第四章之二 愈伤组织的诱导、形成及分化

1、第一节第一节 愈伤组织的概念及类型愈伤组织的概念及类型第一节第一节 愈伤组织的诱导和形成愈伤组织的诱导和形成第三节第三节 愈伤组织的继代及其生长分析愈伤组织的继代及其生长分析第四节第四节 愈伤组织形态建成愈伤组织形态建成 第五节第五节 愈伤组织的形成及其生理生化基础愈伤组织的形成及其生理生化基础掌握愈伤组织的概念和愈伤组织的诱导、形成及其特点以及愈伤组织的形态建成和调控掌握愈伤组织形态建成及其调控理解愈伤组织形成及形态建成的的生理生化基础引言引言 一、植物细胞的全能性一、植物细胞的全能性定义：定义：植物体的每一个体细胞或性细胞，在一定离体植物体的每一个体细胞或性细胞，在一定离体培养条件下都具有

2、再生成完整植株的能力。培养条件下都具有再生成完整植株的能力。 植物体细胞培养产生完整植株示意图植物体细胞培养产生完整植株示意图ACBv植物细胞全能性是通过植物细胞全能性是通过生命周期生命周期、细胞周期细胞周期和和组织培养周期组织培养周期来实现的。来实现的。v图中图中A循环表示生命周期，包括孢子体和配子体的世代交替循环表示生命周期，包括孢子体和配子体的世代交替来实现细胞全能型。来实现细胞全能型。vB循环表示细胞周期，即细胞所决定的核质周期，由于核质循环表示细胞周期，即细胞所决定的核质周期，由于核质相全能性；相互作用，相全能性；相互作用，DNA复制、转录复制、转录mRNA并翻译为蛋并翻译为蛋白质，

3、使循细胞全能性得以形成和保持；白质，使循细胞全能性得以形成和保持；vC循环是组织培养周期，表示组织和细胞与供体失去联系，循环是组织培养周期，表示组织和细胞与供体失去联系，在离体条件下，靠人工合成培养基中的养分，通过细胞脱分在离体条件下，靠人工合成培养基中的养分，通过细胞脱分化、分裂、再分化来实现全能性。化、分裂、再分化来实现全能性。 全能性的差异全能性的差异 表达全能性的前提：表达全能性的前提： 生活细胞生活细胞 分生状态或胚性细胞状态分生状态或胚性细胞状态 胚性细胞胚性细胞 植物胚胎干细胞植物胚胎干细胞 成熟组织中的胚性细胞成熟组织中的胚性细胞植物细胞的分类：植物细胞的分类：1.茎尖、根尖、

4、形成层。茎尖、根尖、形成层。2.表皮细胞和薄壁细胞。表皮细胞和薄壁细胞。3.导管、筛管、管胞、纤维细胞。导管、筛管、管胞、纤维细胞。二、植物细胞的分化二、植物细胞的分化 v植物细胞分化：植物细胞分化：differentiation 导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。育方式改变的过程。v细胞分化是多细胞生物体形态发生的基础。 v细胞分化在植物形态建成中是一个核心问题，没有细胞的分化就没有形态建成。 v植物发育和细胞分裂、生长、分化有时间和空间上的必然联系。二、植物细胞的脱分化二、植物细胞的脱分化 Dedifferentiatio

5、n1、脱分化与细胞分裂的关系、脱分化与细胞分裂的关系两个观点两个观点 细胞分裂是脱分化的细胞分裂是脱分化的过程过程 细胞分裂是脱分化的细胞分裂是脱分化的结果结果2、脱分化过程中的生理活动与细胞结构、脱分化过程中的生理活动与细胞结构 启动阶段启动阶段：胞质增生，向中央伸出细胞质丝，胞质增生，向中央伸出细胞质丝，液液 泡蛋白体出现泡蛋白体出现； 演变阶段演变阶段：细胞核向中央移动，细胞核向中央移动，质体演变成原质质体演变成原质 体；体； 终结阶段终结阶段：恢复到分生细胞状态恢复到分生细胞状态3、脱分化调控机理、脱分化调控机理 细胞周期调控细胞周期调控细胞周期蛋白细胞周期蛋白 cyclin（cycB

