第三章 基因工程载体

1、第三章第三章 基因工程载体基因工程载体vectors在基因工程操作中，把能携带外源在基因工程操作中，把能携带外源DNADNA进入受体进入受体细胞的细胞的DNADNA分子叫载体。分子叫载体。1.1.载体载体 （VectorsVectors） （1 1）在宿主细胞内能独立稳定复制。）在宿主细胞内能独立稳定复制。 （2 2）有选择性标记基因。）有选择性标记基因。（3 3）具有合适的限制性内切酶的位点。）具有合适的限制性内切酶的位点。2. 2. 基因工程的载体必须具备的基因工程的载体必须具备的3 3个基本条件个基本条件外源外源DNADNA插入其中不影响载体的复制。插入其中不影响载体的复制。 基因工程中

2、常用的载体有基因工程中常用的载体有5 5类：类： 3. 3. 载体的种类载体的种类质粒（质粒（plasmidplasmid）单链单链DNADNA噬菌体噬菌体M13M13 噬菌体的衍生物噬菌体的衍生物柯斯质粒（柯斯质粒（cosmidcosmid）动物病毒（动物病毒（virusvirus） 4. 4. 载体的功能载体的功能第一节第一节 质粒载体质粒载体 一、质粒（一、质粒（plasmidplasmid）是独立于染色体以外的能自主复制的是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状双链闭合环状DNADNA分子。分子。存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。大肠杆菌大

3、肠杆菌的质粒的质粒（1 1）分子小：）分子小：1. 1. 质粒的一般生物学特性质粒的一般生物学特性1 1200 kb200 kb（2 2）编码基因少：编码基因少：最少的编码最少的编码2 23 3个中等大小的蛋白质。个中等大小的蛋白质。（3 3）环形状：）环形状：双链环状双链环状DNADNA。（酵母的（酵母的“杀伤质粒杀伤质粒”是是RNARNA）。）。如抗菌素抗性、代谢特征等，赋予细菌一些如抗菌素抗性、代谢特征等，赋予细菌一些额外的特性（非必须）。额外的特性（非必须）。（4 4）质粒的空间构型：）质粒的空间构型： 共价闭合环状共价闭合环状DNA (DNA (Covalent close circ

4、ular DNA)呈超螺旋（呈超螺旋（SCSC）（）（super coilsuper coil） 线形线形DNA DNA （ linear ，L DNA）一条链上有一至数个缺口。一条链上有一至数个缺口。 开环开环DNADNA（ open circular， OC DNA）（5）质粒空间构型与电泳速率）质粒空间构型与电泳速率同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同：迁移率不同：scDNA最快、最快、L DNA次之、次之、ocDNA最慢。最慢。SCOCL（6 6）质粒的不相容性）质粒的不相容性任何两种含有任何两种含有相似复制子相似复制子结构的不同质粒，

5、结构的不同质粒，在没有选择压力的前提下，不能同时存在于一个在没有选择压力的前提下，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质粒组成性的质粒组成不相容性群。不相容性群。以大肠杆菌的质粒为例：以大肠杆菌的质粒为例：ColE1派生或派生或pMB1派生的质粒拥有相似的复制子结构，派生的质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容彼此不相容pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容拥有相似的复制子结构，彼此不相容p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容质粒的不相容性的分子机制

6、：质粒的不相容性的分子机制：两种含有两种含有不同复制子不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受结构的不同质粒，在复制时各受自己的拷贝数控制系统的自己的拷贝数控制系统的调节调节，致使两种质粒的最终，致使两种质粒的最终拷贝数恒定拷贝数恒定，因此在经过若干复制周期和细胞分裂周，因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内。期后仍能共处于同一细胞内。两种含有两种含有相似复制子相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到结构的不同质粒，在复制时受到同一种拷贝数控制系统的同一种拷贝数控制系统的干扰干扰，致使两种质粒的最终，致使两种质粒的最终拷贝数不同拷贝数不同，其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂，其

7、中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势。周期中更具优势。二、质粒的类型二、质粒的类型在大肠杆菌中的质粒，在大肠杆菌中的质粒，根据质粒是否携带控制根据质粒是否携带控制细菌配对细菌配对和和质粒接合转移的基因，质粒接合转移的基因，可以分为：可以分为：接合型质粒接合型质粒: :非接合型质粒：非接合型质粒：能自我转移能自我转移不能自我转移不能自我转移质粒的迁移作用质粒的迁移作用：由共存的接合型质粒引发的：由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移。非接合型质粒的转移。质粒转移性质粒转移性质质粒粒的的迁迁移移作作用用除了带有自我除了带有自我复制复制所必需的遗传信息外，还带所必需的遗传信息外，还带有

8、一套控制细菌有一套控制细菌配对配对和质粒和质粒接合转移接合转移的基因。的基因。如：如：F质粒（性质粒、或质粒（性质粒、或F因子）：因子）：甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。原先不存在该质粒的受体菌中。1. 接合型质粒：接合型质粒：不符合基因工程的安全要求。不符合基因工程的安全要求。不符合基因工程的安全要求：不符合基因工程的安全要求：2. 非接合型质粒：非接合型质粒：虽然带有自我虽然带有自我复制复制所必需的遗传信息，但失去了控所必需的遗传信息，但失去了控制细菌配对和质粒接合制细菌配对和质粒接合转移转移的基因，的基因，因此不

9、能从一因此不能从一个细胞转移到另一个细胞。个细胞转移到另一个细胞。（1）R质粒（抗性质粒）：质粒（抗性质粒）：带有一种或数种带有一种或数种抗生素抗性基因抗生素抗性基因，使寄主获得同样，使寄主获得同样的抗生素抗性性状（的抗生素抗性性状（resistance）。）。符合基因工程的安全要求。符合基因工程的安全要求。带有控制带有控制大肠杆菌素大肠杆菌素（colicin）合成的基因。）合成的基因。（2）Col质粒：质粒：大肠杆菌素对不带大肠杆菌素对不带Col质粒的大肠杆菌有毒。质粒的大肠杆菌有毒。Col质粒或质粒或R质粒如果带有转移基因，也可以质粒如果带有转移基因，也可以成为接合型质粒。成为接合型质粒。

