比例要高；所希望的酶占细胞总蛋白量的比例要高；菌体容易大规模培养，生长无特殊要求；菌体容易大规模培养，生长无特殊要求；载体与宿主相容，且能在宿主中稳定维持；载体与宿主相容，且能在宿主中稳定维持；宿主的蛋白酶尽可能少；宿主的蛋白酶尽可能少；宿主菌对人安全，不分泌毒素。宿主菌对人安全，不分泌毒素。193 3、微生物酶的发酵生产、微生物酶的发酵生产培养基培养基碳源碳源氮

10、源氮源无机盐类无机盐类生长因子生长因子培养基的培养基的PHPH值值20植物细胞培养基植物细胞培养基特点：需要大量的无机盐；需要多种维生素和植物生长激素；特点：需要大量的无机盐；需要多种维生素和植物生长激素； 一般要求无机氮源；多数以蔗糖为碳源。一般要求无机氮源；多数以蔗糖为碳源。常用的培养基：常用的培养基：MS培养基、培养基、B5培养基、培养基、White培养基、培养基、KM-8P培养基等。培养基等。微生物培养基微生物培养基碳源：淀粉或其水解产物碳源：淀粉或其水解产物氮源：混合氮源氮源：混合氮源21动物细胞培养基动物细胞培养基氨基酸：必需氨基酸及半胱氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺等氨基酸：必需氨基酸及

11、半胱氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺等维生素：血清提供或补充维生素：血清提供或补充B族维生素、维生素族维生素、维生素C无机盐：大量元素（调节渗透压），微量元素无机盐：大量元素（调节渗透压），微量元素（一般有血清提供）（一般有血清提供）葡萄糖：作为碳源和能源葡萄糖：作为碳源和能源激素：胰岛素、生长激素、氢化可的松等。激素：胰岛素、生长激素、氢化可的松等。一般由血清提供生长因子：血清中含有各种生长因子一般由血清提供生长因子：血清中含有各种生长因子组组 分分22微生物发酵产酶的方式及特点微生物发酵产酶的方式及特点固体培养发酵：设备简单、操作方便；劳动强度大、原料利固体培养发酵：设备简单、操作方便；劳动强度大、

12、原料利 用率低、生产周期长。用率低、生产周期长。液体深层发酵：机械化程度较高，技术管理较严格，酶的液体深层发酵：机械化程度较高，技术管理较严格，酶的产率较高，质量较稳定，产品回收率较高，产率较高，质量较稳定，产品回收率较高，酶发酵生产的主要方式酶发酵生产的主要方式固定化细胞发酵：提高产酶能力，发酵稳定性好，可以反复固定化细胞发酵：提高产酶能力，发酵稳定性好，可以反复使用，利于连续化、自动化生产，利于产品使用，利于连续化、自动化生产，利于产品的分离纯化，提高产品质量等显著特点。的分离纯化，提高产品质量等显著特点。固定化原生质体发酵固定化原生质体发酵23植物细胞培养的特点植物细胞培养的特点产率高产

13、率高周期短周期短易于管理、减轻劳动强度易于管理、减轻劳动强度产品质量高产品质量高植物细胞培养的工艺条件及其控制植物细胞培养的工艺条件及其控制温度的控制：一般在室温范围；温度的控制：一般在室温范围；pH的控制：微酸性范围，即的控制：微酸性范围，即pH56；溶解氧的调节控制：通风和搅拌（不能太强烈）；溶解氧的调节控制：通风和搅拌（不能太强烈）；光照的控制：根据细胞的特性及目的次级代谢产物的种类不光照的控制：根据细胞的特性及目的次级代谢产物的种类不 同，进行光照的调节控制；同，进行光照的调节控制；前体的添加：目的代谢物代谢途径上游的物质。前体的添加：目的代谢物代谢途径上游的物质。刺激剂的应用：常用的

14、刺激剂有微生物细胞的碎片和果胶酶、刺激剂的应用：常用的刺激剂有微生物细胞的碎片和果胶酶、纤维素酶等微生物胞外酶。纤维素酶等微生物胞外酶。24动物细胞培养的工艺条件及其控制动物细胞培养的工艺条件及其控制种质细胞种质细胞 胰蛋白酶处理细胞胰蛋白酶处理细胞 得细胞悬浮液得细胞悬浮液 细胞接细胞接入培养液中入培养液中 在反应器中进行细胞培养在反应器中进行细胞培养 收集培养液收集培养液 分离纯化产物分离纯化产物。温度的控制：一般在温度的控制：一般在36.5；pH的控制：的控制：pH7.07.6的微碱性环境；的微碱性环境；渗透压的控制：与细胞内的渗透压处于等渗状态；渗透压的控制：与细胞内的渗透压处于等渗状