6、 、 cycD） 周期蛋白依赖激酶周期蛋白依赖激酶 CDK（CDK-a CDK-b)周期蛋白依赖激酶抑制子周期蛋白依赖激酶抑制子 CKI外界因素对植物细胞分化的影响外界因素对植物细胞分化的影响v任何一个分化的细胞都具有保持分生组织状态的潜力 v在各种外界因素中，外源激素对脱分化起重要的作用 激素调控激素调控添加生长素：添加生长素：菊苣菊苣添加细胞分裂素：添加细胞分裂素：大豆、萝卜大豆、萝卜添加生长素和细胞分裂素素：添加生长素和细胞分裂素素：胡萝卜胡萝卜不添加激素：不添加激素：冠瘿组织、烟草肿瘤组织冠瘿组织、烟草肿瘤组织 4、细胞分裂及结果、细胞分裂及结果正常的二倍体细胞：第一次分裂为有丝分裂正

7、常的二倍体细胞：第一次分裂为有丝分裂高倍化细胞：第一次分裂多为无丝分裂高倍化细胞：第一次分裂多为无丝分裂二、植物细胞再分化二、植物细胞再分化Redifferentiation：离体条件下，细胞：离体条件下，细胞脱分化形成的无序细胞团或愈伤组织重新脱分化形成的无序细胞团或愈伤组织重新进入有序分裂再生为植株个体的过程。进入有序分裂再生为植株个体的过程。表1 离体条件下IAA和蔗糖浓度对木质部和韧皮部分化的作用 IAA浓度 蔗糖浓度 木质部/韧皮部形成 0.05mg/L 1% 很少量木质部形成 2 较好的木质部的形成，很少量韧皮部或没有韧皮部的形成 2.53.5 同时形成木质部和韧皮部 4 韧皮部形

8、成，很少或没有木质部形成 三、器官的分化三、器官的分化 器官发生途径器官发生途径和和体细胞胚发生途径体细胞胚发生途径定义：离体培养下的组织或细胞团分化形成不定根、定义：离体培养下的组织或细胞团分化形成不定根、不定芽等器官的过程。不定芽等器官的过程。 器官发生方式先芽后根先芽后根先根后芽先根后芽愈伤组织途径愈伤组织途径器官发生途径器官发生途径1 1 经过愈伤组织的情况经过愈伤组织的情况外植体经诱导形成愈伤组织外植体经诱导形成愈伤组织“生长中心生长中心”形成形成器官原基及器官形成器官原基及器官形成2 2 不经过愈伤组织不经过愈伤组织直接由原基发生直接由原基发生分生细胞团发生分生细胞团发生 愈伤组织

9、培养在离体培养体系中的地位愈伤组织培养在离体培养体系中的地位外植体外植体花药和花粉花药和花粉愈伤组织愈伤组织悬浮培养物悬浮培养物再生植株再生植株原生质体原生质体再生组织再生组织次生代谢物次生代谢物悬浮细胞悬浮细胞为什么要进行愈伤组织培养为什么要进行愈伤组织培养v无性繁殖并大量扩繁被培养的植物；无性繁殖并大量扩繁被培养的植物； v 为细胞悬浮培养和次生代谢产物生产与利用、原为细胞悬浮培养和次生代谢产物生产与利用、原生质体培养和细胞融合提供易于操作的起始材料；生质体培养和细胞融合提供易于操作的起始材料； v 为植物体细胞无性系变异、细胞突变体筛选创造为植物体细胞无性系变异、细胞突变体筛选创造适宜的

10、体系和基础；适宜的体系和基础； v 为外源基因的遗传转化提供便于保存和利用的操为外源基因的遗传转化提供便于保存和利用的操作对象；作对象； v 为种质资源的保存提供新的形式；为种质资源的保存提供新的形式； v 为离体研究植物组织和细胞分裂、分化、代谢和为离体研究植物组织和细胞分裂、分化、代谢和状态的转变创造适宜的材料和体系。状态的转变创造适宜的材料和体系。第一节第一节 愈伤组织的概念及类型愈伤组织的概念及类型一、定义一、定义 callus 在一定条件下从外植体的切口（伤口）部位生在一定条件下从外植体的切口（伤口）部位生成的无特定结构和功能的薄壁细胞团。成的无特定结构和功能的薄壁细胞团。二、愈伤组

