生物光子学6-生物光子学中的光谱分析技术01

1、主讲人：刘立新西安电子科技大学第第 6 章章生物光子学中的光谱分析技术生物光子学中的光谱分析技术26.1 吸收光谱技术吸收光谱技术6.2 荧光光谱技术荧光光谱技术6.3 拉曼光谱技术拉曼光谱技术本本 章章 内内 容容36.1 吸收光谱技术吸收光谱技术6.1.1 光波的分类光波的分类6.1.2 紫外可见吸光光度法紫外可见吸光光度法6.1.3 紫外可见分光光度计紫外可见分光光度计6.1.4 吸收光谱吸收光谱技术技术在生物医学领域的应用在生物医学领域的应用46.1.1 光波的分类光波的分类根据光的波长不同根据光的波长不同：紫外区、可见光区和红外区等。紫外区、可见光区和红外区等。各类电磁辐射的波长范围

2、辐射类型辐射类型波长波长 （nm）无线电波1012109微 波109106红外线：远红外 1063103中红外 31043103近红外 3104770可见光770390紫外线39010X射线10102射线1021056.1 吸收光谱技术吸收光谱技术51、基本原理、基本原理:光的选择性吸收光的选择性吸收 分子中的某些基团吸收了紫外分子中的某些基团吸收了紫外/可见辐射光后，发生可见辐射光后，发生了电子能级跃迁，而产生了相应的吸收光谱。属于了电子能级跃迁，而产生了相应的吸收光谱。属于分子吸收光谱分子吸收光谱。 紫外紫外-可见吸收光谱分析可见吸收光谱分析是研究物质在紫外是研究物质在紫外-可见光可见光波

3、下的分子吸收光谱的分析方法。波下的分子吸收光谱的分析方法。6.1.2 紫外可见吸光光度法紫外可见吸光光度法6.1 吸收光谱技术吸收光谱技术6 紫外紫外-可见光区可细分为：可见光区可细分为： （1）10-200nm：远紫外光区：远紫外光区 （2）200-400nm：近紫外光区：近紫外光区 （3）400-800nm：可见光区：可见光区分子吸收光谱产生分子吸收光谱产生原理原理：图图6-1 分子吸收光谱产生原理分子吸收光谱产生原理原子或分子中的电子，总是处在某一原子或分子中的电子，总是处在某一种运动状态之中，每一种状态都具有一定种运动状态之中，每一种状态都具有一定的能量且属于一定的能级。的能量且属于一

4、定的能级。这些电子由于受光、热、电的激发等这些电子由于受光、热、电的激发等多种原因而从一个能级转到另一个能级的多种原因而从一个能级转到另一个能级的过程称为过程称为跃迁跃迁。因为这些电子吸收了外来辐射的能量因为这些电子吸收了外来辐射的能量后从低能级跃迁到高能级，因此每一次跃后从低能级跃迁到高能级，因此每一次跃迁都对应着电子吸收一定的辐射能量。具迁都对应着电子吸收一定的辐射能量。具有不同分子结构的各种物质，对电磁辐射有不同分子结构的各种物质，对电磁辐射有选择性的吸收有选择性的吸收。6.1 吸收光谱技术吸收光谱技术7 吸光光度法吸光光度法就是基于这种物质对电磁辐射的选择性吸收就是基于这种物质对电磁辐

5、射的选择性吸收的特性而建立起来的，在分子吸收光谱形成中所吸收的的特性而建立起来的，在分子吸收光谱形成中所吸收的能量与电磁辐射的频率成正比，即：能量与电磁辐射的频率成正比，即： EE2E1hhc/ (6-1) 式中式中E是吸收的能量，是吸收的能量，h为普朗克常数（为普朗克常数（6.626 10-34 Js），）， 是辐射频率，是辐射频率，c是光速，是光速，为波长。为波长。6.1 吸收光谱技术吸收光谱技术8 一般来说，一个分子吸收了外来辐射之后，它的能量变一般来说，一个分子吸收了外来辐射之后，它的能量变化化E为其振动能变化为其振动能变化E振振、转动能变化、转动能变化E转转以及电子运以及电子运动能量

6、变化动能量变化E电子电子的的总和总和，即，即 EE振振E转转E电子电子 （6-2） 在等式右边三项中，在等式右边三项中，E电子电子最大，一般在最大，一般在110eV。 E振振大约比大约比E电子电子小小10倍，而倍，而E转转约比约比E振振小小10倍到倍到100倍。倍。 由于分子内部电子能级变化而产生的光谱通常位于紫外或可由于分子内部电子能级变化而产生的光谱通常位于紫外或可见区内见区内，所以叫，所以叫UV-VIS吸收光谱技术吸收光谱技术。6.1 吸收光谱技术吸收光谱技术9分子的电子能级跃迁必定伴随着振动能级和转动能级的跃分子的电子能级跃迁必定伴随着振动能级和转动能级的跃迁，因此所得的迁，因此所得的

7、紫外紫外-可见吸收光谱可见吸收光谱常常不是谱线或窄带，常常不是谱线或窄带，而是而是由一定宽度的若干谱带系所组成由一定宽度的若干谱带系所组成。 朗朗伯伯-比尔（比尔（LambertBeer）定律）定律: A=lg(1/T)=bc （6-3） 6.1 吸收光谱技术吸收光谱技术10物理意义物理意义是当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物是当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时质时, 其吸光度其吸光度A与吸光物质的浓度与吸光物质的浓度c及吸收层厚度及吸收层厚度b成正比成正比. 入射光入射光 I0透射光透射光 It式中式中: A：吸光度；描述溶液对光的吸收程度；：吸光度；描述溶液对光

8、的吸收程度； T：为透过率，是透射光强度比上入射光强度；：为透过率，是透射光强度比上入射光强度； ：摩尔吸光系数，单位：摩尔吸光系数，单位 Lmol-1cm-1； b：液层厚度：液层厚度(光程长度光程长度)，通常以，通常以cm为单位；为单位； c：溶液的摩尔浓度，单位：溶液的摩尔浓度，单位 molL-1； 当被测物质含有两种以上的组分时，在单次散射的条当被测物质含有两种以上的组分时，在单次散射的条件下，在一定波长下的总吸收为各组分在该波长下吸件下，在一定波长下的总吸收为各组分在该波长下吸光率之和，即光率之和，即吸光吸光度度具有线性叠加性具有线性叠加性，其表达式为：，其表达式为：图图6-2 吸光