15、态；溶解氧的控制：根据具体情况，对溶解氧进行调节控制；溶解氧的控制：根据具体情况，对溶解氧进行调节控制；25产酶工艺条件及其调节控制产酶工艺条件及其调节控制保藏细胞保藏细胞细胞活化细胞活化细胞扩大培养细胞扩大培养产酶产酶分离纯化分离纯化酶酶无菌空气无菌空气培养基培养基原生质体原生质体固定化原生质体固定化原生质体固定化细胞固定化细胞预培养预培养酶生产的工艺流程26细胞活化与扩大培养细胞活化与扩大培养 将保藏的细胞接种于新鲜的培养基上，在一定的条件下进将保藏的细胞接种于新鲜的培养基上，在一定的条件下进行培养，使细胞的生命活性得以恢复的过程。行培养，使细胞的生命活性得以恢复的过程。条件：适合细胞生长

16、、繁殖的最适条件条件：适合细胞生长、繁殖的最适条件时间控制：培养到细胞对数生长期为宜时间控制：培养到细胞对数生长期为宜种子量：接入下一级种子扩大培养或接入发酵罐的种种子量：接入下一级种子扩大培养或接入发酵罐的种子量一般为下一级工序培养基总量的子量一般为下一级工序培养基总量的1%-10%1%-10%27产酶工艺条件的优化与调节控制产酶工艺条件的优化与调节控制1、pH的优化与调节控制的优化与调节控制2、温度的优化与调节控制、温度的优化与调节控制3、溶解氧的优化与调节控制、溶解氧的优化与调节控制（1）调节通气量）调节通气量（2）调节氧的分压）调节氧的分压（3）调节气液接触时间）调节气液接触时间（4）

17、调节气液接触面积）调节气液接触面积（5）改变培养液的性质：黏度）改变培养液的性质：黏度28提高酶产量的措施提高酶产量的措施添加诱导物：添加诱导物：酶的作用底物、酶的反应产物、酶的底物类似物酶的作用底物、酶的反应产物、酶的底物类似物控制阻遏物浓度控制阻遏物浓度表面活性剂表面活性剂添加产酶促进剂添加产酶促进剂29添加诱导物添加诱导物能使某些酶的生物合成开始或加速进行的物质。能使某些酶的生物合成开始或加速进行的物质。酶的作用底物：（诱导酶）大肠杆菌在含乳糖的培养基中酶的作用底物：（诱导酶）大肠杆菌在含乳糖的培养基中能大量合成能大量合成-半乳糖苷酶半乳糖苷酶酶的反应产物：纤维二糖诱导纤维素酶的生物合成

18、。酶的反应产物：纤维二糖诱导纤维素酶的生物合成。酶作用底物的类似物：异丙基酶作用底物的类似物：异丙基-硫代半乳糖苷对硫代半乳糖苷对-半半乳糖苷酶的诱导效果比乳糖高几百倍。乳糖苷酶的诱导效果比乳糖高几百倍。30控制阻遏物的浓度控制阻遏物的浓度产物阻遏：由酶催化作用的产物或代谢途径的末端产物产物阻遏：由酶催化作用的产物或代谢途径的末端产物 引起的阻遏作用。引起的阻遏作用。分解代谢物阻遏：有分解代谢物（如葡萄糖或其他容易分解代谢物阻遏：有分解代谢物（如葡萄糖或其他容易 利用的碳源等物质经过分解代谢而产生的物利用的碳源等物质经过分解代谢而产生的物 质）引起的阻遏作用。质）引起的阻遏作用。无机磷酸无机磷

19、酸1.0 mmol/L1.0 mmol/L碱性磷酸酶碱性磷酸酶合成受阻合成受阻碱性磷酸酶碱性磷酸酶大量合成大量合成控制碳源浓度、添加一定量的环腺苷酸控制碳源浓度、添加一定量的环腺苷酸减少减少解除解除阻遏物阻遏物是能够引起某些酶的生物合成停止或者减速的物质。是能够引起某些酶的生物合成停止或者减速的物质。31添加表面活性剂添加表面活性剂细胞膜高度细胞膜高度的选择透性的选择透性表面活表面活性剂性剂增加细增加细胞的透胞的透过性过性利于胞外利于胞外酶分泌酶分泌酶产量酶产量4、添加产酶促进剂、添加产酶促进剂产酶促进剂是指可以促进产酶，但作用机理未阐明清楚的物质。产酶促进剂是指可以促进产酶，但作用机理未阐明