11、织的起始条件二、愈伤组织的起始条件 创伤创伤+激素激素机械性创伤机械性创伤微生物入侵微生物入侵昆虫袭击昆虫袭击 三、来源三、来源 植物各种器官、组织、细胞均有产生愈植物各种器官、组织、细胞均有产生愈伤组织的潜在可能性伤组织的潜在可能性 叶 髓部根 幼胚 四、类型四、类型 质地：脆软、坚硬（木质化）质地：脆软、坚硬（木质化） 颜色：白色、浅黄、浅绿、黄色、绿色、颜色：白色、浅黄、浅绿、黄色、绿色、褐色、红色褐色、红色 表面：光滑、粗糙表面：光滑、粗糙 脆软 坚硬 黏多糖 生根 Red white callusGreen callusYellow callus类型颜色表面质地胚性细胞细胞形态细胞质

12、核胚性embryoniccallus浅黄光滑坚硬易碎多小圆球形浓厚色深大非胚性non-embryoniccallus白色粗糙松散水渍状少或无管状无规则稀薄色浅小五、愈伤组织培养的应用五、愈伤组织培养的应用种质保存种质保存原生质体原生质体悬浮培养悬浮培养固定化细胞固定化细胞植株再生植株再生人工种子人工种子 第二节第二节 愈伤组织的诱导、形成及特点愈伤组织的诱导、形成及特点一、诱导培养条件一、诱导培养条件外植体外植体光照光照 暗暗 弱光弱光温度温度 20-30培养基培养基 N源源 NH4+/NO3- C源源 蔗糖蔗糖 激素激素 生长素：生长素：2,4-D IAA NAA 0.01-10mg/L 细

13、胞分裂素：细胞分裂素：KT ZT 6-BA 0. 1-10mg/L愈伤组织形成愈伤组织形成起始期起始期分裂期分裂期形成期形成期改变原来的分化方向和代谢方式，改变原来的分化方向和代谢方式，合成代谢加强，合成大量蛋白质和合成代谢加强，合成大量蛋白质和核酸物质为细胞的分裂和增殖奠定核酸物质为细胞的分裂和增殖奠定基础基础外植体外层细胞开始分裂，细胞外植体外层细胞开始分裂，细胞脱分化，愈伤组织结构疏松，缺脱分化，愈伤组织结构疏松，缺少组织结构，颜色浅而透明少组织结构，颜色浅而透明特特 点点CallusCallus表层细胞分裂逐渐停止，表层细胞分裂逐渐停止，而转向其内部的局部地区，并改而转向其内部的局部地

14、区，并改变分裂面的方向，出现瘤状结构变分裂面的方向，出现瘤状结构外表，外表，CallusCallus中可以发现维管组中可以发现维管组织，但不形成维管系统织，但不形成维管系统二、愈伤组织的形成过程v*诱导期长短因植物种类、外植体的生理状诱导期长短因植物种类、外植体的生理状态和外部因素而异，即使同一种物种不同基态和外部因素而异，即使同一种物种不同基因型同一外植体的愈伤组织诱导期也不同。因型同一外植体的愈伤组织诱导期也不同。 v*如有的植物愈伤组织诱导期只有如有的植物愈伤组织诱导期只有1天（菊天（菊芋），而有的植物诱导期需要几天（胡萝芋），而有的植物诱导期需要几天（胡萝卜），而刚收获得菊芋块茎诱导期

15、只要卜），而刚收获得菊芋块茎诱导期只要22h，经贮藏经贮藏5个月后，其诱导期延长到个月后，其诱导期延长到2天。天。v*愈伤组织进入分裂期时，外植体的脱分化愈伤组织进入分裂期时，外植体的脱分化因植物种类、基因型、外植体种类和生理状因植物种类、基因型、外植体种类和生理状况而有很大差异。况而有很大差异。 v*如烟草、胡萝卜等脱分化很容易，而禾谷如烟草、胡萝卜等脱分化很容易，而禾谷类的脱分化较前者难；花器官脱分化较易，类的脱分化较前者难；花器官脱分化较易，而茎叶则较难；幼茎组织脱分化较易，而成而茎叶则较难；幼茎组织脱分化较易，而成熟的老组织较难。熟的老组织较难。愈伤组织诱导形成过程小麦幼胚分裂期诱导期