9、率加合原理图吸光率加合原理图6.1 吸收光谱技术吸收光谱技术1112NAAAA总 （6-4）吸光吸光率率加合原理可以用加合原理可以用图图6-2来表示，来表示，总的吸收总的吸收光谱特性应该是由不同光谱特性应该是由不同3种物质独立吸收的总种物质独立吸收的总和。和。2、特点、特点紫外可见吸光光度法是利用棱镜或光栅等紫外可见吸光光度法是利用棱镜或光栅等分光器分光器获获得纯度较高的紫外可见单色光得纯度较高的紫外可见单色光；根据物质对单色光的选择性吸收的特点来测定物质组根据物质对单色光的选择性吸收的特点来测定物质组份的分析方法份的分析方法；具有灵敏度高、准确度和稳定性较好、适用范围广、具有灵敏度高、准确度

10、和稳定性较好、适用范围广、所需仪器简单价低廉等优点。所需仪器简单价低廉等优点。6.1 吸收光谱技术吸收光谱技术12不饱和脂肪族有机化合物不饱和烃及共轭烯烃、不饱和烃及共轭烯烃、羟基化合物羟基化合物芳香化合物芳香化合物苯及其衍生物苯及其衍生物不饱和杂环化合物不饱和杂环化合物饱和有机化合物饱和有机化合物饱和烃及其取代衍生物饱和烃及其取代衍生物3、紫外吸收光谱与分子结构的关系、紫外吸收光谱与分子结构的关系有机化合物的紫外吸收光谱常被用作结构分析的依据：有机化合物的紫外吸收光谱常被用作结构分析的依据：6.1 吸收光谱技术吸收光谱技术131、发展历程、发展历程 利用紫外可见吸收光谱来进行定量分析由来已久

11、，可追溯到古利用紫外可见吸收光谱来进行定量分析由来已久，可追溯到古代代。公元公元60年，古希腊人已经开始利用五味子浸液来估计醋中铁年，古希腊人已经开始利用五味子浸液来估计醋中铁的含量的含量，由于最初是运用人眼来进行检测，所以又称比色法由于最初是运用人眼来进行检测，所以又称比色法。 20世纪世纪30年代产生了第一台光电比色计年代产生了第一台光电比色计。 20世纪世纪40年代出现的年代出现的Bakman UV分光光度计促进了这一学科的分光光度计促进了这一学科的进一步发展。进一步发展。 随着电子技术和计算机技术的高速发展，紫外可见分光光度计随着电子技术和计算机技术的高速发展，紫外可见分光光度计已开始

12、向着微型化、自动化、在线和多组分同时测定等方向发展已开始向着微型化、自动化、在线和多组分同时测定等方向发展并不断取得成果，已成为许多研究领域的一种常用检测手段。并不断取得成果，已成为许多研究领域的一种常用检测手段。6.1 吸收光谱技术吸收光谱技术146.1.3 紫外可见分光光度计紫外可见分光光度计 系统组成系统组成：主要由主要由光源、单色器、样品池、检测器和显光源、单色器、样品池、检测器和显示器示器五大部分组成。五大部分组成。 工作过程：工作过程：由光源产生的连续辐射，经过单色器后变为由光源产生的连续辐射，经过单色器后变为单色光，通过样品池（架）的待测样品后，一部分光被单色光，通过样品池（架）

13、的待测样品后，一部分光被吸收，而未被吸收的光穿过样品到达检测器，光信号转吸收，而未被吸收的光穿过样品到达检测器，光信号转化为电信号并放大和处理，最终信号数据被记录或由显化为电信号并放大和处理，最终信号数据被记录或由显示器显示示器显示。 2、紫外、紫外-可见分光光度计的基本构造可见分光光度计的基本构造光源光源 单色器单色器 样品池样品池 检测器检测器 显示器显示器6.1 吸收光谱技术吸收光谱技术15 1）光源）光源 在整个紫外光区或可见光区可以发射连续光谱在整个紫外光区或可见光区可以发射连续光谱(1801000nm) ，具有足够的辐射强度、较好的，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命

14、。稳定性、较长的使用寿命。 可见光区可见光区常用的光源是常用的光源是钨灯或碘钨灯钨灯或碘钨灯，波长范围，波长范围是是350-1000 nm。 在在紫外区紫外区常为常为氢灯或氘灯氢灯或氘灯，发射的连续波长范围，发射的连续波长范围是是180-360 nm。6.1 吸收光谱技术吸收光谱技术16卤钨灯钨灯6.1 吸收光谱技术吸收光谱技术176.1 吸收光谱技术吸收光谱技术182）单色器）单色器 单色器是将光源辐射的复合光分成单色光的光学装置。它是分单色器是将光源辐射的复合光分成单色光的光学装置。它是分光光度计的心脏部分。单色器一般由狭缝、色散元件及透镜系统组光光度计的心脏部分。单色器一般由狭缝、色散元

15、件及透镜系统组成。关键是色散元件，最常见的色散元件是棱镜和光栅。成。关键是色散元件，最常见的色散元件是棱镜和光栅。高质量的高质量的单色器可以单色器可以降低杂散光，使检测更为精确。降低杂散光，使检测更为精确。 狭缝：狭缝：将单色器的散射光切割成单色光。直接关系到仪器的分辨率将单色器的散射光切割成单色光。直接关系到仪器的分辨率。狭缝越小，光的单色性越好。分为入射狭缝和出射狭缝。狭缝越小，光的单色性越好。分为入射狭缝和出射狭缝。棱镜棱镜:玻璃玻璃3503200 nm，石英，石英1854000 nm。光栅光栅:波长范围宽，色散均匀，分辨性能好，使用方便。波长范围宽，色散均匀，分辨性能好，使用方便。54

