第3章 吸附层析

1、2022-5-3海南大学农学院wss1第三章第三章 吸附层析吸附层析Absorption chromatographyAbsorption chromatography2022-5-3海南大学农学院wss2 背景资料背景资料1 1 色谱和色谱分析色谱和色谱分析2 2 层析法发展简史层析法发展简史3 3 层析过程和基本概念层析过程和基本概念4 4 层析法分类层析法分类2022-5-3海南大学农学院wss31.1.色谱和色谱分析色谱和色谱分析n色谱法和色谱学（色谱法和色谱学（Chromatography），也），也称色层法或层析法。此种方法基于物质溶称色层法或层析法。此种方法基于物质溶解度、蒸气压

2、、吸附能力、立体结构或离解度、蒸气压、吸附能力、立体结构或离子交换等物理化学性质的微小差异，使其子交换等物理化学性质的微小差异，使其在流动相和固定相之间的分配系数不同，在流动相和固定相之间的分配系数不同，而当两相作相对运动时，组分在两相间进而当两相作相对运动时，组分在两相间进行连续多次分配，从而达到彼此分离。行连续多次分配，从而达到彼此分离。2022-5-3海南大学农学院wss42022-5-3海南大学农学院wss52.2.色谱法发展简史色谱法发展简史nTswett19031903植物叶色素的实验植物叶色素的实验n19061906开创了液固色谱法理论开创了液固色谱法理论nKuhn,Ledere

3、r 19311931 重复实验，并成功地分离了重复实验，并成功地分离了6060多多种色素。种色素。nMartinMartin19401940提出液液色谱分配法提出液液色谱分配法n19411941提出气液色谱分配法提出气液色谱分配法nMartinMartin，SyngeSynge 1952 1952出台完整的理论及实践，并出台完整的理论及实践，并获当年诺贝尔化学奖。获当年诺贝尔化学奖。nGolayGolay19571957开创开管柱气相色谱法开创开管柱气相色谱法2022-5-3海南大学农学院wss6n20 20 世纪世纪 505060 60 年代年代气相色谱为突破口的发展阶段。气相色谱为突破口的

4、发展阶段。n70 70 年代进入高效色谱为代表的现代色谱阶段。高压液相年代进入高效色谱为代表的现代色谱阶段。高压液相色谱，高效快速色谱。色谱，高效快速色谱。n75 75 年出现离子色谱。年出现离子色谱。n70 70 年代末，计算机进入色谱领域，出现计算机控制的全年代末，计算机进入色谱领域，出现计算机控制的全自动色谱仪自动色谱仪n1981 1981 年，杜邦公司生产的能自动选择最佳方案的液相色年，杜邦公司生产的能自动选择最佳方案的液相色谱仪谱仪 “探索者探索者”。2022-5-3海南大学农学院wss73.3.色谱过程色谱过程 色谱方法的共同特点：色谱方法的共同特点：色谱分离体系都有流动相和固定相

5、两个相。色谱分离体系都有流动相和固定相两个相。 色谱过程中，流动相对固定相作连续的相对运动。色谱过程中，流动相对固定相作连续的相对运动。被分离样品在两相中具有不同的作用力，各组分被分离样品在两相中具有不同的作用力，各组分混合物在流动相的带动下通过固定相，实现分离。混合物在流动相的带动下通过固定相，实现分离。 样品在分离时的两个基本点：样品在分离时的两个基本点：混合物中不同组分在柱内的差速迁移。混合物中不同组分在柱内的差速迁移。同种组分在色谱体系迁移过程中分子分布离散。同种组分在色谱体系迁移过程中分子分布离散。2022-5-3海南大学农学院wss84.4.色谱法分类色谱法分类1 1）按两相物理状

6、态分类）按两相物理状态分类n用气体作流动相气相色谱；用液体作流动相用气体作流动相气相色谱；用液体作流动相液相色谱；固定相可以是液体或气体，便可组合液相色谱；固定相可以是液体或气体，便可组合成四种主要色谱类型。成四种主要色谱类型。 气固色谱气固色谱（gas-solid chromatography，GSC ） 气液色谱气液色谱（ gas-liquid chromatography ，GLC ） 液固色谱液固色谱（liquid - solid chromatography ，LSC) 液液色谱液液色谱（ liquid - liquid chromatography ，LLC)2022-5-3海南大

7、学农学院wss92）按固定相的形态分类）按固定相的形态分类柱层析柱层析 (column chromatography) 固定相装在柱内即为层析柱固定相装在柱内即为层析柱, ,根据层析柱的尺寸，根据层析柱的尺寸，结构和制备方法不同，分为填充柱层析和毛细管柱或结构和制备方法不同，分为填充柱层析和毛细管柱或开管柱层析。开管柱层析。平板层析平板层析(planar chromatography) 固定相呈平板状，包括薄层层析、薄膜层析和纸层固定相呈平板状，包括薄层层析、薄膜层析和纸层析。固定相以均匀薄层涂敷在玻璃板、塑料板或有机析。固定相以均匀薄层涂敷在玻璃板、塑料板或有机薄膜，或将固定相直接制成薄板状

8、，称为薄层层析薄膜，或将固定相直接制成薄板状，称为薄层层析(TLC)，用滤纸作为固定相或固定相载体的层析为纸，用滤纸作为固定相或固定相载体的层析为纸层析层析(PC)。 2022-5-3海南大学农学院wss103)3)按分离过程物理化学原理分类按分离过程物理化学原理分类吸附层析吸附层析 (absorption chromatography)(absorption chromatography)n 用固体吸附剂作层析的固定相，样品各组分在吸用固体吸附剂作层析的固定相，样品各组分在吸附剂上吸附力的大小不同，而将各组分分离。如气附剂上吸附力的大小不同，而将各组分分离。如气固吸附层析和液固吸附层析。固吸