10、三、质粒的复制类型三、质粒的复制类型1. 严紧型质粒（严紧型质粒（stringent plasmid）拷贝数少拷贝数少，只有，只有13份拷贝。份拷贝。2. 松弛型质粒（松弛型质粒（relaxed plasmid）拷贝数多拷贝数多，有，有10200份拷贝。份拷贝。（接合型质粒分子量大，一般属严紧型）。（接合型质粒分子量大，一般属严紧型）。（非接合型质粒分子量小，一般属松弛型）。（非接合型质粒分子量小，一般属松弛型）。（1）分子量大，拷贝数低）分子量大，拷贝数低四、质粒载体的构建四、质粒载体的构建1. 天然质粒的局限性天然质粒的局限性第一个用于基因克隆的天然质粒第一个用于基因克隆的天然质粒pSC1

11、01，分，分子长子长 9.1 kb，在寄主中的拷贝数为，在寄主中的拷贝数为12。Tetr 作为筛选标志。作为筛选标志。EcoR I 只有一个切点只有一个切点可充当克隆位点。可充当克隆位点。ColE1质粒的筛选标志是质粒的筛选标志是大肠杆菌素大肠杆菌素E1（colicin E1）。）。colicin E1能杀死不含能杀死不含ColE1 质粒的菌，形质粒的菌，形成成“噬菌斑噬菌斑”。（2）筛选标志不理想）筛选标志不理想可以通过可以通过插入失活筛选插入失活筛选。但细菌群体容易自。但细菌群体容易自发突变出抗发突变出抗colicin E1的细胞。的细胞。唯一的酶切位点唯一的酶切位点 EcoR I 正好位

12、于这个基因正好位于这个基因的内部。的内部。（1） 具有复制起点（具有复制起点（ORI），缺失），缺失mob基因基因2. 2. 理想质粒载体必须具备的基本条件理想质粒载体必须具备的基本条件（2）具有两种以上的选择标记基因）具有两种以上的选择标记基因（3）若干限制性内切酶的单一位点：）若干限制性内切酶的单一位点：是筛选的标志。理想的载体应该有两种以上的是筛选的标志。理想的载体应该有两种以上的抗菌素抗性基因。抗菌素抗性基因。用来插入外源用来插入外源DNA片断。且插入后不影响复制片断。且插入后不影响复制功能。功能。（4 4）具有较小的分子量和较高的拷贝数。）具有较小的分子量和较高的拷贝数。（5 5）插

13、入外源基因的重组质粒较易导入宿主细胞并）插入外源基因的重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达。复制和表达。氨苄青霉素抗性（氨苄青霉素抗性（Ampr）卡那霉素抗性卡那霉素抗性 （Kanr）四环素抗性四环素抗性 （Tetr）链霉素抗性链霉素抗性 （Strr）氯霉素抗性氯霉素抗性 （Cmlr）3. 质粒的选择标记及其工作原理：质粒的选择标记及其工作原理：（1）选择标记）选择标记绝大多数质粒载体都是用抗菌素抗性标记：绝大多数质粒载体都是用抗菌素抗性标记：i）氨苄青霉素（）氨苄青霉素（ampicillin，Amp）青霉素的衍生物。青霉素的衍生物。通过干扰细菌细胞壁合成的末端反应，通过干扰细菌细胞壁合成的末

14、端反应，杀死杀死生长的细菌生长的细菌。a）抑菌原理）抑菌原理b）细菌抗性原理）细菌抗性原理Ampr基因编码基因编码 -内酰胺酶内酰胺酶，特异地切割，特异地切割氨苄青霉素的氨苄青霉素的 -内酰胺环。内酰胺环。通过与通过与50S核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死的合成并阻止肽键的形成。杀死。b）细菌抗性原理）细菌抗性原理Cmlr 编码编码乙酰转移酶乙酰转移酶，特异地使氯霉素乙酰，特异地使氯霉素乙酰化而失活。化而失活。a）抑菌原理）抑菌原理a）杀菌原理）杀菌原理通过与通过与70S核糖体结合，导致核糖体结合，导致mRNA发生错发生错读。读。杀死细菌

15、杀死细菌。b）细菌抗性原理）细菌抗性原理Kanr 编码的编码的氨基糖苷磷酸转移酶氨基糖苷磷酸转移酶，对卡那霉，对卡那霉素进行修饰，阻断其与核糖体结合作用。素进行修饰，阻断其与核糖体结合作用。a）杀菌原理）杀菌原理通过与通过与30S核糖体亚基结合，导致核糖体亚基结合，导致mRNA错错译。译。杀死细菌杀死细菌。b）细菌抗性原理）细菌抗性原理Strr 编码一种编码一种氨基糖苷磷酸转移酶氨基糖苷磷酸转移酶对链霉素对链霉素进行修饰，阻断其与核糖体进行修饰，阻断其与核糖体30S亚基结合作亚基结合作用。用。b）细菌抗性原理）细菌抗性原理a）抑菌原理）抑菌原理通过于通过于30S核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质核

16、糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死的合成并阻止肽键的形成。杀死生长的细菌生长的细菌。Tetr 编码特异性蛋白质，对细菌的膜结构进行修编码特异性蛋白质，对细菌的膜结构进行修饰，组止四环素通过细胞膜进入细菌细胞内。饰，组止四环素通过细胞膜进入细菌细胞内。使受体菌发生遗传性状的改变的基因。使受体菌发生遗传性状的改变的基因。当带有当带有抗菌素抗性基因抗菌素抗性基因的的载体载体进入受体菌后，进入受体菌后，受体菌才能生长。受体菌才能生长。不带有不带有抗菌素抗性基因抗菌素抗性基因的受体菌不能在含有抗的受体菌不能在含有抗菌素的培养基（选择培养基）中生长。菌素的培养基（选择培养基）中生长。