16、3211.入射狭缝 2.准直透镜 3.棱镜 4.聚焦棱镜 5.出射狭缝6.1 吸收光谱技术吸收光谱技术196.1 吸收光谱技术吸收光谱技术20狭缝单色器6.1 吸收光谱技术吸收光谱技术213）吸收池）吸收池用于盛装试液的装置。吸收材料必须能够透过所测光谱范围的光。一用于盛装试液的装置。吸收材料必须能够透过所测光谱范围的光。一般可见光区使用玻璃吸收池，紫外光区使用石英吸收池。般可见光区使用玻璃吸收池，紫外光区使用石英吸收池。 规格有规格有0.5、1.0、2.0、5.0cm 等。等。样品池也称为比色皿样品池也称为比色皿，是由玻璃或石英组成的长方形容器，可装入待，是由玻璃或石英组成的长方形容器，可装

17、入待测的溶液。固体样品可用玻璃或石英材料的载玻片夹放并固定在样品测的溶液。固体样品可用玻璃或石英材料的载玻片夹放并固定在样品架上测量。最新的光度计还配有恒温池架和超微量池架等附件，可用架上测量。最新的光度计还配有恒温池架和超微量池架等附件，可用于特殊样品的光谱测量。于特殊样品的光谱测量。 在高精度的分析测定中（紫外区尤其重要）吸收池要挑选配对，因在高精度的分析测定中（紫外区尤其重要）吸收池要挑选配对，因为吸收池材料的本身吸光特性以及吸收池的光程长度的精度等对分析为吸收池材料的本身吸光特性以及吸收池的光程长度的精度等对分析结果都有影响结果都有影响。6.1 吸收光谱技术吸收光谱技术22比色皿氘灯石

18、英比色皿6.1 吸收光谱技术吸收光谱技术234. 检测器检测器 利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号 ，并进行放，并进行放大和处理大和处理。常用的有光电管、光电倍增管、光电二极管等。常用的有光电管、光电倍增管、光电二极管等。 要求灵敏度高、响应时间短、噪声水平低、稳定性好的优点。要求灵敏度高、响应时间短、噪声水平低、稳定性好的优点。新型光度计一般都采用光电倍增管，其光电流放大倍数为新型光度计一般都采用光电倍增管，其光电流放大倍数为106107。5. 显示器显示器将放大处理后的信号显示和记录将放大处理后的信号显示和记录的装置的装置。新型

19、光度计都采用计算机作为显示和记录新型光度计都采用计算机作为显示和记录器，并通过器，并通过Windows界面人机交互，不界面人机交互，不仅能对数据进行各种处理，而且还能对光仅能对数据进行各种处理，而且还能对光度计进行各种控制与操作度计进行各种控制与操作。6.1 吸收光谱技术吸收光谱技术24PMT6.1 吸收光谱技术吸收光谱技术25TU-1901型紫外可见分光光度计型紫外可见分光光度计 6.1 吸收光谱技术吸收光谱技术26UV-1801紫外紫外/可见分光光度计可见分光光度计6.1 吸收光谱技术吸收光谱技术27紫外可见分光光度计（紫外可见分光光度计（UV-2601）6.1 吸收光谱技术吸收光谱技术2

20、8 (一)按仪器使用波长分类： 真空紫外分光光度计（0.1-200 nm）； 可见分光光度计（350-700 nm）； 紫外-可见分光光度计（190-1100 nm）； 紫外-可见-红外分光光度计（190-2500 nm）；（二）按仪器使用的光学系统分类： 单光束分光光度计； 双光束分光光度计 双波长分光光度计 动力学分光光度计3、紫外、紫外-可见分光光度计的分类及特点可见分光光度计的分类及特点6.1 吸收光谱技术吸收光谱技术29 早期的分光光度计大多属于这种类型，特点是从光源到检测器早期的分光光度计大多属于这种类型，特点是从光源到检测器只有一条光路。只有一条光路。 经单色器分光后的一束平行光

21、，轮流通过参比溶液和样品溶液经单色器分光后的一束平行光，轮流通过参比溶液和样品溶液，以进行吸光度的测定。，以进行吸光度的测定。 简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度，一般不简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度，一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高的稳定性。能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高的稳定性。 样品池样品池 参比池参比池 1 1）单光束分光光度计单光束分光光度计6.1 吸收光谱技术吸收光谱技术301.单波长单光束分光光度计单波长单光束分光光度计特点：特点：使用时来回拉动吸使用时来回拉动吸收池收池 移动误差移动误差对光源要求高对光源要求高比色池配

22、对比色池配对 工作过程：工作过程：光源发出的光经过凹面聚光源发出的光经过凹面聚光镜、平面反射镜等一系列光器件后，光镜、平面反射镜等一系列光器件后，通过狭缝和样品池（架），最终到达通过狭缝和样品池（架），最终到达光电倍增管，经过转换和放大处理后，光电倍增管，经过转换和放大处理后，信号被显示或记录下来。这类光度计信号被显示或记录下来。这类光度计的特点是光路简单，但需要进行空白的特点是光路简单，但需要进行空白调零操作，且不能克服背景噪声对测调零操作，且不能克服背景噪声对测量的影响。量的影响。 6.1 吸收光谱技术吸收光谱技术31 光源经单色器分光后经反射镜分解为强度相等的两束光，一束光源经单色器分光

23、后经反射镜分解为强度相等的两束光，一束通过参比池（通过参比池（样品光路样品光路），一束通过样品池（，一束通过样品池（参比光路参比光路）。光度计。光度计能自动比较两束光的强度，此比值即为试样的透射比，经对数变换能自动比较两束光的强度，此比值即为试样的透射比，经对数变换将它转换成吸光度并作为波长的函数记录下来。将它转换成吸光度并作为波长的函数记录下来。 自动记录，快速全波段扫描。可消除光源不稳定、检测器灵敏自动记录，快速全波段扫描。可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于结构分析。仪器复杂，价格较高度变化等因素的影响，特别适合于结构分析。仪器复杂，价格较高。M1M4参比池参比池样