9、附层析和液固吸附层析。分配层析分配层析 (partition chromatography)(partition chromatography)n 用液体作固定相，样品组分（溶质）在固定相中用液体作固定相，样品组分（溶质）在固定相中溶解、吸附或吸着能力不同，因而在两相之间分配系溶解、吸附或吸着能力不同，因而在两相之间分配系数不同将样品组分分离。如气液分配层析、液液数不同将样品组分分离。如气液分配层析、液液分配层析。在液液分配层析中，根据流动相和固定分配层析。在液液分配层析中，根据流动相和固定相对极性不同，又分为相对极性不同，又分为正相色谱正相色谱和和反相层析反相层析。 2022-5-3海南大学

10、农学院wss11正相分配色谱与反相分配色谱正相分配色谱与反相分配色谱A.正相分配层析正相分配层析 normal phase partition chromatographyn 一般以强极性、亲水性物质或溶液为固定相，非一般以强极性、亲水性物质或溶液为固定相，非极性、弱极性或亲脂性溶剂为流动相，称极性、弱极性或亲脂性溶剂为流动相，称正相层析正相层析（ NPC)。B.反相分配层析反相分配层析 reversed phase partition chromatographyn 以非极性、亲脂性物质或溶液为固定相，以极以非极性、亲脂性物质或溶液为固定相，以极性、亲水性溶剂或水溶液为流动相，称性、亲水性溶

11、剂或水溶液为流动相，称反相层析反相层析（ RPC)。2022-5-3海南大学农学院wss12其他层析其他层析离子交换层析离子交换层析 ion-exchange chromatography离子对层析离子对层析 ion-pair chromatography凝胶层析凝胶层析 gel chromatography络合层析络合层析 complexation chromatography亲和层析亲和层析 affinity chromatography2022-5-3海南大学农学院wss132022-5-3海南大学农学院wss14操作简便、快速、自动化操作简便、快速、自动化效果灵敏、精确效果灵敏、精确2

12、022-5-3海南大学农学院wss15层析法的优点层析法的优点n生物大分子的特点：生物大分子的特点：以多样性，复杂性的形式存在；以以多样性，复杂性的形式存在；以混合物，复杂的结构形式存在；对环境如温度、混合物，复杂的结构形式存在；对环境如温度、pH 条条件，离子强度的要求较高。件，离子强度的要求较高。n用于研究的样品要求：用于研究的样品要求：一定的质和量，保存生物活性和一定的质和量，保存生物活性和严格的构象。严格的构象。n层析法的优点：层析法的优点：在室温下操作，流动相可以具有与生理在室温下操作，流动相可以具有与生理液相似的液相似的 pH 值，可以为含盐的缓冲溶液或可与水互溶值，可以为含盐的缓

13、冲溶液或可与水互溶的有机溶剂，柱填料的表面经各种相应化学修饰和覆盖的有机溶剂，柱填料的表面经各种相应化学修饰和覆盖为生物大分子的分离提供了温和的条件和为生物大分子的分离提供了温和的条件和 软接触软接触 ，利于保持其原有的构象和生理活性。利于保持其原有的构象和生理活性。2022-5-3海南大学农学院wss16色谱文献色谱文献 n专著：专著：色谱技术丛书色谱技术丛书，化学工业出版社，一套，化学工业出版社，一套23本，涵盖本，涵盖所有色谱技术：所有色谱技术：色谱分析概论色谱分析概论 色谱仪器维护与故障排除色谱仪器维护与故障排除色谱定性和定量色谱定性和定量 制备色谱技术及应用制备色谱技术及应用气相色谱

14、检测方法气相色谱检测方法 亲和色谱方法及应用亲和色谱方法及应用液相色谱检测方法液相色谱检测方法 裂解气相色谱方法及应用裂解气相色谱方法及应用气相色谱方法及应用气相色谱方法及应用 色谱手性分离技术及应用色谱手性分离技术及应用高效液相色谱方法及应用高效液相色谱方法及应用 气相色谱在石油化工中的应用气相色谱在石油化工中的应用平面色谱方法及应用平面色谱方法及应用 色谱在环境分析中的应用色谱在环境分析中的应用离子色谱方法及应用离子色谱方法及应用 色谱在食品安全分析中的应用色谱在食品安全分析中的应用毛细管电泳技术及应用毛细管电泳技术及应用 色谱在生命科学中的应用色谱在生命科学中的应用色谱分析样品处理色谱分

15、析样品处理 色谱在药物分析中的应用色谱在药物分析中的应用色谱联用技术色谱联用技术 色谱在无机材料分析中的应用色谱在无机材料分析中的应用色谱柱技术色谱柱技术2022-5-3海南大学农学院wss17主要期刊与杂志主要期刊与杂志n色谱科学杂志（色谱科学杂志（J，Chromatography Sci）1963年创刊年创刊,原原名气相色谱杂志，名气相色谱杂志，1969年改为现名，主要发表气相、液相原年改为现名，主要发表气相、液相原始论文和总结性文章（英文）和色谱标准图谱。始论文和总结性文章（英文）和色谱标准图谱。n色谱杂志（色谱杂志（J， Chromatograpy）1958年创刊年创刊,系多科性（包系

16、多科性（包括气相、液相色谱，薄层色谱，纸色谱，离子交换色谱等）括气相、液相色谱，薄层色谱，纸色谱，离子交换色谱等）国际杂志，刊登各种原始论文及讲座性文章，并附有定性、国际杂志，刊登各种原始论文及讲座性文章，并附有定性、定量数据及色谱文摘，文章以英文、法文或德文发表，从定量数据及色谱文摘，文章以英文、法文或德文发表，从1993年起分年起分A、B卷发行，每年还有卷发行，每年还有Review专辑。专辑。nJouynal of Chromatography Library, 不定期出版。不定期出版。n色层法（色层法（Chromatographia），），1968年创刊，多科性国际杂年创刊，多科性国际杂