17、（2 2）抗菌素选择原理）抗菌素选择原理活活死死抗性基因抗性基因抗菌素抗菌素（1）高拷贝数的质粒载体）高拷贝数的质粒载体ColE1、pMB1派生质粒派生质粒具有高拷贝数的特点。具有高拷贝数的特点。而且在没有菌体蛋白质合成的条件下（而且在没有菌体蛋白质合成的条件下（蛋白蛋白质合成抑制剂或氯霉素质合成抑制剂或氯霉素等存在下）仍能复制，等存在下）仍能复制，达到每个细胞的拷贝数达到每个细胞的拷贝数10003000个！个！适合：适合：大量增殖克隆基因或需要表达大量的基大量增殖克隆基因或需要表达大量的基因产物。因产物。（2）低拷贝数的质粒载体）低拷贝数的质粒载体 但有特殊用途但有特殊用途:由由pSC101

18、派生派生来的载体特点：来的载体特点：分子量小，分子量小，拷贝数低。拷贝数低。当有些被克隆的基因的表达产物过多时会严重地当有些被克隆的基因的表达产物过多时会严重地影响寄主菌的正常代谢活动，导致寄主菌死亡时，影响寄主菌的正常代谢活动，导致寄主菌死亡时，就需要低拷贝的载体。就需要低拷贝的载体。pLG338、pLG339、pHSG415等等不适合大量扩增不适合大量扩增DNA用。用。（3）失控的质粒载体）失控的质粒载体这是一类这是一类温度敏感型复制控制温度敏感型复制控制质粒。质粒。温度低温度低（低于（低于37 oC），拷贝数很少；），拷贝数很少；温度增加温度增加（40 oC）时，拷贝数会很快增加到）时，

19、拷贝数会很快增加到1000个以上。个以上。如如pBEU1、pBEU2。runaway plasmid vectors1979年年B. E. Uhlin等构建。等构建。（4 4） 插入失活型质粒载体插入失活型质粒载体载体的载体的克隆位点克隆位点位于其某一个选择性标记位于其某一个选择性标记基因内部基因内部。如：如：pDF41、pDF42、pBR329抗菌素抗性抗菌素抗性外源外源DNADNA无抗菌素抗性无抗菌素抗性正选择的质粒载体正选择的质粒载体如如pUR2、pTR262等。等。只有带有选择标记基因的转化菌细胞才能在选只有带有选择标记基因的转化菌细胞才能在选择培养基上择培养基上生长生长。直接选择转化

20、后的细胞。直接选择转化后的细胞。目前通用的绝大部分质粒载体都是正选择载体。目前通用的绝大部分质粒载体都是正选择载体。Direct selection vectors（6） 表达型质粒载体表达型质粒载体主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆的真核如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆的真核生物的基因置于大肠杆菌的转录生物的基因置于大肠杆菌的转录翻译信号控翻译信号控制之下。制之下。注意启动子的性质，终止子、起始密码、注意启动子的性质，终止子、起始密码、终止密码的阅读正确。终止密码的阅读正确。复制起始点复制起始点ORI、选择标记、选择标

21、记、多克隆位点多克隆位点MCS2）大肠杆菌操纵子元件）大肠杆菌操纵子元件阻遏基因阻遏基因 I操纵基因操纵基因O启动基因启动基因P核糖体结合位点序列（核糖体结合位点序列（SD）转录终止信号区。转录终止信号区。1）普通载体元件）普通载体元件 表达载体的结构表达载体的结构五、经典的大肠杆菌质粒载体五、经典的大肠杆菌质粒载体1. pSC101第一个成功地用于克隆实验的大肠杆菌质粒载体。第一个成功地用于克隆实验的大肠杆菌质粒载体。（1）类型）类型天然质粒，属低拷贝型。天然质粒，属低拷贝型。（2）长度）长度9.09 kb。（3）选择标记）选择标记四环素抗性四环素抗性Tetr6个克隆位点：个克隆位点：Eco

22、R I、Xho I、Pvu I、Hind III、BamH I、Sal I（其中（其中Hind III、BamH I、Sal I 3个位个位于选择标记于选择标记Tetr的内部）的内部）（4）克隆位点）克隆位点2. ColE1（1）类型）类型天然质粒，属天然质粒，属高拷贝高拷贝型。型。（2）长度）长度6.3 kb（3）选择标记）选择标记大肠杆菌素（大肠杆菌素（colicin）E1和对和对E1免疫的基因免疫的基因（immE1）特点：特点：在培养基中加入氯霉素抑制细菌蛋白质在培养基中加入氯霉素抑制细菌蛋白质合成后，质粒仍然能复制达到每个细胞合成后，质粒仍然能复制达到每个细胞1000-3000拷贝之多

23、！拷贝之多！ colicin E1基因的结构基因的结构ceaimmkil结构基因结构基因免疫基因免疫基因溶菌基因溶菌基因 杀死不含有杀死不含有ColE1细菌的原因细菌的原因cea + kilcea + kil基因产物基因产物 不被其他细菌的不被其他细菌的colicin E1所杀死的原因所杀死的原因immimm基因基因EcoR I位于位于E1内部，插入外源内部，插入外源DNA会导致会导致E1失活，使受体菌不能合成失活，使受体菌不能合成E1（ColE1-），但仍），但仍然表现出对然表现出对E1免疫型（免疫型（ImmE1+）。）。EcoR I（4 4）克隆位点）克隆位点Colicin E1外源外源D