24、品池样品池M2M3）双光束分光光度计）双光束分光光度计6.1 吸收光谱技术吸收光谱技术32工作过程：工作过程：从光源从光源D2和和W发射的辐射经反射镜发射的辐射经反射镜M1、平面反射镜、平面反射镜M2、入口狭、入口狭缝缝S1达到准直镜达到准直镜M3形成平行光束，达到光栅形成平行光束，达到光栅G，被色散后经反射镜，被色散后经反射镜M3，出口狭缝出口狭缝S2，再经扇形镜，再经扇形镜Se1和反射镜和反射镜M4，交替地进入样品池（架）和参，交替地进入样品池（架）和参比池（架），最后又交替地经过比池（架），最后又交替地经过Se2，最终到达光电倍增管，最终到达光电倍增管PM，并经过，并经过转换和放大处理后

25、被显示或记录下来。转换和放大处理后被显示或记录下来。双光通路可以自动消除空白吸收，不需要进行空白调零操作。双光通路可以自动消除空白吸收，不需要进行空白调零操作。 双光束分光光度计的光路图双光束分光光度计的光路图6.1 吸收光谱技术吸收光谱技术33特点：特点：不用拉动吸收不用拉动吸收池，可以减小池，可以减小移动误差移动误差对光源要求不对光源要求不高高可以自动扫描可以自动扫描吸收光谱吸收光谱 ）双波长分光光度计）双波长分光光度计 由同一光源发出的光被分成两束，分别经过两个单色器，由同一光源发出的光被分成两束，分别经过两个单色器，得到两束不同波长（得到两束不同波长（ 1和和 2）的单色光；通过折波器

26、以一定的）的单色光；通过折波器以一定的频率交替通过同一样品池，然后由检测器交替接收信号，最频率交替通过同一样品池，然后由检测器交替接收信号，最后由显示器显示出两个波长处的吸光度差值后由显示器显示出两个波长处的吸光度差值A。 无需参比池。无需参比池。A就是扣除了背景吸收的吸光度。就是扣除了背景吸收的吸光度。6.1 吸收光谱技术吸收光谱技术34 对于多组分混合物、混浊试样（如生物组织液）分析，以对于多组分混合物、混浊试样（如生物组织液）分析，以及存在背景干扰或共存组分吸收干扰的情况下，利用双波长分及存在背景干扰或共存组分吸收干扰的情况下，利用双波长分光光度法，往往能提高方法的灵敏度和选择性。利用双

27、波长分光光度法，往往能提高方法的灵敏度和选择性。利用双波长分光光度计，能获得导数光谱。光光度计，能获得导数光谱。双波长双波长BECKMAN-DU_6406.1 吸收光谱技术吸收光谱技术35）动力学分光光度计）动力学分光光度计 解决在光化学反应、辐射化学反应和酶催化反应中，解决在光化学反应、辐射化学反应和酶催化反应中，能量转化、酶的降解、生物合成等的反应变化。能量转化、酶的降解、生物合成等的反应变化。 特点：时间辨别、快速扫描、测定生物化学瞬间产物特点：时间辨别、快速扫描、测定生物化学瞬间产物的吸收光谱和随时间变化值。的吸收光谱和随时间变化值。 6.1 吸收光谱技术吸收光谱技术36 波长范围：波

28、长范围：表示仪器能测定的波长范围。波长范围越表示仪器能测定的波长范围。波长范围越大，仪器越好，这与仪器使用的灯有关。大，仪器越好，这与仪器使用的灯有关。 波长精度：波长精度：表示仪器单色器波长误差程度。波长误差表示仪器单色器波长误差程度。波长误差越小，仪器精度越高，这与仪器使用的单色器有关。越小，仪器精度越高，这与仪器使用的单色器有关。 杂散光：杂散光：表示单色光的纯度，这与制作单色器的材料表示单色光的纯度，这与制作单色器的材料和加工工艺有关。和加工工艺有关。4、紫外、紫外-可见分光光度计主要技术指标可见分光光度计主要技术指标6.1 吸收光谱技术吸收光谱技术37 光度的测量精度：光度的测量精度

29、：表示仪器每次测定显示读数的精确表示仪器每次测定显示读数的精确度，即仪器能准确读小数点后几位。位数越多，仪器度，即仪器能准确读小数点后几位。位数越多，仪器精度越高，这与仪器使用的检测系统有关。精度越高，这与仪器使用的检测系统有关。 光度测量的重现性：光度测量的重现性：每次每次A A读数的重现性，这与仪器使读数的重现性，这与仪器使用的检测器的质量有关。用的检测器的质量有关。 分辨率：分辨率：表示仪器分辨吸收光谱微细结构的能力，即表示仪器分辨吸收光谱微细结构的能力，即指仪器对于紧密相邻的峰可分辨的最小波长间距，这指仪器对于紧密相邻的峰可分辨的最小波长间距，这是衡量仪器性能的一个综合指标。是衡量仪器

30、性能的一个综合指标。6.1 吸收光谱技术吸收光谱技术385、影响紫外可见吸收光谱的主要因素影响紫外可见吸收光谱的主要因素（1）仪器的单色性（分辨率）仪器的单色性（分辨率）: 郎伯郎伯-比尔吸收定律只有在入射光为单色比尔吸收定律只有在入射光为单色光（指单一波长）时成立。而紫外可见分光光度计测量用的入射光光（指单一波长）时成立。而紫外可见分光光度计测量用的入射光是通过连续辐射光源和单色器获得的，为了得到一定强度的光强，狭是通过连续辐射光源和单色器获得的，为了得到一定强度的光强，狭缝不可能很窄，因而入射光不是纯单色光而是有一定的光谱通带。光缝不可能很窄，因而入射光不是纯单色光而是有一定的光谱通带。光

31、谱通带的宽度和光谱分辩率谱通带的宽度和光谱分辩率成成反比。反比。（2）化学变化）化学变化: 当被测物浓度过高时，粒子之间有相互作用，影响光谱当被测物浓度过高时，粒子之间有相互作用，影响光谱的准确性；此外有些物质在光辐射下发射光化学反应而退色，或者产的准确性；此外有些物质在光辐射下发射光化学反应而退色，或者产生荧光或磷光，使吸收物质的性质发生变化，从而引起偏差。生荧光或磷光，使吸收物质的性质发生变化，从而引起偏差。（3）散射的影响）散射的影响: 郎伯郎伯-比尔吸收定律要求吸收物质应当是均匀的，只发比尔吸收定律要求吸收物质应当是均匀的，只发生单次散射和透射。这就要求待测物质若是溶液，则浓度不应过大