16、分裂期分化期分化期第三节第三节 愈伤组织继代及其生长愈伤组织继代及其生长一、继代培养条件一、继代培养条件选材选材 疏松、色浅、生长快疏松、色浅、生长快接种接种 大小大小5mm,重量重量100mg光照光照 暗暗 弱光弱光温度温度 20-30培养基培养基 不同水平的不同水平的2,4-D,KCl ,NH4+,NO3-,KT,BAv继代培养的方法继代培养的方法 将原来的愈伤组织分割成小块，转移到新鲜的培养将原来的愈伤组织分割成小块，转移到新鲜的培养基上，用于继代培养的愈伤组织快必须达到一定的基上，用于继代培养的愈伤组织快必须达到一定的大小，一般直径为大小，一般直径为5mm，重量约，重量约100mg，否

17、则在，否则在新鲜的培养基上难以迅速恢复分裂和生长，或者生新鲜的培养基上难以迅速恢复分裂和生长，或者生长十分缓慢。长十分缓慢。二、良好的愈伤组织二、良好的愈伤组织 高度胚性或再分化能力高度胚性或再分化能力 容易松散容易松散 旺盛的繁殖能力旺盛的繁殖能力 长期继代后不丧失胚性或再分化能力长期继代后不丧失胚性或再分化能力1 1、愈伤组织颜色、愈伤组织颜色 CallusCallus无任何形态结构，新鲜愈伤组织颜色为无任何形态结构，新鲜愈伤组织颜色为奶黄色奶黄色或或白色白色有光泽，少数也有有光泽，少数也有淡绿色淡绿色或或绿色绿色；老化的愈伤组织；老化的愈伤组织则转变为则转变为黄色黄色至至褐色褐色。 2

18、2、愈伤组织的保持时间、愈伤组织的保持时间 2 23 3周周3 3、愈伤组织生长周期、愈伤组织生长周期 S S型曲线型曲线4 4、拟分生组织、拟分生组织 三三 愈伤组织保持愈伤组织保持* * *愈伤组织在分裂期会出现导管细胞，筛管细胞，分泌细胞，愈伤组织在分裂期会出现导管细胞，筛管细胞，分泌细胞，毛状体细胞及木栓细胞等，并出现由小而密集的分裂细胞构毛状体细胞及木栓细胞等，并出现由小而密集的分裂细胞构成的细胞团，称为拟分生组织。成的细胞团，称为拟分生组织。 * * *这些区域化的细胞团往往在以后分化中称为这些区域化的细胞团往往在以后分化中称为形成芽原基及形成芽原基及根原基的中心根原基的中心，愈伤

19、组织也经常呈颗粒状的外形，这些颗粒，愈伤组织也经常呈颗粒状的外形，这些颗粒中含有韧皮部、木质部和形成层组织，这种具有类似微管组中含有韧皮部、木质部和形成层组织，这种具有类似微管组织的愈伤组织颗粒也织的愈伤组织颗粒也具有分化形成不定芽和不定根的能力具有分化形成不定芽和不定根的能力。拟分生组织拟分生组织 1 1 以往研究认为继代时间长再生能力减弱甚至丧失，以往研究认为继代时间长再生能力减弱甚至丧失，但目前多数研究认为长期继代培养的愈伤组织仍有但目前多数研究认为长期继代培养的愈伤组织仍有再生能力。再生能力。 *继代时间与变异继代时间与变异v2 愈伤组织保持时间愈伤组织保持时间 已诱导并建立起来的愈伤