24、NADNA无无Colicin用对外源用对外源colicin E1的免疫性和自身不能合的免疫性和自身不能合成成colicin E1作选择，操作非常繁杂。作选择，操作非常繁杂。对对colicin E1敏感的细菌群体中自发突变产敏感的细菌群体中自发突变产生抗生抗colicin E1的频率很高！的频率很高！（5）ColE1的选择缺陷的选择缺陷ColE1抗抗 colicinE1杀杀ColE1-仍抗仍抗 colicinE1不杀不杀ColE1-插入片断插入片断ColE1pSP2124质粒的质粒的Ampr基因基因3. pBR322：（1）元件来源）元件来源F. Bolivar和和R.L. Rodriguez人

25、工构建载体。人工构建载体。 复制起点复制起点 oripMB1系列（来源于系列（来源于ColE1）的）的高拷贝高拷贝型复制起点型复制起点 Ampr基因基因 Tetr基因基因pSC101的的Tetr 基因。基因。（2）长度）长度4363bp（3）选择标记）选择标记氨苄青霉素和四环素抗性氨苄青霉素和四环素抗性（4）克隆位点）克隆位点其中其中9个会导致个会导致Tetr基因失活（如基因失活（如BamH I、Hind 、Sal I）；）；3个会导致个会导致Ampr基因失活（基因失活（Sca I、PvuI、Pst I）。）。24个克隆位点。个克隆位点。（5）pBR322的优点的优点 双抗菌素抗性选择标记双抗

26、菌素抗性选择标记插入失活，分两次先后选择：插入失活，分两次先后选择：没有获得载体的寄主细胞没有获得载体的寄主细胞在在Amp或或Tet中中都都死亡。死亡。获得重组载体的寄主细胞获得重组载体的寄主细胞在在Amp或或Tet其中之一其中之一中死亡。中死亡。外源基因外源基因BamH IAmp中存活中存活但在但在Tet中死亡中死亡外源基因外源基因Pst ITet中存活中存活但在但在Amp中死亡中死亡氯霉素扩增之后，每个细胞可达氯霉素扩增之后，每个细胞可达10003000copy 安全安全失去了转移蛋白基因失去了转移蛋白基因mob（mobilization）。）。不能通过接合转移。不能通过接合转移。 高拷贝

27、数高拷贝数 分子小，克隆能力大分子小，克隆能力大载体越小越好。载体越小越好。10kb的的DNA在纯化过程中容易断裂。在纯化过程中容易断裂。保留了转移蛋白（保留了转移蛋白（mob）的）的作用位点（作用位点（nic）。能够被能够被ColK质粒编码的质粒编码的mob蛋白识别，如果再蛋白识别，如果再有有F质粒的参与，质粒的参与，就有可能转移！就有可能转移！ 删除删除mob识别位点识别位点（如质粒（如质粒pBR327、pAT153等）。等）。pAT153：从从pBR322上切去上切去HaeII片断，既除去了片断，既除去了mob识别位点，又增加质粒的拷贝数。识别位点，又增加质粒的拷贝数。（7）pBR322

28、的改进的改进pBR325：在在pBR322位点上接入一段来自噬菌体位点上接入一段来自噬菌体PICm的的HaeII酶切片断（带有氯霉素抗性基因酶切片断（带有氯霉素抗性基因cmlr）。）。cmlr上也带一个上也带一个EcoRI位点位点。使使EcoRI 也成为插入失活型位点。也成为插入失活型位点。 改造改造EcoR I 位点位点University of California的的J. Messing和和J. Vieria于于1987年，在年，在pBR322的基础上改造而成。的基础上改造而成。属正选择载体。属正选择载体。pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19 复制

29、起点复制起点pBR322的的 ori但失去了原来的克隆位点。但失去了原来的克隆位点。 Ampr 基因基因（1）元件来源）元件来源 lacZ的启动子的启动子大肠杆菌大肠杆菌 lacZ基因基因大肠杆菌大肠杆菌lacZ的的 -肽链序列，肽链序列， 是是LacZ 的氨基的氨基端片断端片断。pBR322的的Ampr基因基因（2 2）长）长 度度约约2.7kb（3 3）克隆位点）克隆位点10个连续的单一限制酶切位点，个连续的单一限制酶切位点，位于位于lacZ基因的基因的5端。端。Ampicillin 抗性抗性和和 lacZ的的 肽互补肽互补（蓝白斑）相（蓝白斑）相结合。结合。（4）选择标记）选择标记蓝白斑

30、选择原理：蓝白斑选择原理： X-gal（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl- -D-galactoside） -半乳糖苷酶半乳糖苷酶能把无色的化合物能把无色的化合物X-gal分解成分解成半乳糖和一个半乳糖和一个深蓝色深蓝色的物质的物质5-溴溴-4-氯靛蓝。氯靛蓝。X-gal半乳糖半乳糖5-溴溴-4-氯靛蓝氯靛蓝 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶X-gal显色反应：显色反应：lacZ的的 肽互补肽互补1） -肽（肽（ lacZ ）：）： -半乳糖苷酶半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断（端的一段氨基酸片断（11-41氨基酸）。氨基酸）。lacZ只有在只有在4聚体的状态下

31、才有功能聚体的状态下才有功能.C端大部分端大部分N端的端的11-41aaC端大部分端大部分N端的端的11-41aaC端大部分端大部分N端的端的11-41aaC端大部分端大部分N端的端的11-41aa4聚体聚体2）受体菌）受体菌lacZ突变（突变（lacZM15）受体菌基因组的受体菌基因组的 -半乳糖苷酶基因的氨基端有半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失（缺失缺失 肽肽），不能形成），不能形成4聚体的活性酶，聚体的活性酶，不能分解不能分解X-gal 受体菌株：受体菌株：JM系列系列、TG1、TG2、XL1-blue、XS127、XS101、KK2186、MV1184、DH5pUC质粒载体上的质粒载