20、清楚的物质。324、酶的分离纯化、酶的分离纯化由于酶不稳定，在提取时容易变性失活，因而在提取时要注意：由于酶不稳定，在提取时容易变性失活，因而在提取时要注意：温度：尽可能在低温（温度：尽可能在低温（0-40-4）进行，防止变性失活或蛋白水解酶对目的酶的）进行，防止变性失活或蛋白水解酶对目的酶的破坏作用破坏作用PHPH值：提取过程中一般采用缓冲液作为溶剂，防止过酸或过碱；值：提取过程中一般采用缓冲液作为溶剂，防止过酸或过碱；盐浓度：选用合适浓度盐溶液以促进蛋白溶解；盐浓度：选用合适浓度盐溶液以促进蛋白溶解；搅拌：剧烈搅拌容易引起蛋白质变性；搅拌：剧烈搅拌容易引起蛋白质变性；微生物对酶的破坏：尽可

21、能防止微生物对酶的破坏。微生物对酶的破坏：尽可能防止微生物对酶的破坏。33酶的纯度和酶活力酶的纯度和酶活力酶纯化的过程中，每一步骤都要进行酶活性和比活性的测定，酶纯化的过程中，每一步骤都要进行酶活性和比活性的测定，这样才知道所需的酶在哪一个部分，也才可以用来比较酶的这样才知道所需的酶在哪一个部分，也才可以用来比较酶的纯度。酶的纯度可用酶的纯度。酶的纯度可用酶的比活力比活力来衡量，来衡量，比活力是以每毫克比活力是以每毫克蛋白质所具有的酶活力单位蛋白质所具有的酶活力单位。一般情况下，酶的比活力随酶。一般情况下，酶的比活力随酶纯度的提高而提高。纯度的提高而提高。34酶制剂的保存酶制剂的保存温度温度缓

22、冲液缓冲液氧化氧化/ /还原还原蛋白质的浓度及纯度蛋白质的浓度及纯度355、酶分子的改造、酶分子的改造酶应用存在的问题：酶应用存在的问题：（1 1）不稳定、易变性：酶作用的最适）不稳定、易变性：酶作用的最适PHPH条件一般在中性，条件一般在中性，PHPH值常偏离中性范值常偏离中性范围，使酶难于发挥作用；围，使酶难于发挥作用；（2 2）具有抗原性：在临床应用上，由于绝大多数的酶对人体而言都是外源蛋）具有抗原性：在临床应用上，由于绝大多数的酶对人体而言都是外源蛋白质，具有抗原性，直接注入会引起人体的过敏反应。白质，具有抗原性，直接注入会引起人体的过敏反应。解决方法：改变现有酶特性：解决方法：改变现

23、有酶特性：（1 1）通过分子修饰的方法来改变已分离出来的天然酶结构；）通过分子修饰的方法来改变已分离出来的天然酶结构；（2 2）通过生物工程方法改造编码分子的基因从而达到改造酶的目的。）通过生物工程方法改造编码分子的基因从而达到改造酶的目的。36酶分子修饰酶分子修饰酶分子修饰是指通过主酶分子修饰是指通过主链的剪接切割和侧链的链的剪接切割和侧链的化学修饰对酶分子进行化学修饰对酶分子进行改造，改造的目的在于改造，改造的目的在于改变酶的一些性质，创改变酶的一些性质，创造出天然酶不具备的某造出天然酶不具备的某些优良性状，扩大酶的些优良性状，扩大酶的应用以达到较高的经济应用以达到较高的经济效益效益37酶

24、的蛋白质工程酶的蛋白质工程酶的蛋白质工程是指通过基因工程或随机诱变的方式改变编码酶蛋酶的蛋白质工程是指通过基因工程或随机诱变的方式改变编码酶蛋白分子的白分子的DNADNA序列，从而达到改变酶的生理、生化特性的技术。序列，从而达到改变酶的生理、生化特性的技术。（1 1）对于一些功能和特性仅仅有蛋白质一级结构中某些氨基酸残）对于一些功能和特性仅仅有蛋白质一级结构中某些氨基酸残基的化学性质决定的酶，可通过基因工程技术直接改变或消除这些基的化学性质决定的酶，可通过基因工程技术直接改变或消除这些侧链来改变原有酶的有关功能或特性；侧链来改变原有酶的有关功能或特性；（2 2）随机诱变编码酶蛋白的基因，然后进

25、行定向的筛选和选择。）随机诱变编码酶蛋白的基因，然后进行定向的筛选和选择。38酶蛋白质工程的策略酶蛋白质工程的策略p分子裁减分子裁减 p定点突变定点突变 p对随机诱变的基因库进行定向的筛选和选择对随机诱变的基因库进行定向的筛选和选择 p杂交酶（杂交酶（hybridenzymehybridenzyme） n 利用高度同源的酶之间的杂交利用高度同源的酶之间的杂交 n 创造具有新活性的杂交酶创造具有新活性的杂交酶 39举例举例|枯草杆菌蛋白酶：枯草杆菌蛋白酶：功能：功能：分解蛋白质，可用于去掉衣服分解蛋白质，可用于去掉衣服上的血渍。上的血渍。缺点：缺点：在漂白剂的作用下失活（在漂白剂的作用下失活（2