17、志，亦称色谱快报，文章以英文、法文、或德文发表，并附志，亦称色谱快报，文章以英文、法文、或德文发表，并附有三种文字的摘要。有三种文字的摘要。2022-5-3海南大学农学院wss18n液相色谱杂志（液相色谱杂志（J, of Liquid Chromatography），），1978年创年创刊，主要发表刊，主要发表HPLC的研究报告。的研究报告。n高分离色谱与色谱通讯（高分离色谱与色谱通讯（J.of High Resolution Chromatography and Chromatography Communication）1978年创刊。年创刊。n色谱色谱，1984年创刊，刊登各种原始论文和综

18、述，为双年创刊，刊登各种原始论文和综述，为双月刊。月刊。n刊登色谱文章和评论性文章的还有各种分析化学相关的杂刊登色谱文章和评论性文章的还有各种分析化学相关的杂志，如各国的志，如各国的“分析化学分析化学”（美、英、日、德等），（美、英、日、德等），Analytical Chemistry；Analytical Chemistry Acta；Journal of Analytical and Applied Pyrolysis。2022-5-3海南大学农学院wss19色谱网站色谱网站 (日本岛津公司日本岛津公司)qhttp:/(瓦里安公司瓦里安公司)qhttp:/www.perkin-(PE公司公

19、司)qhttp:/ 第一节第一节 吸附柱层析吸附柱层析 第二节第二节 薄层层析薄层层析 第三节第三节 聚酰胺薄膜层析聚酰胺薄膜层析2022-5-3海南大学农学院wss21n吸附柱层析吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相是以固体吸附剂为固定相（床），以有机溶剂或缓冲液为流动相构（床），以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱状的一种层析方法。成柱状的一种层析方法。极性：羟基磷灰石、硅胶、氧化铝极性：羟基磷灰石、硅胶、氧化铝非极性：活性炭非极性：活性炭吸附剂吸附剂2022-5-3海南大学农学院wss22第一节第一节 吸附柱层析吸附柱层析一、常用术语一、常用术语二、基本原理二、基本原理三、吸附剂三、吸附剂四、洗

20、脱剂四、洗脱剂五、层析柱的制备与层析操作五、层析柱的制备与层析操作六、应用实例六、应用实例2022-5-3海南大学农学院wss23一一. .常用术语：常用术语：1. 1. 固定相固定相2. 2. 流动相流动相3. 3. 层析层析4. 4. 操作容量操作容量5. 5. 床体积床体积6. 6. 洗脱体积洗脱体积7. 7. 膨胀度膨胀度8. 8. 分配系数，迁移率分配系数，迁移率 固定相固定相流动相流动相层析层析洗脱体积洗脱体积 Ve床体积床体积 Vt2022-5-3海南大学农学院wss24 1.固定相固定相 固定相固定相是能与相关的化合物进行可逆性的吸是能与相关的化合物进行可逆性的吸附、溶解和交换

21、作用的物质。附、溶解和交换作用的物质。固定相由层析基质组成，基质包括固体物质固定相由层析基质组成，基质包括固体物质（如吸附剂、离子交换剂）和液体物质（如固定在（如吸附剂、离子交换剂）和液体物质（如固定在纤维素或硅胶上的溶液）。纤维素或硅胶上的溶液）。2022-5-3海南大学农学院wss25 2.流动相流动相 流动相流动相是在层析过程中推动固定相上的物质是在层析过程中推动固定相上的物质向一定方向移动的液体或气体称为流动相。向一定方向移动的液体或气体称为流动相。2022-5-3海南大学农学院wss26 3.层析层析 以基质为固定相（柱状或薄层状），以液体或以基质为固定相（柱状或薄层状），以液体或气

22、体为流动相，有效成分和杂质在这两个相中连续气体为流动相，有效成分和杂质在这两个相中连续多次地进行分配、吸附或交换作用，最终结果是使多次地进行分配、吸附或交换作用，最终结果是使混合物得到分离。混合物得到分离。平衡液、洗涤液、洗脱液平衡液、洗涤液、洗脱液2022-5-3海南大学农学院wss27 4.操作容量操作容量 即在特定条件下，某种成分与基质反应达到即在特定条件下，某种成分与基质反应达到平衡时，存在于基质上的饱和容量，一般以每克平衡时，存在于基质上的饱和容量，一般以每克（或毫升）基质结合某种成分的毫摩尔数或毫克（或毫升）基质结合某种成分的毫摩尔数或毫克数来表示。数来表示。 2022-5-3海南

23、大学农学院wss285.床体积（床体积（Vt） 通常床体积是指膨胀后的基质在层析柱中所通常床体积是指膨胀后的基质在层析柱中所占有的体积（占有的体积（Vt）。）。Vt是基质的外水体积（是基质的外水体积（Vo）和内水体积（和内水体积（Vi）以及自身体积（）以及自身体积（Vg）的总和。）的总和。即即 VtVo十十Vi十十Vg2022-5-3海南大学农学院wss297.膨胀度膨胀度 在一定溶液中，单位重量的基质充分溶胀后所占在一定溶液中，单位重量的基质充分溶胀后所占有的体积，用有的体积，用V表示。即每克溶胀基质所具有的表示。即每克溶胀基质所具有的床体积。床体积。6.洗脱体积（洗脱体积（Ve） 洗脱体积

24、是指某一成分从柱顶部到底部的洗洗脱体积是指某一成分从柱顶部到底部的洗脱液中出现浓度达到最大值时的流动相体积。脱液中出现浓度达到最大值时的流动相体积。2022-5-3海南大学农学院wss308.分配系数和迁移率分配系数和迁移率 分配系数分配系数是指一组分在固定相与是指一组分在固定相与流动相中含量的比值。常用流动相中含量的比值。常用K表示。表示。 迁移率迁移率是指一组分在相同时间内，是指一组分在相同时间内，在固定相移动的距离与流动相移动距在固定相移动的距离与流动相移动距离之比值，常用离之比值，常用Rf表示。表示。 2022-5-3海南大学农学院wss31外水体积外水体积 VoVo洗脱体积洗脱体积