32、体上的lacZ 编码编码 肽与这个缺失突肽与这个缺失突变的变的 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶“互补互补”，使它能形成，使它能形成4聚体。聚体。因此可以分解因此可以分解X-gal，且产生蓝色物质。，且产生蓝色物质。C端大部分端大部分N端的端的11-41aapUC lacZ受体菌受体菌lacZM153）载体）载体lacZ与与 互补互补4） 互补的插入失活互补的插入失活 pUC载体上载体上LacZ的的5端有一段多克隆位点端有一段多克隆位点(MCS)区，本身虽不干扰区，本身虽不干扰LacZ的合成，但插入外源基的合成，但插入外源基因就会阻止因就会阻止LacZ的合成。的合成。不能互补。不能互补。 lacZ53

33、肽移码突变肽移码突变lacZ53 肽肽不互补不互补互补互补MCS外源外源DNAIPTG是乳糖的类似物。能诱导是乳糖的类似物。能诱导lac操纵子的操纵子的启动转录，使受体菌基因组中的启动转录，使受体菌基因组中的lacZ 的的C端端部分部分和载体的和载体的lacZ 肽肽都表达，从而互补。都表达，从而互补。但载体但载体MCS上插入外源上插入外源DNA后，仍然不能后，仍然不能产生产生 肽！肽！IPTG通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道是否有通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道是否有DNA插入。插入。MCS无插入时，互补，蓝菌斑。无插入时，互补，蓝菌斑。MCS有插入时，不互补，白菌斑。有插入时，不

34、互补，白菌斑。IPTG诱导的结果：诱导的结果：无质粒的无质粒的受体菌受体菌 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶部分缺失，不部分缺失，不能分解能分解X-gal；无抗菌素抗性无抗菌素抗性在含抗菌素在含抗菌素和和X-gal的培的培养基上培养养基上培养无菌斑无菌斑生长生长不带外源不带外源DNA插入插入的质粒转化的质粒转化的受体菌的受体菌 -半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的缺失被载体产物缺失被载体产物 互补，能分解互补，能分解X-gal。且有抗。且有抗菌素抗性菌素抗性在含抗菌素在含抗菌素和和X-gal的培的培养基上培养养基上培养有蓝色有蓝色菌斑生菌斑生长长带外源带外源DNA插插入的质粒转化入的质粒转化的受体菌的受体菌载体产

35、物失活，载体产物失活，不能互补不能互补 -半半乳糖苷酶的缺乳糖苷酶的缺失。不能分解失。不能分解X-gal，但有，但有抗菌素抗性抗菌素抗性在含抗菌素在含抗菌素和和X-gal的培的培养基上培养养基上培养有白色有白色菌斑生菌斑生长长 更小的分子量：更小的分子量：如如pUC18为为2682bp，pUC8为为2750bp。 选择方便选择方便双重直接选择：双重直接选择：X-gal显色、抗菌素显色、抗菌素 克隆便利克隆便利具有多克隆位点（具有多克隆位点（MCS） 测序方便测序方便pUC的的MCS与与M13噬菌体载体的噬菌体载体的MCS完全相同，完全相同，便于把外源便于把外源DNA转移到转移到M13载体上测序

36、。载体上测序。11六、其它质粒载体六、其它质粒载体1. pGEM-3Z由由pUC派生而来。派生而来。与与pUC的主要区别是在的主要区别是在MCS的两侧分别加了的两侧分别加了一个噬菌体一个噬菌体启动子启动子T7和和SP6。T7启动子启动子SP6启动子启动子MCSlacZAmprori可被可被T7和和SP6的的RNA聚合酶识别转录。聚合酶识别转录。重组子的显色互补筛选法重组子的显色互补筛选法 如果加入纯化的如果加入纯化的T7或或SP6 RNA聚合酶，在试聚合酶，在试管里就可以转录管里就可以转录mRNA。 外源基因正接反接都可以转录。外源基因正接反接都可以转录。 MCS与与pUC18的完全一样。的完

37、全一样。2. pGEM-4Z：与与pGEM-3Z相同，只是相同，只是T7启动子和启动子和SP6启动子启动子的的位置互换位置互换。（1）pGEM-3Z的特点：的特点：（1）穿梭质粒载体的结构）穿梭质粒载体的结构人工构建的、具有人工构建的、具有两种不同复制起点两种不同复制起点和选和选择标记、可以在择标记、可以在两种不同的寄主细胞两种不同的寄主细胞中存中存活和复制的质粒载体。活和复制的质粒载体。Yeast复制起点复制起点E.coli复制起点复制起点E.coli选择标记选择标记Yeast选择标记选择标记MCS大肠杆菌大肠杆菌枯草杆菌穿梭载体枯草杆菌穿梭载体大肠杆菌大肠杆菌酿酒酵母穿梭载体酿酒酵母穿梭载

38、体大肠杆菌大肠杆菌土壤农杆菌穿梭载体土壤农杆菌穿梭载体大肠杆菌大肠杆菌动物细胞穿梭载体动物细胞穿梭载体（2）常用的穿梭质粒载体）常用的穿梭质粒载体（3）穿梭载体的优点）穿梭载体的优点 也能利用其它细胞系统（酵母、枯草杆菌、哺也能利用其它细胞系统（酵母、枯草杆菌、哺乳动物细胞等）进行基因表达。乳动物细胞等）进行基因表达。 可以自如地在两种不同寄主细胞之间来回转可以自如地在两种不同寄主细胞之间来回转移基因。移基因。克隆、构建克隆、构建表达表达E.coliAnimal cell 利用大肠杆菌进行基因克隆。利用大肠杆菌进行基因克隆。七、质粒载体的不稳定性七、质粒载体的不稳定性1. 质粒稳定遗传必须的两