20、组织可以长期保已诱导并建立起来的愈伤组织可以长期保存，如有报道大豆细胞系的愈伤组织在存，如有报道大豆细胞系的愈伤组织在24和弱光下已保持和弱光下已保持15年。年。 注意注意v愈伤组织遗传上的不稳定性因基因型、外愈伤组织遗传上的不稳定性因基因型、外植体、培养基成分和培养时间而异。植体、培养基成分和培养时间而异。 v同基因型的同一种外植体在不同培养基上同基因型的同一种外植体在不同培养基上会产生不同的变异。会产生不同的变异。 v培养基成分，特别是外源激素的成分与变培养基成分，特别是外源激素的成分与变异的产生密切有关。异的产生密切有关。4 4 组织培养中涉及到的遗传变异主要是细胞核组织培养中涉及到的遗

21、传变异主要是细胞核组成的改变，变异是不可逆的，这种遗传上的组成的改变，变异是不可逆的，这种遗传上的改变可以是染色体畸变，细胞核破碎，或者是改变可以是染色体畸变，细胞核破碎，或者是由于细胞内复制引起的多倍性以及分子水平上由于细胞内复制引起的多倍性以及分子水平上的改变等形式。的改变等形式。5 5 愈伤组织遗传上的不稳定性因基因型、外植愈伤组织遗传上的不稳定性因基因型、外植体、培养基成分和培养时间而异。体、培养基成分和培养时间而异。通过产生单极性不定芽或不通过产生单极性不定芽或不定根，再在不定芽下方长出定根，再在不定芽下方长出不定根或在不定根上产生不不定根或在不定根上产生不定芽，并在二者之间分化出定

22、芽，并在二者之间分化出维管束组织形成完整植株维管束组织形成完整植株CallusCallus仅分化出不定根或不仅分化出不定根或不定芽而形成无根苗或无苗根定芽而形成无根苗或无苗根在在CallusCallus的邻近部位分化出的邻近部位分化出不定根和不定芽，然后二者不定根和不定芽，然后二者通过维管束组织结合起来形通过维管束组织结合起来形成完整植株成完整植株通过体细胞胚胎通过体细胞胚胎途径再生植株途径再生植株通过非体细胞胚通过非体细胞胚胎途径再生植株胎途径再生植株无根苗无根苗形成有根苗形成有根苗二、具形态建成和不具形态建成能力的愈伤组织二、具形态建成和不具形态建成能力的愈伤组织* * *外植体细胞经离体

23、诱导所形成的愈伤组织并不完全外植体细胞经离体诱导所形成的愈伤组织并不完全都具有形态建成的能力。都具有形态建成的能力。 * * *具有形态建成能力的愈伤组织都具有形态建成能力的愈伤组织都具有一定的形态结具有一定的形态结构特点构特点。 * * *具形态建成和不具形态建成能力的愈伤组织之间的具形态建成和不具形态建成能力的愈伤组织之间的差异是相对的，有时通过控制培养条件，尤其是生长差异是相对的，有时通过控制培养条件，尤其是生长调节物质和继代的方式可以调控其进行形态建成。调节物质和继代的方式可以调控其进行形态建成。起始材料培养基培养环境Callus 诱导、增殖和形态建成物种基因型外植体种类、生理年龄培养

24、基类型硝酸钾含量较高的培养基含盐量中等培养基低盐浓度培养基，如WS和HE有利利于根的离体诱导植物生长激素富盐平衡培养基1 1 基因型基因型重要影响因素重要影响因素*基因型对离体培养条件反应的差异在以往报道中也多有提及，表明离体培养过程，对起始材料的选择是十分重要的。 *基因型是控制愈伤组织形态建成的关键。不同物种的外植体诱导的愈伤组织器官分化明显不同，如烟草、胡萝卜、苜蓿等较易发生器官分化，而禾本科（禾谷类）、豆类、棉花等的愈伤组织形态建成相对较难。 *同属不同种，甚至同一物种不同品种的愈伤组织器官分化的能力也不同。表 1春小麦不同基因型出愈率基因型基因型出愈率出愈率重复重复1（）（）重复重复

25、2（）（）重复重复3（）（）平均平均（）（）F值值辽辽1094.396.892.194.4F28.67*东农东农774291.089.589.790.1Roblin85.389.587.587.5东农东农775785.788.286.486.8新克旱新克旱978.276.978.878.0表2 各基因型愈伤组织生长势分析继代天数愈伤组织鲜重（g/单胚）东农7757辽10东农7742Roblin新克旱90d0.0030.0030.0030.0020.00210d0.0330.0320.0370.0300.01720d0.0540.0490.0520.0390.02830d0.0800.0670.