25、VeVe流流动动相相固固定定相相层析柱层析柱层析床层析床床体积外水体积基质体积内水体积床体积外水体积基质体积内水体积 Vt Vt Vo Vo Vg Vg ViViK 在固定相中的含量在固定相中的含量在流动相中的含量在流动相中的含量Rf 在固定相中移动的距离在固定相中移动的距离在流动相中移动的距离在流动相中移动的距离2022-5-3海南大学农学院wss32第一节第一节 吸附柱层析吸附柱层析一、常用术语一、常用术语二、基本原理二、基本原理三、吸附剂三、吸附剂四、洗脱剂四、洗脱剂五、层析柱的制备与层析操作五、层析柱的制备与层析操作六、应用实例六、应用实例2022-5-3海南大学农学院wss33二、基

26、本原理二、基本原理 生物大分子在层析柱中与吸附剂颗粒的表生物大分子在层析柱中与吸附剂颗粒的表面吸附位点以范德华引力、静电引力作用进行面吸附位点以范德华引力、静电引力作用进行可逆性结合。在洗脱剂，流动相的作用下，生可逆性结合。在洗脱剂，流动相的作用下，生物大分子通过吸附解吸附再吸附再解吸物大分子通过吸附解吸附再吸附再解吸附的连续历程。依据分子各成份与吸附剂结合附的连续历程。依据分子各成份与吸附剂结合力之间的差异而达到分开。力之间的差异而达到分开。2022-5-3海南大学农学院wss342022-5-3海南大学农学院wss35例：猪肾二胺氧化酶在羟基磷灰石吸附层析例：猪肾二胺氧化酶在羟基磷灰石吸附

27、层析柱中的分离柱中的分离梯度盐缓冲液梯度盐缓冲液杂蛋白杂蛋白 氧化酶氧化酶氧化酶氧化酶杂蛋白杂蛋白盐析的样品液盐析的样品液吸收值吸收值2022-5-3海南大学农学院wss36关于吸附层析分离效果的因素关于吸附层析分离效果的因素n吸附剂的性质吸附剂的性质n洗脱剂的性质洗脱剂的性质n层析柱及装填技术层析柱及装填技术n对样品的要求对样品的要求n加样方式及加样量加样方式及加样量n柱效（踏板理论）柱效（踏板理论） 柱长柱长 L样品高度样品高度H踏板理论数踏板理论数N 样品高度样品高度H柱长柱长 L2022-5-3海南大学农学院wss37第一节第一节 吸附柱层析吸附柱层析一、常用术语一、常用术语二、基本原

28、理二、基本原理三、吸附剂三、吸附剂四、洗脱剂四、洗脱剂五、层析柱的制备与层析操作五、层析柱的制备与层析操作六、应用实例六、应用实例2022-5-3海南大学农学院wss38三、吸附剂三、吸附剂1.1.吸附剂的选择吸附剂的选择n选择性好选择性好: : 对不同物质的吸附力的差异性。对不同物质的吸附力的差异性。n表面积大：表面积大：增加吸附容量。增加吸附容量。n性质稳定：性质稳定：不与被分离物、洗脱剂及溶剂发生化不与被分离物、洗脱剂及溶剂发生化学反应学反应, ,不分解不破坏被分离物，在一定范围的不分解不破坏被分离物，在一定范围的酸碱，一定的操作压时不变形、不破碎。酸碱，一定的操作压时不变形、不破碎。n

29、颗粒的大小尺寸适合、均匀、颜色浅、便于观察。颗粒的大小尺寸适合、均匀、颜色浅、便于观察。 2022-5-3海南大学农学院wss392.常用吸附剂的特点常用吸附剂的特点1）羟基磷灰石：羟基磷灰石：性质稳定，吸附容量大，适用范性质稳定，吸附容量大，适用范围广。围广。2 2）硅胶：硅胶：化学惰性，吸附容量大。化学惰性，吸附容量大。n极性强的吸附剂易吸附极性强的物质，非极性极性强的吸附剂易吸附极性强的物质，非极性的吸附剂易吸附非极性的物质。为便于解吸附，的吸附剂易吸附非极性的物质。为便于解吸附，故在分离极性大的物质应选择极性小的吸附剂，故在分离极性大的物质应选择极性小的吸附剂，反之亦然。反之亦然。 2

30、022-5-3海南大学农学院wss402022-5-3海南大学农学院wss41第一节第一节 吸附柱层析吸附柱层析一、常用术语一、常用术语二、基本原理二、基本原理三、吸附剂三、吸附剂四、洗脱剂四、洗脱剂五、层析柱的制备与层析操作五、层析柱的制备与层析操作六、应用实例六、应用实例2022-5-3海南大学农学院wss42四、溶剂与洗脱剂四、溶剂与洗脱剂n溶剂：溶剂：溶解样品的溶液。溶解样品的溶液。n洗脱液：洗脱液：洗脱吸附柱的溶液。洗脱吸附柱的溶液。n通常为相同的成份或同一种组分。通常为相同的成份或同一种组分。n选择时，根据样品组分的溶解度、吸附剂的性选择时，根据样品组分的溶解度、吸附剂的性质、溶剂

31、的极性方面考虑极性大的洗脱能力大，质、溶剂的极性方面考虑极性大的洗脱能力大，因此可先用极性小的作溶剂，使组分易被吸附，因此可先用极性小的作溶剂，使组分易被吸附，然后换用极性大的溶剂作洗脱剂，使组分易从然后换用极性大的溶剂作洗脱剂，使组分易从吸附柱中洗出。吸附柱中洗出。 2022-5-3海南大学农学院wss43洗脱剂的性质洗脱剂的性质n性质稳定：性质稳定：不改变吸附剂的性质，如溶胀或收不改变吸附剂的性质，如溶胀或收缩。缩。n纯度高：纯度高：防止流动相中的杂质在吸附柱上的积防止流动相中的杂质在吸附柱上的积累形成的污染。累形成的污染。n无吸收背景：无吸收背景：提高检测的灵敏度。提高检测的灵敏度。n低