39、个条件：质粒稳定遗传必须的两个条件：（1）每个世代、每个质粒至少要复制一次。）每个世代、每个质粒至少要复制一次。（2）在细胞分裂时，复制过的质粒必须分）在细胞分裂时，复制过的质粒必须分 配到两个子细胞中。配到两个子细胞中。有主动分配和随机分配两种假说。有主动分配和随机分配两种假说。（1）主动分配）主动分配天然质粒。天然质粒。具有一个控制质粒拷贝分配的功能区具有一个控制质粒拷贝分配的功能区（Par），），能以主动分配的方式确保质粒能正确分配到两能以主动分配的方式确保质粒能正确分配到两个子细胞中。个子细胞中。人工构建的质粒载体人工构建的质粒载体缺失了缺失了par区区，只能以随，只能以随机分配方式分

40、到子细胞中。机分配方式分到子细胞中。人工质粒。人工质粒。（一般情况下也能保证质粒的稳定遗传）（一般情况下也能保证质粒的稳定遗传）（2）随机分配）随机分配但在一定条件下会出现质粒丢失的现象。但在一定条件下会出现质粒丢失的现象。3.质粒复制的控制因素质粒复制的控制因素 在寄主菌细胞分裂的过程中，有一个细胞没有获在寄主菌细胞分裂的过程中，有一个细胞没有获得质粒拷贝，并最终繁殖成无质粒的优势群体。得质粒拷贝，并最终繁殖成无质粒的优势群体。4. 分离的不稳定性分离的不稳定性（segregation instability）5. 结构的不稳定性结构的不稳定性（structural instability）

41、寄主基因组的寄主基因组的IS序列插入质粒、质粒间的同序列插入质粒、质粒间的同源重组等都会使质粒发生插入或缺失。源重组等都会使质粒发生插入或缺失。ISdimer重组重组（1 1）新陈代谢负荷：）新陈代谢负荷：6. 6. 影响质粒载体稳定性的主要因素影响质粒载体稳定性的主要因素使寄主细胞生长减缓：使寄主细胞生长减缓：质粒载体使寄主的世代时间延长约质粒载体使寄主的世代时间延长约15%15%。 复制负荷复制负荷减缓的程度与质粒的分子量成正比。减缓的程度与质粒的分子量成正比。 转录和翻译负荷转录和翻译负荷丢失质粒的细胞反而会成为优势群体！丢失质粒的细胞反而会成为优势群体！每个菌体中所拥有的质粒拷贝数不完

42、全相每个菌体中所拥有的质粒拷贝数不完全相同，称差度。同，称差度。（2）质粒载体的拷贝数）质粒载体的拷贝数低拷贝数的质粒的差度小，遗传稳定。低拷贝数的质粒的差度小，遗传稳定。差度（差度（variance）：）：是产生无质粒细胞的重要原因。是产生无质粒细胞的重要原因。高拷贝数的质粒载体差度大，拥有少量拷贝数的高拷贝数的质粒载体差度大，拥有少量拷贝数的菌体多，发生丢失的可能性大。菌体多，发生丢失的可能性大。野生型野生型E.coli中，质粒在寄主的中，质粒在寄主的重组酶重组酶作用下作用下会发生重组形成会发生重组形成二聚体质粒二聚体质粒。（3）寄主菌的重组体系）寄主菌的重组体系二聚体灾难（二聚体灾难（d

43、imer catastrophe）：）：含有含有大分子量插入片断大分子量插入片断的质粒载体普遍能形成的质粒载体普遍能形成质粒寡聚体。质粒寡聚体。二聚体质粒的复制速度是单体的二倍！导致质二聚体质粒的复制速度是单体的二倍！导致质粒失控。粒失控。第二节第二节 噬菌体载体噬菌体载体 噬菌体是一类细菌病毒（噬菌体是一类细菌病毒（BacteriophageBacteriophage）。脱离了）。脱离了寄主细胞则不能生长和复制。寄主细胞则不能生长和复制。一、噬菌体的一般特性一、噬菌体的一般特性结构：结构：蛋白质外壳内包裹着蛋白质外壳内包裹着DNA（双双链链、单链；、单链；线性线性、环状等）。、环状等）。si

44、ngle linear DNA (about 182,000 bp)T2 Genomic DNA1. 溶菌周期：溶菌周期：二、噬菌体的生活周期二、噬菌体的生活周期烈性噬菌体（烈性噬菌体（virulent phage)：感染细菌后立即在菌感染细菌后立即在菌体内复制和合成蛋白质外壳，重新组装成噬菌体颗体内复制和合成蛋白质外壳，重新组装成噬菌体颗粒，并粒，并导致细菌细胞解体导致细菌细胞解体，释放出大量子代噬菌体。，释放出大量子代噬菌体。2. 溶原周期：溶原周期：温和噬菌体（温和噬菌体（temperate phage)：感染细菌后，将感染细菌后，将自己的自己的DNA整合整合到细菌的染色体到细菌的染色体

45、DNA中。中。三、单链噬菌体载体三、单链噬菌体载体单链环状单链环状DNA的丝状大肠杆菌噬菌体：的丝状大肠杆菌噬菌体：（2）复制型（）复制型（RF）是双链环状）是双链环状DNA。1. 单链单链DNA噬菌体的特点噬菌体的特点（3）RF DNA和和ssDNA都能转染感受态都能转染感受态 大肠杆菌，并产生噬菌斑。大肠杆菌，并产生噬菌斑。（5）可产生大量的含有外源）可产生大量的含有外源DNA插入片插入片 断的断的单链分子单链分子，便于作探针或测序。，便于作探针或测序。（1）正链）正链DNA+DNA （ssDNA）（4）不存在包装限制。）不存在包装限制。RF dsDNA在寄主细胞内以高拷贝形式存在。在寄主