32、；生单次散射和透射。这就要求待测物质若是溶液，则浓度不应过大；对于生物组织等样本则要求厚度要尽可能小（对于生物组织等样本则要求厚度要尽可能小（100m），否则宜造），否则宜造成偏差。成偏差。6.1 吸收光谱技术吸收光谱技术396、紫外、紫外-可见吸收光谱法的应用可见吸收光谱法的应用1 1）定性分析）定性分析 通常根据通常根据吸收光谱的形状吸收光谱的形状、吸收峰的数目吸收峰的数目以及以及最大吸收波长最大吸收波长的位置的位置和和相应的摩尔吸收系数相应的摩尔吸收系数进行定性鉴定。进行定性鉴定。 一般采用一般采用比较光谱法比较光谱法：即在相同的测定条件下，比较待测物：即在相同的测定条件下，比较待测物与

33、已知标准物的吸收光谱曲线，如果它们的吸收光谱曲线完全等与已知标准物的吸收光谱曲线，如果它们的吸收光谱曲线完全等同，则可认为是同一物质。同，则可认为是同一物质。6.1 吸收光谱技术吸收光谱技术402）结构分析）结构分析 判断所含官能团、有机化合物的同分异构体。判断所含官能团、有机化合物的同分异构体。 （例如：某一化合物在（例如：某一化合物在250-300nm有强吸收带，则表示存在苯环有强吸收带，则表示存在苯环的特征吸收；若在的特征吸收；若在210-350nm有强吸收带，则可能含有两个双有强吸收带，则可能含有两个双键的共轭单位。）键的共轭单位。）3）纯度鉴定）纯度鉴定 根据在吸收光谱最大吸收峰的位

34、置和峰形状、数量判断该物质根据在吸收光谱最大吸收峰的位置和峰形状、数量判断该物质的纯度。的纯度。4）定量分析）定量分析 根据朗伯根据朗伯比尔定律，物质在一定波长处的吸光度与它的浓度比尔定律，物质在一定波长处的吸光度与它的浓度呈线性关系。所以通过测定溶液对一定波长入射光的吸光度，呈线性关系。所以通过测定溶液对一定波长入射光的吸光度，便可求得溶液的浓度和含量。紫外可见分光光度法不仅用于测便可求得溶液的浓度和含量。紫外可见分光光度法不仅用于测定微量成分，而且用于常量组分和多组分混合物的测定。定微量成分，而且用于常量组分和多组分混合物的测定。 6.1 吸收光谱技术吸收光谱技术41定性分析与定量分析的基

35、础定性分析与定量分析的基础定性分析基础定性分析基础定量分析基础定量分析基础物质对光的选择吸收物质对光的选择吸收物质物质的电子结构不同，所能吸收的电子结构不同，所能吸收光的波长也不同，这就构成光的波长也不同，这就构成了物质对光的选择吸收基础。了物质对光的选择吸收基础。ABA )(maxA)(maxB在一定的实验条件下，物质在一定的实验条件下，物质对光的吸收与物质的浓度成对光的吸收与物质的浓度成正比。正比。A C增增大大6.1 吸收光谱技术吸收光谱技术426.1.4 吸收光谱在生物医学领域的应用吸收光谱在生物医学领域的应用 在生物组织中，吸收主要由水分子和蛋白质以及色素在生物组织中，吸收主要由水分

36、子和蛋白质以及色素等大分子引起。蛋白质和色素主要吸收的是紫外光和等大分子引起。蛋白质和色素主要吸收的是紫外光和可见光，而在光谱红外区的吸收主要是水分子引起。可见光，而在光谱红外区的吸收主要是水分子引起。 生物医学领域利用吸收光谱做研究已取得很多的研究生物医学领域利用吸收光谱做研究已取得很多的研究成果成果 Wayne A. Ciesielski等研究了在等研究了在不同温度和不同温度和pH下肌球素吸收下肌球素吸收光谱光谱，肌球素是骨骼肌和心肌中的一种重要的氧传输分子。他，肌球素是骨骼肌和心肌中的一种重要的氧传输分子。他们研究发现在相同的们研究发现在相同的pH下，在每下，在每10温度变化下，肌球素的

37、温度变化下，肌球素的吸收光谱在吸收光谱在760nm附近有附近有0.9-1.2nm的峰移现象；而在相同的的峰移现象；而在相同的温度下，温度下，pH不同肌球素的峰移现象并不明显。这一研究表明，不同肌球素的峰移现象并不明显。这一研究表明，温度变化是标定和测试吸收光谱的主要误差因素。温度变化是标定和测试吸收光谱的主要误差因素。6.1 吸收光谱技术吸收光谱技术43 苏玉玲和张晓冬等分别运用分光光度计对苏玉玲和张晓冬等分别运用分光光度计对恶性骨肿瘤患者的血清和恶性骨肿瘤患者的血清和食管癌患者的血浆进行吸收光谱检测食管癌患者的血浆进行吸收光谱检测。肿瘤患者在肿瘤患者在414nm处和健康处和健康人血清的吸收光

38、谱有明显差异。人血清的吸收光谱有明显差异。图图6-4是正常人与骨肿瘤患者血清是正常人与骨肿瘤患者血清的吸收光谱。同时他们通过其特征谱带的吸光度比值（的吸收光谱。同时他们通过其特征谱带的吸光度比值（I279 / I253）作为特征值作为进行统计分析作为特征值作为进行统计分析,结果发现在结果发现在20 例正常人血清中例正常人血清中,有有19例血清光谱的比值都大于例血清光谱的比值都大于1.87；但在；但在10例恶性骨肿瘤患者血清中例恶性骨肿瘤患者血清中,有有7例患者血清光谱的比值都小于例患者血清光谱的比值都小于1. 87；而对于食管癌患者和正常人；而对于食管癌患者和正常人血清分析血清分析,其特征谱带