32、粘度：低粘度：高粘度时降低溶质扩散、增加柱压，高粘度时降低溶质扩散、增加柱压，降低效率。降低效率。n溶解度理想溶解度理想n样品容易回收样品容易回收2022-5-3海南大学农学院wss44第一节第一节 吸附柱层析吸附柱层析一、常用术语一、常用术语二、基本原理二、基本原理三、吸附剂三、吸附剂四、洗脱剂四、洗脱剂五、层析柱的制备与层析操作五、层析柱的制备与层析操作六、应用实例六、应用实例2022-5-3海南大学农学院wss45五、层析柱的制备与层析操作五、层析柱的制备与层析操作 柱层析的设柱层析的设备主要有层析柱、备主要有层析柱、部分收集器、磁部分收集器、磁力搅拌器和恒流力搅拌器和恒流泵。有条件时，

33、泵。有条件时，配置一台检测仪配置一台检测仪就构成一个完整就构成一个完整的层析系统。详的层析系统。详见下图见下图3-4。2022-5-3海南大学农学院wss462022-5-3海南大学农学院wss472022-5-3海南大学农学院wss482022-5-3海南大学农学院wss492022-5-3海南大学农学院wss501 1层析柱层析柱n柱材质：柱材质：通常是玻璃的通常是玻璃的n柱子的装填（干装与湿装）及大小类型柱子的装填（干装与湿装）及大小类型n吸附层析柱吸附层析柱 d: h 1:10d: h 1:101:40 1:40 ，特殊，特殊的可为的可为4 4：3.63.6。n层析柱的床体积是由吸附剂

34、的量和膨胀度层析柱的床体积是由吸附剂的量和膨胀度决定的。决定的。2022-5-3海南大学农学院wss512吸附剂的用量及准备吸附剂的用量及准备n吸附剂的用量是根据其自身的操作容量和分离物吸附剂的用量是根据其自身的操作容量和分离物中各成分的性质所决定。中各成分的性质所决定。n当操作容量高时，吸附剂用量少。当操作容量高时，吸附剂用量少。n在装柱前吸附剂要用溶剂平衡，另外还需作一些在装柱前吸附剂要用溶剂平衡，另外还需作一些预处理。预处理。2022-5-3海南大学农学院wss523.3.装柱装柱n装柱装柱是是最关键最关键的一步。的一步。n重力沉降法装柱。重力沉降法装柱。n陆续不断地添加糊状物，使其形成

35、的胶粒床面上陆续不断地添加糊状物，使其形成的胶粒床面上有胶粒连续有胶粒连续均匀地沉降均匀地沉降，直至装柱物完全沉降至，直至装柱物完全沉降至适当的柱床体积为止。适当的柱床体积为止。 n柱的表面始终要保持着一层溶剂柱的表面始终要保持着一层溶剂( (一般一般l l3cm3cm柱柱高高) )柱的任何一部分绝对柱的任何一部分绝对不能不能“流干流干”。2022-5-3海南大学农学院wss53加适量溶剂加适量溶剂到柱内到柱内搅匀搅匀预先用溶剂浸泡好的预先用溶剂浸泡好的吸附剂，吸附剂，连续连续倾入柱中倾入柱中自然沉降自然沉降至柱高的至柱高的1/41/3时时打开柱下端出口打开柱下端出口装柱（干装法和湿装法）装柱

36、（干装法和湿装法）悬浮液徐徐下降至需要的高度悬浮液徐徐下降至需要的高度2022-5-3海南大学农学院wss544.4.平衡平衡 n层析柱正式使用前，必须平衡至所需的层析柱正式使用前，必须平衡至所需的pHpH和离和离子强度，一般用起始缓冲液在恒定压力下走柱，子强度，一般用起始缓冲液在恒定压力下走柱，其洗脱体积相当于其洗脱体积相当于3 35 5倍床体积，使交换剂充倍床体积，使交换剂充分平衡，柱床稳定。分平衡，柱床稳定。2022-5-3海南大学农学院wss555上样和洗脱上样和洗脱平衡层析柱平衡层析柱分离样品的溶液加到固定相表面分离样品的溶液加到固定相表面样品液的液面流到固定相表面时，用滴管加入洗脱

37、剂样品液的液面流到固定相表面时，用滴管加入洗脱剂收集收集浓度或活性测定浓度或活性测定2022-5-3海南大学农学院wss56(1)(1)层析样品的要求层析样品的要求n样品的溶解度好，样品中的不溶物在上样前用离样品的溶解度好，样品中的不溶物在上样前用离心法或过滤法除去。心法或过滤法除去。n加入的样品量利于提高分辨率；加样量加入的样品量利于提高分辨率；加样量 VtVt VtVt。n样品的浓度与粘度的考虑。样品的浓度与粘度的考虑。n一般使其与起始缓冲液有相同一般使其与起始缓冲液有相同pHpH，低的离子强度，低的离子强度和尽可能小的体积。和尽可能小的体积。210112022-5-3海南大学农学院wss

38、57（2 2）加样方法）加样方法 有有3 3种方法可将样品加到已制备好的柱顶：种方法可将样品加到已制备好的柱顶：A.A.简单的方法是放除柱床表面以上的溶液，然后小心简单的方法是放除柱床表面以上的溶液，然后小心地用移液管加样；地用移液管加样；2022-5-3海南大学农学院wss58B.B.不需要让柱流干至床表面，而是加入不需要让柱流干至床表面，而是加入1 1浓度浓度的蔗糖来增加样品的密度；的蔗糖来增加样品的密度；C.C.方法是用一个毛细管和一个注射器或蠕动泵把方法是用一个毛细管和一个注射器或蠕动泵把样品直接传送到柱表面样品直接传送到柱表面( (如一些商品柱附有专门如一些商品柱附有专门加样装置加样