46、细胞内以高拷贝形式存在。成熟的噬菌体里只包装有成熟的噬菌体里只包装有 + DNA，也容易提取。，也容易提取。M13噬菌体只感染噬菌体只感染雄性雄性大肠杆菌。大肠杆菌。但但M13 DNA可以转染雌性大肠杆菌。可以转染雌性大肠杆菌。6407 bp。（2）基因组长度）基因组长度（3）DNA提纯提纯（1）寄主）寄主（4）M13的生活周期的生活周期不导致溶菌，但使菌斑混浊（细菌生长变慢，约不导致溶菌，但使菌斑混浊（细菌生长变慢，约为正常的为正常的1/23/4）M13通过雄性细菌的性纤毛注入其通过雄性细菌的性纤毛注入其+DNA+DNA合成合成DNA，形成，形成RF dsDNADNA转录转录mRNA、合成、

47、合成+DNA、翻译形成噬菌体蛋白、翻译形成噬菌体蛋白组装成新的噬菌体组装成新的噬菌体M13，挤出寄主细胞挤出寄主细胞+DNA-DNAmRNAM13外壳蛋白外壳蛋白组装成子代组装成子代M13+DNA注入大肠杆菌注入大肠杆菌复制复制转录转录翻译翻译+DNA指导合成指导合成+DNA100200个个 RF DNA每个细胞一个世代可以放每个细胞一个世代可以放出约出约1000个个M13颗粒！颗粒！M13的包装过程：的包装过程：RF dsDNA指导合成指导合成的的+DNAM13基因基因V编码单链编码单链特异特异DNA结合蛋白结合蛋白DNA-蛋白质复合物蛋白质复合物转移到寄主的细胞膜转移到寄主的细胞膜M13外

48、壳蛋白外壳蛋白基因基因V蛋白脱落蛋白脱落+DNA溢出细胞膜溢出细胞膜包装包装（5）没有包装限制）没有包装限制3. M13载体的构建：载体的构建：M13基因组中基因基因组中基因II与基因与基因IV之间存在一段之间存在一段507bp的基因间隔区。的基因间隔区。（1）克隆区域的选定）克隆区域的选定 基因间隔区（基因间隔区（intergenic region, IG区）区）IG区内只有一个区内只有一个 BsuI 切点。切点。其余其余9个个BsuI限制性位点分布在其它部位。限制性位点分布在其它部位。 酶切位点酶切位点M13J. Messing证明，证明，IG区存在区存在M13的的复制起点复制起点，但，但

49、可以插入外源可以插入外源DNA而不影响而不影响M13噬菌体的活力。噬菌体的活力。在在IG区内插入一个大肠杆菌的区内插入一个大肠杆菌的LacZ（ -肽序列肽序列)。仅有基因工程中不常用的限制性核酸内切酶的酶切仅有基因工程中不常用的限制性核酸内切酶的酶切位点（位点（Bgl II、Ava II 和和 Pvu I）。）。（2）加入酶切位点）加入酶切位点 在在IG区内加入单一内切酶位点区内加入单一内切酶位点第一个第一个M13载体：载体：M13mp1M13 RFBsuI不完全消化不完全消化各种长度的线性片断各种长度的线性片断（其中应有只在（其中应有只在IG上切开的线性上切开的线性全长全长M13）E.col

50、i lac基因的基因的HindII片断片断(lacI、lacP、lacO、lacZ）连接连接M13mp1JM101宿主宿主只有在只有在IG区插入区插入lacZ才能存活并在才能存活并在X-gal上出现互补的蓝噬菌斑上出现互补的蓝噬菌斑（3）M13载体系列载体系列加上常用的酶切位点。加上常用的酶切位点。 M13载体系列的命名载体系列的命名M13mpn n代表系列数字代表系列数字 对对M13mp1的改进的改进B. Gronenborn和和J. Messing1978年把年把LacZ 5端的第端的第13个核苷酸个核苷酸G突变成突变成A，产生了一个，产生了一个EcoR I切点。切点。M13mp2：5AT

51、GACCATGATTACGGATTCA-Me用用N-甲基甲基-N-亚硝基脲亚硝基脲 把把G甲基化甲基化 5ATGACCATGATTACGGATTCA-转染转染E.coli。mG与与T配对，复制两次后配对，复制两次后5ATGACCATGATTACGAATTCA-EcoRI切点切点用用EcoRI切切M13mp1M13mp2选择能切开的选择能切开的 线性分子线性分子再环化再环化M13mp1 对对M13mp2的进一步改进的进一步改进在在M13mp2的的LacZ的的5端加上一段人工合成端加上一段人工合成的多克隆位点（的多克隆位点（MCS）。）。M13mp7、M13mp8、M13mp9、M13mp10、M

52、13mp11、M13mp18、M13mp19对应有相同对应有相同MCS的的pUC系列载体：系列载体：pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19成为成为M13mp系列载体：系列载体：12与与pUC18相同相同（1）有）有MCS，便于克隆不同的酶切片段，便于克隆不同的酶切片段（2） X-gal显色反应，可供直接选择显色反应，可供直接选择（3）无包装限制，克隆能力大）无包装限制，克隆能力大（4）可以克隆双链）可以克隆双链DNA分子中的每一条链分子中的每一条链子代子代M13噬菌体中包含的是单连噬菌体中包含的是单连+DNA。M13 RF+-+-+-外源外源DNA转染转染

53、E. coli成熟的子代成熟的子代M13中中+ 插入外源插入外源DNA后，遗传稳定性显著下降。后，遗传稳定性显著下降。 实际克隆能力小于实际克隆能力小于1500bp。虽无包装限制，并非无限包装！虽无包装限制，并非无限包装！5. M13载体的缺点载体的缺点 理论上克隆外源理论上克隆外源DNA片段有两种插入方向，但片段有两种插入方向，但实际上外源实际上外源DNA总是按一种主要的方向插入的。总是按一种主要的方向插入的。由由质粒载体质粒载体与与单链噬菌体载体单链噬菌体载体的复制起点结合而的复制起点结合而成的新型载体系列。成的新型载体系列。MCS噬菌体噬菌体ori质粒质粒oriAmprlacZlacI约