39、的吸光度比值（其特征谱带的吸光度比值（I277.0 / I253.5），正常人血），正常人血浆的光谱比值浆的光谱比值71. 4 %都大于都大于1.8 , 而食管癌血浆的光谱比值而食管癌血浆的光谱比值87.5 %都小于都小于1.8。他们判断。他们判断这一吸收峰可能是红细胞的贡献，表明肿瘤这一吸收峰可能是红细胞的贡献，表明肿瘤患者红细胞寿命短，容易发生溶血现象，从而引起吸收光谱的差异患者红细胞寿命短，容易发生溶血现象，从而引起吸收光谱的差异。总之总之,可以通过血浆吸收光谱中某些特征谱带的吸光度比值来初步诊可以通过血浆吸收光谱中某些特征谱带的吸光度比值来初步诊断癌症患者断癌症患者, 为早期快速诊断食

40、管癌提供了一种新的思路。为早期快速诊断食管癌提供了一种新的思路。6.1 吸收光谱技术吸收光谱技术44图图6-4 6-4 恶性骨肿瘤患者血清与健康血清的吸收光谱恶性骨肿瘤患者血清与健康血清的吸收光谱6.1 吸收光谱技术吸收光谱技术45 熊建文等研究了用于光动力治疗肿瘤常用的熊建文等研究了用于光动力治疗肿瘤常用的光敏剂光敏剂5-氨基酮戊酸氨基酮戊酸（5-aminolevlinic acid , ALA）在不同条件下的吸收光谱）在不同条件下的吸收光谱。如图。如图6-5所示，结果表明单纯所示，结果表明单纯ALA的最大吸收峰在的最大吸收峰在270nm；在培养液中在培养液中ALA浓度增加则吸收加大浓度增加

41、则吸收加大；而在；而在同一浓度下白血病细胞浓度增大同一浓度下白血病细胞浓度增大则吸收减小则吸收减小。 图图6-5 不同条件下不同条件下 ALA的吸收光谱的吸收光谱6.1 吸收光谱技术吸收光谱技术46 如图如图6-6所示，徐正红研究了所示，徐正红研究了家兔心室不同厚度（家兔心室不同厚度（40、45、50和和55 m）组织切片的吸收光谱）组织切片的吸收光谱。其中图。其中图6-6（a）是不同厚度切片的吸收）是不同厚度切片的吸收光谱，而图光谱，而图6-6 （b）是其强度归一化后的吸收光谱。从图中可以看）是其强度归一化后的吸收光谱。从图中可以看出，出，随着光波波长的减小，组织的吸收增大，但在随着光波波长

42、的减小，组织的吸收增大，但在400450nm有一有一个明显的吸收峰。个明显的吸收峰。此外，将组织不同厚度切片的吸收光谱的强度归一此外，将组织不同厚度切片的吸收光谱的强度归一化后其峰位基本不变。化后其峰位基本不变。 6.1 吸收光谱技术吸收光谱技术47（a） 不同厚度切片的吸收光谱不同厚度切片的吸收光谱 （b） 不同厚度切片强度归一化后的吸收光谱图不同厚度切片强度归一化后的吸收光谱图 图图6-6 左心室组织切片的吸收光谱左心室组织切片的吸收光谱47Quiz 1 什么是吸收光谱技术？什么是吸收光谱技术？ 吸收光谱技术在生物医学领域的应用有吸收光谱技术在生物医学领域的应用有哪些？哪些？486.1 吸

43、收光谱技术吸收光谱技术6.2 荧光光谱技术荧光光谱技术6.3 拉曼光谱技术拉曼光谱技术本本 章章 内内 容容496.2 荧光光谱技术荧光光谱技术6.2.1 荧光光度法荧光光度法 原理与特点原理与特点 荧光光谱的分类荧光光谱的分类 影响生物荧光的主要因素影响生物荧光的主要因素6.2.2 荧光物质荧光物质 自体荧光发色团自体荧光发色团 荧光探针荧光探针 量子点量子点6.2.3 荧光光度计荧光光度计6.2.4 稳态荧光光谱的应用稳态荧光光谱的应用 6.2.5 瞬态荧光光谱的应用瞬态荧光光谱的应用 506.2.1 荧光光度法荧光光度法1、原理与特点原理与特点荧光的荧光的产生原理产生原理主要基于主要基于

44、Stokes效应，包括以下三个过程：效应，包括以下三个过程： （1） 物质的分子吸收一定的光能，从基态激发到激发态；物质的分子吸收一定的光能，从基态激发到激发态；（2） 分子从高能态很快（约分子从高能态很快（约1012s）到一个不稳定的高能级；）到一个不稳定的高能级；（3）当分子从不稳定的高能态返回基态时会伴随光子产生，即有荧光产）当分子从不稳定的高能态返回基态时会伴随光子产生，即有荧光产生。生。图图6-7 荧光产生的原理图荧光产生的原理图6.2 荧光光谱技术荧光光谱技术51荧光光谱有以下特点：荧光光谱有以下特点： （1）荧光光谱的形状和激发光波长无关荧光光谱的形状和激发光波长无关。这是因为荧

45、光的产这是因为荧光的产生是由第一电子激发态的最低振动能级开始的生是由第一电子激发态的最低振动能级开始的,而和荧光物而和荧光物质分子被激发至哪一个能级无关；质分子被激发至哪一个能级无关；（2）荧光光谱的形状和吸收光谱的形状十分相似但不一定重荧光光谱的形状和吸收光谱的形状十分相似但不一定重合。合。近似是因为吸收光谱反映的是第一电子激发态的能级近似是因为吸收光谱反映的是第一电子激发态的能级分布情况，荧光光谱反映的是基态能级的分布情况。由于分布情况，荧光光谱反映的是基态能级的分布情况。由于基态中能级的分布和第一电子激发态中的能级分布是相类基态中能级的分布和第一电子激发态中的能级分布是相类似的，所以荧光