26、22222位的甲硫氨酸易被氧化）。位的甲硫氨酸易被氧化）。改造：改造：用丝氨酸或丙氨酸代替其用丝氨酸或丙氨酸代替其222222位的甲硫氨酸，抗氧化能力大大提高。位的甲硫氨酸，抗氧化能力大大提高。406、酶的固定化、酶的固定化酶的固定化：指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能酶的固定化：指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复使用。连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复使用。目的：使酶既具有催化性质，又能回收反复使用，在生目的：使酶既具有催化性质，又能回收反复使用，在生产工艺上可以实现连续化和自动化。产工艺上可以实现连续化和自动化。分类：酶的固定化和细胞的固定化。

27、分类：酶的固定化和细胞的固定化。41固定化酶固定化酶水溶性酶水溶性酶水不溶性载体水不溶性载体水不溶性酶水不溶性酶（固定化酶）（固定化酶）固定化技术固定化技术42固定化酶的特点：固定化酶的特点：优点：优点：固定化过程中往往会引起酶的失活.缺点缺点： 不溶于水，易于与产物离； 可反复使用； 可连续化生产； 稳定性好。43(1)吸附法：可分为物理吸附法和 离子吸附法。EEEE酶的固定化方法酶的固定化方法物理吸附法：物理吸附法：这是酶通过氢键、疏水键等作用力通过氢键、疏水键等作用力物理吸附于不溶性载体的一种固定化方法。离子结合法：离子结合法：酶通过离子键离子键结合于具有离子交换基的水不溶性载体的固定化

28、方法。离子交换剂的吸附容量一般大于物理吸附剂。44(2)(2)包埋法：包埋法：常用的包埋剂有聚丙 烯酰胺、卡拉胶、淀粉凝胶、 三醋酸纤维素、海藻酸、胶原、 血纤维和大豆蛋白等。EEEE451、凝胶包埋法（胶格包埋法）（网格型） 将酶分子包埋在高聚物网格高聚物网格内的包埋方法。n聚丙烯酰胺包埋聚丙烯酰胺包埋是最常用的包埋法 n K-角叉莱胶n海藻酸钠、胶原和明胶也是常用的包埋载体。 462、微囊化包埋法（微囊型）微囊法主要将酶封装在胶囊、脂质体胶囊、脂质体中。微囊型固定化酶通常是直径为几微米到几百微米的球状体，颗粒比网格型要小得多，比较有利于底物和产物扩散，但是反应条件要求高，制备成本也高。胶囊

29、和脂质体主要用于医学治疗。作为膜材料的高聚物有硝酸纤维素、聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯等。47n包埋法优点：一般不需要与酶蛋白的氨基酸残基进行结合反应，很少改变酶的高级结构，酶活回收率较高可进行大量的固定化；包埋膜可选用生物相容材料，并可做成任意大小 n包埋法缺点：在发生化学聚合反应时包埋，酶容易失活包埋法只适合作用于小分子底物和产物的酶，不适用于柱系统 48(3)(3)酶以共价键结合于载体的固定化方法，即将酶分子上非活性部位功能团与载体表面反应基团进行共价结合的方法。EEEE49n共价结合法优点：共价结合法优点： 载体与酶偶联的方法多样化；酶与载体结合牢固，一般不会因底物浓度高或存在盐类等原因

30、而轻易脱落。n共价结合法缺点：共价结合法缺点：反应条件苛刻，操作复杂偶联试剂对生命组织多有一定毒性 由于采用了比较激烈的反应条件，会引起酶蛋白高级结构变化，破坏部分活性中心（酶活回收率30左右）底物的专一性等酶的性质可能会发生变化50(4)(4)交联法：交联法：是使用双功能或多功能试剂与酶分子之间进行分子间的交联反应的固定化方法。此法与共价结合法一样也是利用共价键固定酶，所不同的是它不使用载体。EEEEEEE酶蛋白分子彼此交叉连接起来，形成网络结构酶蛋白分子彼此交叉连接起来，形成网络结构51n交联剂：形成希夫碱的戊二醛，形成肽键的异氰酸酯，发生重氮偶合反应的双重氮联苯胺或N,N-乙烯双马来亚胺