39、装置) )。 2022-5-3海南大学农学院wss59(3(3）洗脱）洗脱 洗脱：洗脱：吸附在柱中的混合样品在洗脱剂的推动下不吸附在柱中的混合样品在洗脱剂的推动下不断发生溶解（解吸附）、吸附、再溶解、再吸附，断发生溶解（解吸附）、吸附、再溶解、再吸附，被吸附的物质解吸并随洗脱剂向前移动，又吸附到被吸附的物质解吸并随洗脱剂向前移动，又吸附到新的吸附剂上，新流出的洗脱剂又进行解吸，如此新的吸附剂上，新流出的洗脱剂又进行解吸，如此反复，各组分的分子结构不同，其吸附能力及溶解反复，各组分的分子结构不同，其吸附能力及溶解能力的差别，导致移动距离的差异，使各种成份形能力的差别，导致移动距离的差异，使各种成

40、份形成各自的区带，若分离物是有色的，便看见色谱层，成各自的区带，若分离物是有色的，便看见色谱层，使样品得以分离及纯化。使样品得以分离及纯化。2022-5-3海南大学农学院wss60 图中的图中的A A峰和峰和B B峰均呈对称形，峰均呈对称形，二者没有重叠，二者没有重叠，这表明样品液中这表明样品液中的组分已完全分的组分已完全分开。开。 层析峰的面积层析峰的面积（FEGFEG）、峰高）、峰高（BEBE）和半峰高）和半峰高宽度（宽度（HIHI）等参）等参数是定性、定量数是定性、定量洗脱物的依据。洗脱物的依据。2022-5-3海南大学农学院wss616.6.流速与分离效果流速与分离效果流速太慢，前峰流

41、速太慢，前峰托尾与后峰相连托尾与后峰相连流速太快，流速太快，组分分不开组分分不开正常的流速使正常的流速使组分完全分离组分完全分离0-1 M(NH4)2SO4梯梯度解吸附氧化酶度解吸附氧化酶2022-5-3海南大学农学院wss62 为了获得满意的分离结果，洗脱液的流速务为了获得满意的分离结果，洗脱液的流速务必恰当控制。如果太快，洗脱物在两相中的平衡必恰当控制。如果太快，洗脱物在两相中的平衡过程不完全；如果太慢，洗脱物会扩散。过程不完全；如果太慢，洗脱物会扩散。 流速可以通过调节流速可以通过调节“操作压操作压”来控制，来控制，“操操作压作压”相当于在柱上部的贮液瓶中溶剂的水平和相当于在柱上部的贮液

42、瓶中溶剂的水平和柱出水口位置的水平之差。柱出水口位置的水平之差。 获得稳定流速的另一方法是利用蠕动泵把洗获得稳定流速的另一方法是利用蠕动泵把洗脱液泵入或泵出柱，并保持稳定流速。脱液泵入或泵出柱，并保持稳定流速。 2022-5-3海南大学农学院wss637.7.分部收集分部收集 8.8.检测和合并收集检测和合并收集 n为了测定收集的各部分中各种成分的分布须用一为了测定收集的各部分中各种成分的分布须用一些能特异地检测被分离化合物的方法来进行分析，些能特异地检测被分离化合物的方法来进行分析，一般可用直接或间接方法：一般可用直接或间接方法： n直接法有分光光度法、光折射法、荧光法等。直接法有分光光度法

43、、光折射法、荧光法等。 n间接法包括化学显色法、等电聚焦法、电泳法、间接法包括化学显色法、等电聚焦法、电泳法、薄层层析法和生物活性测定法等。薄层层析法和生物活性测定法等。2022-5-3海南大学农学院wss64n洗脱液的合并方法对目的物质量和产量有较大的洗脱液的合并方法对目的物质量和产量有较大的影响。欲得高纯度的化合物，一般根据洗脱峰位影响。欲得高纯度的化合物，一般根据洗脱峰位置收集合并较窄的部分；欲得产量较多目的物，置收集合并较窄的部分；欲得产量较多目的物，则合并较宽部分。则合并较宽部分。2022-5-3海南大学农学院wss659.9.层析峰的分析及处理层析峰的分析及处理AB 1 B2 B3

44、A:体积超载体积超载B B ：质量超载。：质量超载。B1 样品有沉淀；B2 流动相有溶质； B3 组分出现结晶2022-5-3海南大学农学院wss6610吸附剂的再生吸附剂的再生 用过的吸附剂，经适当方法处理后，又恢复用过的吸附剂，经适当方法处理后，又恢复其性能的过程称吸附剂的再生。其性能的过程称吸附剂的再生。 一般不同吸附剂（或基质）的再生方法是不一般不同吸附剂（或基质）的再生方法是不同的。同的。2022-5-3海南大学农学院wss6711.11.最佳加样量与踏板理论最佳加样量与踏板理论 踏板理论是把整个层析柱长比喻为蒸馏塔（踏板理论是把整个层析柱长比喻为蒸馏塔（ L L ），），在某一段柱

45、长范围内溶质在固定相和流动相之间达到在某一段柱长范围内溶质在固定相和流动相之间达到平衡，这一段柱长便相当于一个理论踏板的高度（平衡，这一段柱长便相当于一个理论踏板的高度（H H）踏板理论数（）便表示柱内溶质谱带的分布。踏板理论数（）便表示柱内溶质谱带的分布。 表示法：表示法：踏板理论数与踏板理论高度呈反比的关系。踏板理论数与踏板理论高度呈反比的关系。N=LH2022-5-3海南大学农学院wss682022-5-3海南大学农学院wss69提高踏板理论数提高踏板理论数n降低洗脱液的粘度降低洗脱液的粘度n适当降低流速适当降低流速n提高柱温提高柱温n匹配微量分离检测技术匹配微量分离检测技术 n选用毛细

46、管层析柱选用毛细管层析柱n柱定长时加大柱直径柱定长时加大柱直径n固定相的粒度细小固定相的粒度细小n减少上样的体积减少上样的体积n较小的样品分子较小的样品分子2022-5-3海南大学农学院wss70 程序程序n装填层析柱装填层析柱n柱的平衡柱的平衡n加样加样n洗脱洗脱n收集收集n鉴定鉴定n绘制洗脱曲线绘制洗脱曲线n合并有效成份合并有效成份n计算含量（酶活力）计算含量（酶活力）n基质的再生基质的再生 注意注意n柱的柱的 d:h=1:101:40n吸附剂用量为样品的吸附剂用量为样品的 30 50 倍倍n分析时的加样量一般分析时的加样量一般 110Vtn 制备时的加样量一般制备时的加样量一般 12Vt