54、约3000bp（比（比M13小）小）克隆能力大克隆能力大能插入能插入10kb的外源的外源DNA。两种复制形式两种复制形式分子量小分子量小（1）噬菌粒载体的特点）噬菌粒载体的特点既具有既具有质粒的复制起点质粒的复制起点，又具有，又具有噬菌体的复制噬菌体的复制起点起点。既能在大肠杆菌中以质粒的形式既能在大肠杆菌中以质粒的形式双链复制双链复制，又，又能在噬菌体内进行能在噬菌体内进行单链复制单链复制。（2）常见的噬菌粒载体）常见的噬菌粒载体噬菌粒载噬菌粒载体体质粒部分质粒部分单链噬菌单链噬菌体部分体部分辅助噬菌辅助噬菌体体大肠杆菌大肠杆菌寄主寄主pEMBL8pUC8f1IR171/18pRSA101

55、VXM13M13变异变异株株XS127，XS101pUC118/pUC119pUC18/pUC19M13M13K07MV1184pBSpUCf1M13K07XL1-Blue辅助噬菌体辅助噬菌体用来复制和包装噬菌粒载体。用来复制和包装噬菌粒载体。（3）pUC118/pUC119 构构 成成1）M13的基因间隔区（的基因间隔区（IG）2）pUC18/pUC19质粒载体：质粒载体：带有带有M13复制起点。复制起点。质粒复制起点质粒复制起点AmprlacZMCSMCSpUC18/pUC19 oriAmprlacZlacIM13 ori3.2kbpUC118/119 pUC118/119的复制模式的复制

56、模式两种不同的复制模式两种不同的复制模式1）双链质粒复制模式）双链质粒复制模式受受pUC本身的复制起点（来源于本身的复制起点（来源于ColE1）的控制。）的控制。每个细胞能达到每个细胞能达到500个拷贝。个拷贝。来源于来源于M13的复制起点被的复制起点被辅助噬菌体辅助噬菌体的基因的基因II产物控制。产物控制。2）单链滚环噬菌体复制模式）单链滚环噬菌体复制模式外壳蛋白外壳蛋白复制蛋白复制蛋白辅助辅助M13包装包装当寄主细胞被当寄主细胞被辅助噬菌体辅助噬菌体M13感染后。感染后。（4）PCR产物克隆载体产物克隆载体pCR系列载体系列载体Invitrogen公司开发的公司开发的线性线性噬菌粒载体。噬

57、菌粒载体。 结构结构pUC的质粒部分、的质粒部分、fi噬菌体噬菌体ori、Kanr和和Ampr抗性。抗性。MCS的中部已经切开，各有一个的中部已经切开，各有一个3端突端突出的出的T。 特点特点PCR产物往往在产物往往在3端突出一个端突出一个A，所以能，所以能与这个载体直接连接。与这个载体直接连接。克隆的克隆的PCR产物能被两侧的产物能被两侧的EcoRI切下来回收。切下来回收。AATTT vectorPCR productT4 DNA ligaseAAPhage display vector）（1）噬菌体展示（）噬菌体展示（Phage display）将外源蛋白（多肽、酶、抗体、将外源蛋白（多肽

58、、酶、抗体、DNA结合蛋结合蛋白）结合到噬菌体的外壳蛋白上形成白）结合到噬菌体的外壳蛋白上形成融合蛋白融合蛋白，表达于表达于噬菌体的外表面噬菌体的外表面。G. P. Smith1985年发明。年发明。丝状噬菌体（丝状噬菌体（M13、f1等）外壳颗粒的一端，等）外壳颗粒的一端，有有3-5个基因个基因编码的蛋白质（编码的蛋白质（g3p），在识别），在识别和吸附大肠杆菌的过程中起作用。和吸附大肠杆菌的过程中起作用。M13（2）噬菌体展示载体的构建）噬菌体展示载体的构建把外源把外源DNA片断插入基因片断插入基因的序列的序列前端前端，并，并保持两者的阅读框正确，表达出融合蛋白。保持两者的阅读框正确，表达

59、出融合蛋白。启动子启动子外源外源DNAM13基因基因oriM13 display vector外源外源多肽多肽四、双链噬菌体载体四、双链噬菌体载体 载体载体（1）长度为）长度为48502 bp；（2）双链线性）双链线性DNA；（3）在两端有）在两端有cos位点，可以环化。位点，可以环化。 DNA两端各有两端各有12bp的粘性末端，粘的粘性末端，粘性末端形成的双链区域称为性末端形成的双链区域称为cos位点。位点。1. DNA分子的特点分子的特点 cos位点（位点（cohensive-end site）：）： DNA进入细菌体内后，可形成双链环状进入细菌体内后，可形成双链环状DNA复制型（复制型（

60、RF DNA）。）。DNA上有至少上有至少61个基因，个基因，有一半是必须的有一半是必须的，与自，与自身的活动有关，成簇排列。身的活动有关，成簇排列。其他约其他约1/3是是非必须基因（非必须基因（位于尾部合成至阻遏之位于尾部合成至阻遏之间的区段）。间的区段）。2. 噬菌体的基因组特点噬菌体的基因组特点 噬菌体感染细菌的早期：双链进行噬菌体感染细菌的早期：双链进行 型复制型复制。3. DNA的复制的复制 模型模型（1） 型复制型复制（2）滚环复制）滚环复制 感染的晚期：启动感染的晚期：启动滚环复制滚环复制机制。机制。形成多联体形成多联体 DAN分子。分子。这种多联体分子必须在这种多联体分子必须在