31、等。n参与交联反应的酶蛋白的功能基团：N-末端的-氨基、赖氨酸的-氨基、酪氨酸的酚基、半胱氨酸的巯基和组氨酸的咪唑基等。n交联法的优缺点：优点是操作简便。缺点：反应条件比较激烈，固定化的酶活回收率一般比较低，常出现扩散限制，使用有一定难度。尽可能降低交联剂浓度和缩短反应时间有利于固定化酶比活的提高。52图10-1 固定化酶的模式（a）离子结合；（b）共价结合；（c）交联；（d）聚合物包埋；（e）疏水相互作用；（f）脂质体包埋；（g）微胶囊； 53各类固定化方法的特点比较:固定化方法载体结合法交联法包埋法物理吸附法 离子结合法共价结合法制备难易易易难较难较难结合程度弱中等强强强酶活回收率高，但酶

32、易流失高低中等高对底物专一性不变不变可变可变不变再生可能可能不可能不可能不可能固定化费用低低高中等低545556细胞的固定化方法细胞的固定化方法细胞固定化是将完整细胞固定在载体上的技术，它免去了破碎细胞提取酶等步细胞固定化是将完整细胞固定在载体上的技术，它免去了破碎细胞提取酶等步骤，直接利用细胞内的酶，因而固定后酶活基本没有损失。骤，直接利用细胞内的酶，因而固定后酶活基本没有损失。包埋法：包埋法：将细胞包埋在多微孔载体内部制备固定化细胞的方法，可分为凝胶包将细胞包埋在多微孔载体内部制备固定化细胞的方法，可分为凝胶包埋法、纤维包埋法和微胶囊包埋法。埋法、纤维包埋法和微胶囊包埋法。吸附法：吸附法：

33、主要利用细胞与载体之间的吸引力（范德华力、离子键和氢键），使主要利用细胞与载体之间的吸引力（范德华力、离子键和氢键），使细胞固定在载体上。细胞固定在载体上。57固定化酶的性质固定化酶的性质酶活力的变化：活力比天然酶的活力低，专一性也可能发生变化。酶活力的变化：活力比天然酶的活力低，专一性也可能发生变化。酶稳定性提高：稳定性包括热稳定性、对各种有机试剂的稳定性、对酶稳定性提高：稳定性包括热稳定性、对各种有机试剂的稳定性、对PHPH稳定性、稳定性、对蛋白水解酶的抗性及储存稳定性等。对蛋白水解酶的抗性及储存稳定性等。最适最适PHPH值的变化：催化底物的最适值的变化：催化底物的最适PHPH值和值和PH

34、PH活性曲线常发生变化，原因是微环活性曲线常发生变化，原因是微环境表面电荷的影响。境表面电荷的影响。最适温度的变化：一般情况下，固定化后酶失活速度下降，最适温度也随之提最适温度的变化：一般情况下，固定化后酶失活速度下降，最适温度也随之提高。高。动力常数的变化。动力常数的变化。58固定化酶的指标固定化酶的指标相对酶活力：相对酶活力：具有相同酶蛋白量的固定化酶与游离酶活力的比值称为相对具有相同酶蛋白量的固定化酶与游离酶活力的比值称为相对酶活力，相对酶活力低于酶活力，相对酶活力低于75%75%的固定化酶，一般没有实际应用价值。的固定化酶，一般没有实际应用价值。酶的活力回收率：酶的活力回收率：固定化酶

35、的总活力与用于固定化的酶的活力百分比称为固定化酶的总活力与用于固定化的酶的活力百分比称为酶的活力回收率，一般情况下，活力回收率应小于酶的活力回收率，一般情况下，活力回收率应小于1.1.固定化酶的半衰期：固定化酶的半衰期：即固定化酶的活力下降到位初始活力一般所经历的时即固定化酶的活力下降到位初始活力一般所经历的时间。它是衡量固定化酶操作稳定性的关键间。它是衡量固定化酶操作稳定性的关键59酶反应器酶反应器以酶为催化剂进行反应所需的以酶为催化剂进行反应所需的设备称为设备称为酶反应器酶反应器。按酶状态可分：一类直接应用按酶状态可分：一类直接应用游离酶进行反应的游离酶进行反应的均相酶反应均相酶反应器器；

36、另一类应用固定化酶进行；另一类应用固定化酶进行反应的反应的非均相酶反应器非均相酶反应器。60酶反应器的基本类型酶反应器的基本类型 搅拌罐型反应器搅拌罐型反应器 其基本结构由容器、搅拌器及保温装置组成。有时也可在容器壁其基本结构由容器、搅拌器及保温装置组成。有时也可在容器壁上装上挡板，以促进反应物的混合。上装上挡板，以促进反应物的混合。间歇式搅拌罐间歇式搅拌罐连续式搅拌罐连续式搅拌罐多级连续搅拌罐多级连续搅拌罐61固定床型反应器固定床型反应器 把催化剂填充在固定床（填充床）中的反应器叫做固定床型反应器。 填充床（固定床）填充床（固定床） 带循环的固定床带循环的固定床 列管式固定床列管式固定床 6