47、2022-5-3海南大学农学院wss71第一节第一节 吸附柱层析吸附柱层析一、常用术语一、常用术语二、基本原理二、基本原理三三 、吸附剂、吸附剂四四 、洗脱剂、洗脱剂五、层析柱的制备与层析操作五、层析柱的制备与层析操作六、应用实例六、应用实例2022-5-3海南大学农学院wss72六、应用实例六、应用实例2022-5-3海南大学农学院wss732022-5-3海南大学农学院wss742022-5-3海南大学农学院wss75内容提要内容提要 第一节第一节 吸附柱层析吸附柱层析 第二节第二节 薄层层析薄层层析 第三节第三节 聚酰胺薄膜层析聚酰胺薄膜层析2022-5-3海南大学农学院wss76第二节

48、第二节 薄层层析薄层层析Thin layer chromatography, TLCn将吸附剂在玻璃或涤纶胶片片基上均匀涂布成将吸附剂在玻璃或涤纶胶片片基上均匀涂布成薄膜或薄板，经过活化后，即可对样品进行展薄膜或薄板，经过活化后，即可对样品进行展层，达到分离、纯化、制备、分析鉴定等目的。层，达到分离、纯化、制备、分析鉴定等目的。优点：优点：n展层时间短展层时间短 设备简单设备简单 干扰因素小干扰因素小n适合定性及定量研究适合定性及定量研究 灵敏度高灵敏度高 显色方便。显色方便。2022-5-3海南大学农学院wss77R f值值nR f值为迁移率（值为迁移率（rate of flow, R f）

49、在一定条件下，某种物质的在一定条件下，某种物质的R f 值是常数。值是常数。R f值表示为：值表示为：原点到层析点中心的距离原点到层析点中心的距离 原点到溶剂前沿的距离原点到溶剂前沿的距离R f =2022-5-3海南大学农学院wss78第二节第二节 薄层层析薄层层析一、固定相支持介质的选择一、固定相支持介质的选择 二、操作及注意事项二、操作及注意事项三、应用实例三、应用实例2022-5-3海南大学农学院wss79一、固定相支持介质的选择一、固定相支持介质的选择 （一）支持介质（基质）的性能（一）支持介质（基质）的性能 就其性质，可分为无机吸附剂就其性质，可分为无机吸附剂( (如氧化铝、硅藻如

50、氧化铝、硅藻土、磷酸钙等土、磷酸钙等) )和有机吸附剂和有机吸附剂( (如硅胶、聚酰胺、纤如硅胶、聚酰胺、纤维素和葡聚糖等维素和葡聚糖等) )。 吸附剂应具备的条件：吸附剂应具备的条件：(1)(1)纯度高、杂质少。纯度高、杂质少。 (2)(2)结构均匀，有一定比表面积。结构均匀，有一定比表面积。 (3)(3)稳定而具有一定机械强度，不与样品组分和展层剂发稳定而具有一定机械强度，不与样品组分和展层剂发生化学反应。生化学反应。 (4)(4)有适当的吸附能力，容易用展层剂把样品组分从它的有适当的吸附能力，容易用展层剂把样品组分从它的表面解吸下来。表面解吸下来。2022-5-3海南大学农学院wss80

51、（二）（二） 支持介质的选择原则支持介质的选择原则 介质的选择应从两方面考虑：介质的选择应从两方面考虑：(1)(1)样品各组分的性质，即它们的溶解性、酸碱性样品各组分的性质，即它们的溶解性、酸碱性及极性大小；及极性大小；(2)(2)支持介质的亲和能力强弱。支持介质的亲和能力强弱。 2022-5-3海南大学农学院wss812022-5-3海南大学农学院wss82第二节第二节 薄层层析薄层层析一、固定相支持介质的选择一、固定相支持介质的选择 二、操作及注意事项二、操作及注意事项三、应用实例三、应用实例2022-5-3海南大学农学院wss83操作及注意事项操作及注意事项n薄层层析薄层层析操作（以硅胶

52、吸附剂为例）操作（以硅胶吸附剂为例）薄板制备（铺板）薄板制备（铺板）点样点样展层展层显显色色R f值测定值测定结果分析等步骤结果分析等步骤2022-5-3海南大学农学院wss841.1.吸附剂的选择吸附剂的选择n硅胶硅胶n氧化铝氧化铝n吸附剂与样品性质的关系吸附剂与样品性质的关系2.2.制备薄板、薄层、薄膜制备薄板、薄层、薄膜n薄层的厚度与薄层的厚度与 R Rf f值值n薄层的活性测定薄层的活性测定2022-5-3海南大学农学院wss85硅胶的分类硅胶的分类l硅胶型号很多，其性质和组分硅胶型号很多，其性质和组分各不相同各不相同。l硅胶硅胶H系粘性差的纯硅胶；系粘性差的纯硅胶； 硅胶硅胶G系含系

53、含1015锻石膏和锻石膏和5淀粉的硅胶，粘性淀粉的硅胶，粘性好；好； 硅胶硅胶CMC系含有适量的羧甲基纤维素的硅胶；系含有适量的羧甲基纤维素的硅胶； 硅胶硅胶HF254系含有荧光剂的硅胶系含有荧光剂的硅胶H。l硅胶硅胶H能用腐蚀性显色剂检测，而硅胶能用腐蚀性显色剂检测，而硅胶G和硅胶和硅胶CMC则不能用。则不能用。2022-5-3海南大学农学院wss861.1.吸附剂的选择吸附剂的选择n硅胶硅胶n氧化铝氧化铝n吸附剂与样品性质的关系吸附剂与样品性质的关系2.2.制备薄板、薄层、薄膜制备薄板、薄层、薄膜n薄层的厚度与薄层的厚度与 R R f f值值n薄层的活性测定薄层的活性测定2022-5-3海