26、0690.0520.03040d0.1070.0930.0930.0690.03450d0.1360.1200.1200.0790.04260d0.1710.1490.150.0930.04870d0.2130.1850.1810.1070.05680d0.2530.2270.2190.1240.06390d0.3120.2790.2550.1440.069100d0.3900.3610.3290.1650.078相对生长539表2 各基因型愈伤组织生长势分析继代天数愈伤组织鲜重（g/单胚）东农7757辽10东农7742Roblin新克旱90d0.0030.0030.

27、0030.0020.00210d0.0330.0320.0370.0300.01720d0.0540.0490.0520.0390.02830d0.0800.0670.0690.0520.03040d0.1070.0930.0930.0690.03450d0.1360.1200.1200.0790.04260d0.1710.1490.150.0930.04870d0.2130.1850.1810.1070.05680d0.2530.2270.2190.1240.06390d0.3120.2790.2550.1440.069100d0.3900.3610.3290.1650.078相对生长率13

28、012011082.539 图1 小麦不同基因型单胚愈伤组织在继代过程中鲜重变化 00.050.10.150.20.250.30.350.40102030405060708090100继代天数 subculture days(鲜重 g/单胚)(FWg/ embryo)7757Liao107742RoblinXinKehan92 2 外植体外植体 一般而言，分化水平较低的薄壁细胞和处于分裂的分生组织细胞较易诱导出愈伤组织。薄壁细胞分化水平较低，有较大发育的可塑性，其进行分裂的潜力可保持很多年。、分生组织细胞分裂潜能强，细胞分裂是脱分化形成愈伤组织的关键，因此是诱导愈伤组织适合的外植体。 不同器官

29、作为外植体所诱导的愈伤组织，其器官发生能力，有的植物差别不大，如烟草和水稻；而有的则明显不同，如翅鞘莎，以根、茎和叶为外植体时，愈伤组织的分化带有器官来源的特征，如根外植体的愈伤组织易分化出根。 外植体的生理年龄也影响愈伤组织器官发生的能力，如油菜植株的茎段自下而上进行培养的效果不同，下部器官形成率较低，而上部形成愈伤组织的苗分化率则较高（表4） 表4 油菜茎不同节位与苗分化的关系部位（由上而下）分化苗频率（）每块苗数173.34.0253.92.1322.20.547.10.150.00.060.00.070.00.03 3、愈伤组织在培养基上保持的时间、愈伤组织在培养基上保持的时间 愈伤组

30、织经长期继代培养，大多数物种基因型的愈伤组织再生能力降低，且受遗传因素控制，依不同基因型而异，但也有例外，有的基因型的植株再生往往在愈伤组织经多次继代后而产生。4、培养基类型 依培养基配方中含盐量多少可将目前培养基分为4类： *含盐量较大的培养基，MS培养基以及改良的MS培养基，这类培养基含较高浓度的硝酸盐、铵盐和钾盐，微量元素非常全，此外LS（Linsmaier and Skoog, 1965）、BL(Brown and Lawrence, 1968)、ER(Eriksson, 1965)培养基也属于这类培养基。 *硝酸钾含量较高的培养基，如B5（Gamborg等，1968）、N6（朱至清等

31、，1975）、SH（Schenk 和 Hildebrandt，1972），这类培养基的盐浓度也很高，其中NH+4和PO-34是由NH4H2PO4提供。 *含盐量中等的培养基，如H（Bourgin 和 Nitsch，1979）培养基，这类培养基中大量元素为MS的1/2，微量元素种类减少，但含量增加，维生素种类比MS的多，在Nitsch培养基中生物素提高了10倍。 *低盐浓度的培养基，如White培养基（1943），WS（Wolter和Skoog，1966）和HE培养基（Heller，1953）。v以上以上4种类培养基中，前两种培养基较适合愈种类培养基中，前两种培养基较适合愈伤组织诱导和细胞培养，