37、2流化床型反应器流化床型反应器 流化床型反应器是一种装有较小颗粒的垂直塔式反应器。底物以一定的流速从下向上流过，使固定化酶颗粒在流体中维持悬浮状态并进行反应，这时的固定化颗粒和流体可以被看作是均匀混合的流体。 流化床型反应器63膜式反应器膜式反应器 膜反应器是利用膜的分离功能，同时完成反应和分离过程的反应器，包括用固定化酶膜组装的平板状或螺旋卷型反器、转盘反应器和空心酶管、中空纤维膜反应器等。 螺旋卷式生物膜反应器螺旋卷式生物膜反应器 搅拌罐搅拌罐- -超滤器联合装置超滤器联合装置6465电镜放大的中空纤维膜电镜放大的过滤膜孔径中空纤维膜丝66n膜的膜的4 4种主要功能：种主要功能：n载体功能

38、：固定化载体，生物活性的功能膜载体功能：固定化载体，生物活性的功能膜n分离功能：膜的多孔性、膜与组分物理化学作用分离功能：膜的多孔性、膜与组分物理化学作用的不同，选择性透过不同物质。的不同，选择性透过不同物质。n分隔功能：膜的两个表面将系统分隔成相关联的分隔功能：膜的两个表面将系统分隔成相关联的两个部分，可透过相关物质。两个部分，可透过相关物质。n复合功能：依靠复合技术制备出几层不同功能膜复合功能：依靠复合技术制备出几层不同功能膜组成的复合膜。组成的复合膜。67第二代酶反应器的主要类型第二代酶反应器的主要类型n 含辅因子的酶反应器n 两相或多相酶反应器n 固定化多酶反应器 酶反应器68酶反应器

39、的选择n考虑：酶形式、酶的反应动力学性质、底物和考虑：酶形式、酶的反应动力学性质、底物和产物的理化性质等产物的理化性质等n反应器尽可能具有结构简单、操作方便、易于反应器尽可能具有结构简单、操作方便、易于维护和清洗、维护和清洗、n可适用于多种酶的催化反应、制成成本和运行可适用于多种酶的催化反应、制成成本和运行成本较低等特点。成本较低等特点。69依据动力学性质选择反应器n酶与底物分子有效碰撞和结合酶与底物分子有效碰撞和结合反应系统混合反应系统混合均匀均匀搅拌罐式反应器、流化床式反应器。搅拌罐式反应器、流化床式反应器。n高浓度底物对酶抑制高浓度底物对酶抑制流加分批罐式反应器、流加分批罐式反应器、填充

40、床式反应器、流化床式反应器等填充床式反应器、流化床式反应器等n产物抑制酶反应产物抑制酶反应膜反应器、填充床式反应器。膜反应器、填充床式反应器。n耐高温酶耐高温酶喷射式反应器。喷射式反应器。70根据底物或产物的理化性质选择反应器n底物和产物的理化性质直接影响酶催化反应速率底物和产物的理化性质直接影响酶催化反应速率n底物或产物的分子质量、溶解性、粘度等性质对反底物或产物的分子质量、溶解性、粘度等性质对反应器的选择有重要影响。应器的选择有重要影响。p（1 1）反应底物或产物分子质量较大时）反应底物或产物分子质量较大时，不宜采用膜，不宜采用膜反应器。反应器。p（2 2）底物或产物溶解度低、粘度高时）底

41、物或产物溶解度低、粘度高时，选择搅拌罐，选择搅拌罐式反应器，不采用填充床式反应器和膜式反应器。式反应器，不采用填充床式反应器和膜式反应器。p（3 3）底物为气体时，选择鼓泡式反应器。）底物为气体时，选择鼓泡式反应器。p（4 4）小分子物质作为辅酶的催化反应，不选膜反应）小分子物质作为辅酶的催化反应，不选膜反应器，以免辅酶的流失。器，以免辅酶的流失。71酶反应器使用中应注意的问题n酶的稳定性对酶反应器的功效是很重要的酶的稳定性对酶反应器的功效是很重要的。在操作过程中，有时需要用酸或。在操作过程中，有时需要用酸或碱来调节反应液碱来调节反应液pHpH。如果局部的。如果局部的pHpH过高或过低，就会引

42、起酶的失活，或者使过高或过低，就会引起酶的失活，或者使底物和产物发生水解反应。这时，可用加快搅拌已促使混合均匀。底物和产物发生水解反应。这时，可用加快搅拌已促使混合均匀。n如果底物和产物在反应器中不够稳定的话，可以采用高浓度的酶，以减少底如果底物和产物在反应器中不够稳定的话，可以采用高浓度的酶，以减少底物和产物在反应器中的停留时间，从而减少损失物和产物在反应器中的停留时间，从而减少损失n防止防止微生物污染微生物污染n酶反应器操作中，生产能力逐渐降低，主要原因是酶反应器操作中，生产能力逐渐降低，主要原因是固定化酶活性降低或损失固定化酶活性降低或损失。造成固定化酶活性损失的原因：造成固定化酶活性损