46、光谱的形状与吸收光谱近似。但由于测量似的，所以荧光光谱的形状与吸收光谱近似。但由于测量仪器等因素的影响，大多数情况下得到的激发光谱与吸收仪器等因素的影响，大多数情况下得到的激发光谱与吸收光谱不重合。光谱不重合。6.2 荧光光谱技术荧光光谱技术52 和紫外可见吸收光谱进行物质的定性和紫外可见吸收光谱进行物质的定性、定量分析定量分析相比，相比，荧光分析法有以下优点荧光分析法有以下优点：（1） 灵敏度高灵敏度高（2） 特异性好特异性好，而且，而且荧光光谱可以检测那些紫外荧光光谱可以检测那些紫外-可可见吸收光谱检测不到的过程见吸收光谱检测不到的过程6.2 荧光光谱技术荧光光谱技术532、荧光光谱的分类

47、荧光光谱的分类 荧光光谱包括荧光光谱包括内源性（内源性（如如组织体自体荧光）光谱组织体自体荧光）光谱和和外外源性（源性（如如药物）荧光光谱药物）荧光光谱。 根据所选用的不同激发光源和检测方式根据所选用的不同激发光源和检测方式，荧光光谱可荧光光谱可以分为以分为稳态稳态和和时间分辨（瞬态）荧光光谱时间分辨（瞬态）荧光光谱。前者主要前者主要测量荧光的激发光谱、发射光谱、三维荧光光谱等；测量荧光的激发光谱、发射光谱、三维荧光光谱等；后者主要表现对荧光寿命的检测。后者主要表现对荧光寿命的检测。6.2 荧光光谱技术荧光光谱技术54图图6-8 四种荧光光谱四种荧光光谱（c） 新鲜心室组织三维荧光光谱新鲜心室

48、组织三维荧光光谱（等角三维投影图）（等角三维投影图）（d）488nm癌细胞（癌细胞（MOL T-4）（曲线（曲线1）与正常细胞（曲线）与正常细胞（曲线2）的）的时间分辨荧光光谱时间分辨荧光光谱 (b）心脏不同部位组织在）心脏不同部位组织在340nm激发光下的荧光发射光谱激发光下的荧光发射光谱（ a ） 在 心 室 组 织 中 染 料） 在 心 室 组 织 中 染 料 d i - 4 -ANEPPS在在570nm时的荧光激发光谱时的荧光激发光谱6.2 荧光光谱技术荧光光谱技术55（1）荧光激发光谱）荧光激发光谱 简称激发光谱（简称激发光谱（Excitation Spectrum），是荧光物质），

49、是荧光物质在不同波长的激发光作用下测得的某一波长处的荧光强在不同波长的激发光作用下测得的某一波长处的荧光强度的变化情况，也就是不同波长的激发光的相对效率。度的变化情况，也就是不同波长的激发光的相对效率。 （a）在心室组织中染料）在心室组织中染料di-4-ANEPPS在在570nm时的荧光激发光谱时的荧光激发光谱6.2 荧光光谱技术荧光光谱技术56（2）荧光发射光谱）荧光发射光谱 （Emission Spectrum） 在某一固定波长的激发光作用下在某一固定波长的激发光作用下，荧光强度在不同波长处的分布情况，荧光强度在不同波长处的分布情况，也就是荧光中不同波长的光成分的相对强度。也就是荧光中不同

50、波长的光成分的相对强度。 同一荧光物质其荧光光谱的形状与激发波长无关。同一荧光物质其荧光光谱的形状与激发波长无关。不同荧光物质的结构不同荧光物质的结构不同，其基态与高能态间的能量差不一样，而基态中各振动能级的分布不同，其基态与高能态间的能量差不一样，而基态中各振动能级的分布也不一样，所以产生的荧光光谱是不同的，由此可以用荧光光谱进行定也不一样，所以产生的荧光光谱是不同的，由此可以用荧光光谱进行定性分析。当激发光强度、波长、所用溶剂及温度等条件固定时，物质在性分析。当激发光强度、波长、所用溶剂及温度等条件固定时，物质在一定浓度范围内，其发射光强度与溶液中该物质的浓度成正比关系，可一定浓度范围内，

51、其发射光强度与溶液中该物质的浓度成正比关系，可以用作定量分析。以用作定量分析。 6.2 荧光光谱技术荧光光谱技术57(b）心脏不同部位组织在）心脏不同部位组织在340nm激发光下的荧光发射激发光下的荧光发射光谱光谱（3）三维荧光光谱）三维荧光光谱 在荧光激发光谱和荧光发射光谱测量的基础上，近十几年还在荧光激发光谱和荧光发射光谱测量的基础上，近十几年还发展起来一种新的荧光分析技术发展起来一种新的荧光分析技术三维荧光光谱。这种技三维荧光光谱。这种技术和普通光分析技术的不同之处在于，一般的荧光激发谱和术和普通光分析技术的不同之处在于，一般的荧光激发谱和荧光发射谱是二维的，反映的是荧光物质随激发波长或

52、发射荧光发射谱是二维的，反映的是荧光物质随激发波长或发射波长的荧光光强变化；而它是三维的，即波长的荧光光强变化；而它是三维的，即可以获得激发波长可以获得激发波长与发射波长同时变化与发射波长同时变化时时的荧光强度信息。的荧光强度信息。 6.2 荧光光谱技术荧光光谱技术58（c） 新鲜心室组织三维荧光光谱新鲜心室组织三维荧光光谱（等角三维投影图）（等角三维投影图）（4）时间分辨荧光光谱）时间分辨荧光光谱 以上三种光谱是稳态荧光光谱，而时间分辨荧光光谱是测量荧光寿命。以上三种光谱是稳态荧光光谱，而时间分辨荧光光谱是测量荧光寿命。 不同的荧光物质在一定波长的激发光和荧光检测波长下具有不同的荧光寿不同的

53、荧光物质在一定波长的激发光和荧光检测波长下具有不同的荧光寿命，根据时间分辨荧光光谱命，根据时间分辨荧光光谱，可以区分不同的荧光物质。尽管样本的荧可以区分不同的荧光物质。尽管样本的荧光寿命也随激发波长和荧光检测波长的不同而发生变化光寿命也随激发波长和荧光检测波长的不同而发生变化, 但在相同测试条但在相同测试条件下件下，生物生化特性的差异会导致荧光寿命生物生化特性的差异会导致荧光寿命的的差异差异，可利用这一特性进，可利用这一特性进行癌症早期诊断行癌症早期诊断。 6.2 荧光光谱技术荧光光谱技术59（d）488nm癌细胞（癌细胞（MOL T-4）（曲线（曲线1）与正常细胞（曲线）与正常细胞（曲线2）