54、南大学农学院wss87n铺板铺板 ：（2.5 cm7.5 cm玻板）玻板） 铺板用的匀浆不宜过稠或过稀。铺板用的匀浆不宜过稠或过稀。l过稠，板容易出现拖动或停顿造成的层纹；过稠，板容易出现拖动或停顿造成的层纹；l过稀，水蒸发后，板表面较粗糙。过稀，水蒸发后，板表面较粗糙。l匀浆配比一般是硅胶匀浆配比一般是硅胶G : 水水=1 : 23，硅胶，硅胶G : 羧羧甲基纤维素钠水溶液甲基纤维素钠水溶液=1 : 2。2022-5-3海南大学农学院wss88简易涂布简易涂布半自动涂布半自动涂布自动涂布自动涂布2022-5-3海南大学农学院wss89硅胶薄层薄板的活性测定硅胶薄层薄板的活性测定苏丹黄、苏丹红

55、、靛酚蓝在活化苏丹黄、苏丹红、靛酚蓝在活化的薄层薄板上的层析行为的薄层薄板上的层析行为A B C D2022-5-3海南大学农学院wss904.4.展层剂的选择展层剂的选择种类：单一溶剂、混合溶剂种类：单一溶剂、混合溶剂 要求：要求：*将混合样品分开将混合样品分开 * *易挥发，粘度小，组成简单易挥发，粘度小，组成简单 * *对样品的定性与定量无干扰对样品的定性与定量无干扰 * *毒性小，对人与环境安全毒性小，对人与环境安全选择：选择：选用时考虑展层剂的极性与溶解度，极性、溶选用时考虑展层剂的极性与溶解度，极性、溶解度与样品展层距离呈正比的关系。解度与样品展层距离呈正比的关系。 3.3.点样点

56、样2022-5-3海南大学农学院wss91不同展层剂对物质的分离影响不同展层剂对物质的分离影响n咖啡酸与绿原酸在极性不同的咖啡酸与绿原酸在极性不同的展层剂中的分离效果展层剂中的分离效果2022-5-3海南大学农学院wss92单一溶剂极性大小的次序单一溶剂极性大小的次序n石油醚环己烷二硫化碳四氯化碳苯石油醚环己烷二硫化碳四氯化碳苯甲苯二氯甲烷氯仿乙醚乙酸乙酯甲苯二氯甲烷氯仿乙醚乙酸乙酯丙酮正丙醇乙醇甲醇吡啶乙酸丙酮正丙醇乙醇甲醇吡啶乙酸2022-5-3海南大学农学院wss935.展层与显色展层与显色展层方式展层方式n上行展开与下行展开上行展开与下行展开n一次展开与二次展开一次展开与二次展开n连续

57、展开与填补展开连续展开与填补展开n单向展开与双向展开单向展开与双向展开n浓度梯度展开浓度梯度展开n圆心展开圆心展开显色选择显色选择n特异性显色剂特异性显色剂n腐蚀性显色剂腐蚀性显色剂n薄板中含荧光素薄板中含荧光素2022-5-3海南大学农学院wss942022-5-3海南大学农学院wss95n显色显色 喷显色剂显色喷显色剂显色最重要是有好的雾最重要是有好的雾化器。化器。2022-5-3海南大学农学院wss962022-5-3海南大学农学院wss972022-5-3海南大学农学院wss986.特殊薄层特殊薄层n针对某些性质特殊的化合物的分离与检出，有时针对某些性质特殊的化合物的分离与检出，有时需

58、采用一些特殊薄层。需采用一些特殊薄层。 荧光薄层荧光薄层 络合薄层络合薄层 酸碱薄层和酸碱薄层和pH缓冲薄层缓冲薄层 2022-5-3海南大学农学院wss99 荧光薄层荧光薄层n有些化合物本身无色，在紫外灯下也不显荧光，又无适有些化合物本身无色，在紫外灯下也不显荧光，又无适当的显色剂时，则可当的显色剂时，则可在吸附剂中加入荧光物质在吸附剂中加入荧光物质制成荧光制成荧光薄层进行层析。薄层进行层析。n展层后展层后置于紫外光下照射置于紫外光下照射，薄层板本身显荧光，而样品，薄层板本身显荧光，而样品斑点处不显荧光，即可检出样品的层析位置。常用的荧斑点处不显荧光，即可检出样品的层析位置。常用的荧光物质多

59、为无机物。其一是在光物质多为无机物。其一是在254 nm紫外光激发下显出紫外光激发下显出荧光的，如锰激活的硅酸锌。另一种为在荧光的，如锰激活的硅酸锌。另一种为在365 nm紫外光紫外光激发下发出荧光的，如银激化的硫化锌等。激发下发出荧光的，如银激化的硫化锌等。 2022-5-3海南大学农学院wss100 络合薄层络合薄层n常用的有硝酸银薄层。用来分离碳原子数相等而其常用的有硝酸银薄层。用来分离碳原子数相等而其中中CC双键数目不等的一系列化合物，如不饱和醇、双键数目不等的一系列化合物，如不饱和醇、酸等。酸等。n其主要机理是由于不饱和其主要机理是由于不饱和CC键能与硝酸银形成络键能与硝酸银形成络合

60、物，而饱和的合物，而饱和的CC键则不与硝酸银络合。因此在键则不与硝酸银络合。因此在硝酸银薄层上，化合物可由于饱和程度不同而获得硝酸银薄层上，化合物可由于饱和程度不同而获得分离。层析时饱和化合物由于吸附最弱而分离。层析时饱和化合物由于吸附最弱而R f最高，最高，含一个双键的较含两个双键的含一个双键的较含两个双键的Rf值高，含一个三键值高，含一个三键的较含一个双键的的较含一个双键的Rf值高。此外，在一个双键化合值高。此外，在一个双键化合物中，顺式的与硝酸银络合较反式的易于进行。因物中，顺式的与硝酸银络合较反式的易于进行。因此，还可用来分离顺反异构体。此，还可用来分离顺反异构体。 2022-5-3海