43、失的原因：q（1 1）酶本身的失活；）酶本身的失活；q（2 2）酶从载体上脱落；）酶从载体上脱落；q（3 3）载体的破碎或溶解。）载体的破碎或溶解。7273甲生物甲生物乙生物乙生物取出优取出优秀基因秀基因“剪切剪切”“拼接拼接”新类型新类型表达表达新的生物产品新的生物产品基基因因敲敲除除技技术术转转基基因因技技术术生物生物新类型新类型敲敲除除不不利利基基因因新的生物产品新的生物产品二、基因工程技术二、基因工程技术74基因操作的工具基因操作的工具、基因的剪刀、基因的剪刀限制性内切酶（限制酶）限制性内切酶（限制酶）一种限制酶只能一种限制酶只能识别一种特定的核苷识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的酸

44、序列，并在特定的切割点上将切割点上将DNA DNA 分子分子切断。切断。限制性内切酶ECOR75767778黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端79黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端802、“分子缝合针” DNA连接酶n催化磷酸二酯键形成催化磷酸二酯键形成818283843、“分子运输车” 基因进入受体细胞的运载体运载体需要的条件：常用运载体： 细菌的质粒 噬菌体或某些动植物病毒8586基因操作的基本步骤基因操作的基本步骤、提取目的基因、提取目的基因将将需要的基因从供体生物需要的基因从供体生物的细胞内提取出来。的细胞内提取出来。供体生物细胞供体生物细胞取出取出DNADNA用限制酶剪用限制酶剪去多余部

45、分去多余部分目的基因目的基因限制酶限制酶87提取目的基因的方法提取目的基因的方法用限制酶切用限制酶切断成许多片段断成许多片段直接分离基因直接分离基因鸟枪法鸟枪法88人工合成基因法人工合成基因法DNADNA合成仪合成仪逆转录法：以信使逆转录法：以信使RNARNA为模板，在逆转录酶为模板，在逆转录酶的作用下将脱氧核苷酸合的作用下将脱氧核苷酸合成合成成合成DNA(DNA(基因基因) )。直接合成法：根据直接合成法：根据蛋白质的氨基酸顺序推算蛋白质的氨基酸顺序推算出信使出信使RNARNA核苷酸顺序，核苷酸顺序，再据此推算出基因再据此推算出基因DNADNA的的脱氧核苷酸顺序。用游离脱氧核苷酸顺序。用游离

46、脱氧核苷酸直接合成相应脱氧核苷酸直接合成相应的基因。的基因。892 2、目的基因与运载体结合、目的基因与运载体结合903 3、将目的基因导入受体细胞并使之扩增、将目的基因导入受体细胞并使之扩增导入导入扩增扩增要让目的基因表达，必要让目的基因表达，必须将它导入受体细胞并进行须将它导入受体细胞并进行扩增。扩增。为获得目的基因的表达为获得目的基因的表达产物时，通常以大肠杆菌等产物时，通常以大肠杆菌等无害易得的细菌为受体。为无害易得的细菌为受体。为改进某种生物时，将欲改进改进某种生物时，将欲改进的生物细胞为受体。的生物细胞为受体。91将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞转化转化目的基因进入目的

47、基因进入_内，并且在内，并且在 受体细胞内维持受体细胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达92方法方法导入植物细胞导入植物细胞导入动物细胞导入动物细胞导入微生物细胞导入微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法 感受态细胞吸收感受态细胞吸收 DNADNA分子分子将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞93 4 4、目的基因的检测和表达、目的基因的检测和表达为保证目的基因得到有效利用，通常用大量的受体细为保证目的基因得到有效利用，通常用大量的受体细胞来接受不多的目的基因。这样，处理的受体细胞中胞来接受不多的目的基因。这

48、样，处理的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少，必须将它从中检测出来。真正摄入了目的基因的很少，必须将它从中检测出来。无表达产物无表达产物无表达产物无表达产物有表达产物有表达产物无表达产物无表达产物94多细胞生物的检测，将每个受体细胞单独培多细胞生物的检测，将每个受体细胞单独培养并诱导发育成完整个体，检测这些个体是否摄养并诱导发育成完整个体，检测这些个体是否摄入目的基因，摄入的基因是否表达（是否表现出入目的基因，摄入的基因是否表达（是否表现出相应的性状）。淘汰无变化的个体，保留有相应相应的性状）。淘汰无变化的个体，保留有相应变化的个体进一步培养、研究。变化的个体进一步培养、研究。95供 体 细