54、的）的时间分辨荧光光谱时间分辨荧光光谱 3、影响生物荧光的主要因素影响生物荧光的主要因素 影响荧光强度的影响荧光强度的主要因素主要因素是荧光量子产额是荧光量子产额 f，其定义，其定义为：为： 它反映了荧光物质发射荧光的能力，其值越大物质发它反映了荧光物质发射荧光的能力，其值越大物质发射出的荧光也越强。射出的荧光也越强。 吸收的光子数发射的光子数f6.2 荧光光谱技术荧光光谱技术60影响生物荧光的主要因素有：影响生物荧光的主要因素有： （1）样本种类：不同生物样本含有不同的荧光物质，相同荧光物）样本种类：不同生物样本含有不同的荧光物质，相同荧光物质浓度和分布也不相同，其荧光强度和谱质浓度和分布也

55、不相同，其荧光强度和谱的形状的形状是不同的是不同的。（2）生物新陈代谢水平：某些生物的荧光物质的浓度是和生物的）生物新陈代谢水平：某些生物的荧光物质的浓度是和生物的新陈代谢水平相关的，可以反映样本活性新陈代谢水平相关的，可以反映样本活性。（3）环境温度：温度降低，荧光的量子产额和荧光光强增大）环境温度：温度降低，荧光的量子产额和荧光光强增大。（4）pH值：酸碱度变化会影响有关荧光物质的分布，从而也影响值：酸碱度变化会影响有关荧光物质的分布，从而也影响荧光光强荧光光强。（5）处理方式：同一离体样本在不同的处理步骤和放置环境下（）处理方式：同一离体样本在不同的处理步骤和放置环境下（如灌注、冷冻等）

56、，其生化特性不同则荧光光谱会存在差异如灌注、冷冻等），其生化特性不同则荧光光谱会存在差异。6.2 荧光光谱技术荧光光谱技术616.2.2 荧光物质荧光物质 能发出荧光的物质称为荧光发色团。生物的荧光物质可能发出荧光的物质称为荧光发色团。生物的荧光物质可以根据发色团种类不同分为两大类：自体荧光发色团和以根据发色团种类不同分为两大类：自体荧光发色团和荧光探针（也称药物荧光剂）。荧光探针（也称药物荧光剂）。1、自体荧光自体荧光发色团发色团 所谓所谓“自体荧光自体荧光”是指无是指无需需外加光敏物质，生物组织被外加光敏物质，生物组织被一定波长的光激发后一定波长的光激发后, 处于激发态的分子在处于激发态的

57、分子在回回到基态的过到基态的过程中程中, 以光子的形式释放所吸收的能量，即产生了荧光以光子的形式释放所吸收的能量，即产生了荧光。6.2 荧光光谱技术荧光光谱技术62组织内产生自体荧光必须具备三个条件：组织内产生自体荧光必须具备三个条件：（1）组织中包含足够浓度的内源性荧光物质，如卟啉（）组织中包含足够浓度的内源性荧光物质，如卟啉（Pyridoxine）、色氨酸（）、色氨酸（Tryptophon）、胶原质（）、胶原质（Collagen）、弹性蛋白（）、弹性蛋白（Elastin）、还原烟碱腺嘌呤）、还原烟碱腺嘌呤二核苷酸（二核苷酸（NADH）和黄素（）和黄素（flavins， FAD）等；）等；（

58、2）组织能吸收激发的光子，不同内源性荧光物质的吸）组织能吸收激发的光子，不同内源性荧光物质的吸收波长范围不相同；收波长范围不相同；（3）组织能辐射出次级光子，即荧光。不同内源性荧光）组织能辐射出次级光子，即荧光。不同内源性荧光物质发出荧光的波长不同，有些波长范围包含不同物物质发出荧光的波长不同，有些波长范围包含不同物质的荧光，其光谱有重叠现象。质的荧光，其光谱有重叠现象。6.2 荧光光谱技术荧光光谱技术63影响自体荧光的因素影响自体荧光的因素1）新陈代谢新陈代谢2）样本种类样本种类3）温度温度4）pH值值5）样本处理方式样本处理方式 6.2 荧光光谱技术荧光光谱技术64 自体荧光的应用自体荧光

59、的应用 1）可以检测和确定组织的生化成份和含量。可以检测和确定组织的生化成份和含量。荧光发射荧光发射光谱是不同组织、不同的结构、不同的生化和物化特性等生物组光谱是不同组织、不同的结构、不同的生化和物化特性等生物组织本质信息的真实反映，相同组织荧光光谱相似，不同组织的荧织本质信息的真实反映，相同组织荧光光谱相似，不同组织的荧光光谱存在差异。光光谱存在差异。 2） 可以作为癌症早期诊断的依据。可以作为癌症早期诊断的依据。肿瘤组织及其它病变肿瘤组织及其它病变组织的生长特性和局部环境不同于相应的正常组织。这是因为组组织的生长特性和局部环境不同于相应的正常组织。这是因为组织的物理和化学特性都发生了变化织

60、的物理和化学特性都发生了变化, 导致内源荧光发色团的浓度导致内源荧光发色团的浓度或空间分布，发色团的微环境以及局部组织结构等发生改变，造或空间分布，发色团的微环境以及局部组织结构等发生改变，造成样本自体荧光光谱在荧光强度、峰成样本自体荧光光谱在荧光强度、峰值值位置、峰值变化速率、不位置、峰值变化速率、不同峰值之间的比值和荧光寿命等方面会存在差异。这些光谱变化同峰值之间的比值和荧光寿命等方面会存在差异。这些光谱变化反映了病变细胞及组织的特异性。反映了病变细胞及组织的特异性。6.2 荧光光谱技术荧光光谱技术65 自体自体荧光荧光团激发与发射谱列表团激发与发射谱列表 6.2 荧光光谱技术荧光光谱技术