49、胞目 的 基 因载 体重 组 D N A 分 子转 化 细 胞受 体 细 胞多 肽 药 物疫 苗 、 抗 体基 因 治 疗基 因 诊 断 转 基 因 动 物(畜 牧 业 、 渔 业 生 物 反 应 器 )转 基 因 植 物(农 业 、 林 业 生 物 反 应 器 )冶 金 、 环 保轻 工 、 食 品96抗虫转基因植物利用转基因改良植物品质抗逆转基因植物抗病转基因植物转基因作物97虫害杀虫基因t毒蛋白基因；淀粉酶抑制基因；植物凝集素基因。环境污染、损害健康、增加成本。农药抗虫转基因植物抗虫植物98抗病转基因植物抗病基因病毒外壳蛋白基因；病毒复制酶基因；几丁质酶基因；抗毒素合成基因。花叶病 99

50、抗逆转基因植物抗盐碱、干旱基因。干旱调节细胞渗透压盐碱地涝灾抗盐碱、抗旱、耐寒、抗除草剂。100利用转基因改良植物品质食品营养食品营养不均衡不均衡富含氨基酸的蛋白质编码基因赖氨酸含量提高30%。豆类：蛋氨酸少。大麦、玉米、小麦：赖氨酸少。101控制成熟的基因番茄延熟番茄与植物花青素代谢有关的基因102转基因动物提高动物生长速度外源生长基因103用于改善畜产品品质牛奶：乳糖不能完全消化、或有过敏症状。乳糖酶基因转基因牛分泌的乳汁：其他营养成分不变，乳糖含量降低。104通过研究通过研究“基因基因敲除敲除”的耗子将帮助的耗子将帮助研究人类的癌症、糖研究人类的癌症、糖尿病和高血压等慢性尿病和高血压等慢

51、性疾病与遗传的关系。疾病与遗传的关系。 转基因羊转基因羊具有生长快、具有生长快、毛质、肉质好、疾毛质、肉质好、疾病少及耐粗饲料等病少及耐粗饲料等优点。优点。105导入贮藏蛋白基因的超级羊和超级小鼠导入贮藏蛋白基因的超级羊和超级小鼠导入人基因具特殊用途的猪和小鼠导入人基因具特殊用途的猪和小鼠超级超级动物动物特殊特殊动物动物106在猴子的未受精卵在猴子的未受精卵中加入附加基因，并利中加入附加基因，并利用它成功培育出健康活用它成功培育出健康活泼的小猴泼的小猴“安迪安迪”。通过对通过对“安迪安迪”的的研究我们可以简单地引研究我们可以简单地引进如老年性痴呆病的基进如老年性痴呆病的基因、帕金森病基因等，因

52、、帕金森病基因等，加快针对这类疾病疫苗加快针对这类疾病疫苗的开发研究。的开发研究。 107我国生产的部分基因我国生产的部分基因工程疫苗和药物工程疫苗和药物u基因工程药品的生产基因工程药品的生产许多药品的生产是从生物组织中提取的。受材料来源限制产量有限，其价格往往十分昂贵。基因工程技术是将生物合成相应药物成分的基因导入微生物细胞内，让它们产生相应的药物，不但能解决产量问题，还能大大降低生产成本。2.基因工程的成果与发展前景108胰岛素从猪、牛等动物的胰胰岛素从猪、牛等动物的胰腺中提取，腺中提取，1000Kg1000Kg胰腺只能提取胰腺只能提取4-5g4-5g的胰岛素，其产量之低和价的胰岛素，其产

53、量之低和价格之高可想而知。格之高可想而知。将合成的胰岛将合成的胰岛素基因导入大肠杆素基因导入大肠杆菌，每菌，每2000L2000L培养液培养液就能产生就能产生100g100g胰岛胰岛素！使其价格降低素！使其价格降低了了30%-50%!30%-50%!109从人血中提取干扰素，300L血才提取1mg！通过基因工程的方式创造了能合成人干扰素的大肠杆菌，每1L的培养液可提取204mg干扰素人造血液及其生产人造血液及其生产110基因诊断与基因治疗基因诊断与基因治疗运用基因工程设运用基因工程设计制造的计制造的“DNADNA探针探针”检测肝炎病毒等病毒检测肝炎病毒等病毒感染及遗传缺陷，不感染及遗传缺陷，不但准确而且迅速。但准确而且迅速。我国研究人员正在制备用于基因我国研究人员正在制备用于基因治疗的基因工程细胞治疗的基因工程细胞通过基因工程给通过基因工程给患有遗传病的人体内患有遗传病的人体内导入正常基因可导入正常基因可“一一次性次性”解除病人的疾解除病人的疾苦。苦。111(3)(3)、基因工程与环境保护、基因工程与环境保护u环境监测：环境监测：基