32、但选用那类培养基，伤组织诱导和细胞培养，但选用那类培养基，还应依植物种类、基因型、外植体等而定；还应依植物种类、基因型、外植体等而定；后两类培养基则有利于根的形成。诱导愈伤后两类培养基则有利于根的形成。诱导愈伤组织常用的培养基为组织常用的培养基为MS和和B5。高盐浓度的。高盐浓度的培养基可能对培养过程中愈伤组织数量及鲜培养基可能对培养过程中愈伤组织数量及鲜重增加有益。重增加有益。 A A、生长素和细胞分裂素、生长素和细胞分裂素 在愈伤组织诱导、增殖和形态建成过程中，对其调控幅度最大的是植在愈伤组织诱导、增殖和形态建成过程中，对其调控幅度最大的是植物生长调节物质，主要调节生长调节物质的种类、浓度

33、和比例，其中物生长调节物质，主要调节生长调节物质的种类、浓度和比例，其中生长素和细胞激动素的浓度和配比对大多数植物材料愈伤组织的诱导、生长素和细胞激动素的浓度和配比对大多数植物材料愈伤组织的诱导、增殖和形态建成的调控起重要作用。对绝大多数植物材料而言，增殖和形态建成的调控起重要作用。对绝大多数植物材料而言，2,4-D 是诱导愈伤组织和细胞悬浮培养的最有效物质，是诱导愈伤组织和细胞悬浮培养的最有效物质，常用浓度为常用浓度为110mg/L，为，为促进细胞和组织的生长还要加入促进细胞和组织的生长还要加入0.52mg/L的细胞激动的细胞激动素素（KT）。）。表5 各种生长素对黄瓜各外植体愈伤组织诱导的

34、效应（各种生长素浓度为10 mol/L）生长素愈伤组织形成种 子下胚轴果 皮IBA无愈伤组织形成愈伤组织增殖强IBA浓度为100 mol/L时愈伤组织生长良好NAA无愈伤组织形成所有外植体均产生愈伤组织愈伤组织增殖强2，4-D所有外植体均产生愈伤组织2，4-D浓度为1mol/L时愈伤组织生长良好愈伤组织增殖强NOA（萘氧乙酸）无愈伤组织形成愈伤组织增殖中等愈伤组织增殖中等NOP（萘氧丙酸）无愈伤组织形成愈伤组织增殖中等愈伤组织增殖强提示：提示：a对禾本科而言，诱导愈伤组织对禾本科而言，诱导愈伤组织2，4-D是必须的。是必须的。KT有抑制作用。有抑制作用。b. 所有植物生长调节物质的种类、浓度和

35、比例对植物材料愈伤组织诱导、所有植物生长调节物质的种类、浓度和比例对植物材料愈伤组织诱导、增殖及形态建成的调控作用与植物种类、外植体类型、生理状态及其对增殖及形态建成的调控作用与植物种类、外植体类型、生理状态及其对生长调节物质的敏感性密切相关。生长调节物质的敏感性密切相关。c. 大量研究表明，愈伤组织的诱导、增殖和器官发生及植株再生的基本大量研究表明，愈伤组织的诱导、增殖和器官发生及植株再生的基本培养基可相同，但对生长素和细胞激动素的数量和比例以及其他生长调培养基可相同，但对生长素和细胞激动素的数量和比例以及其他生长调节物质的种类，在愈伤组织的各阶段有不同要求。一般高浓度生长素和节物质的种类，

36、在愈伤组织的各阶段有不同要求。一般高浓度生长素和低浓度的低浓度的KT有利于愈伤组织的诱导和增殖。有利于愈伤组织的诱导和增殖。 d. 对双子叶植物而言，外植体愈伤组织的诱导和生长往往需要适当比例对双子叶植物而言，外植体愈伤组织的诱导和生长往往需要适当比例的生长素和细胞激动素配合。如银胶菊（的生长素和细胞激动素配合。如银胶菊（Parthenium argentatum）茎）茎段愈伤组织的诱导、生长及其分化取决于生长素和段愈伤组织的诱导、生长及其分化取决于生长素和BA的比例的比例 e e 对愈伤组织形态结构的调控。在愈伤组织被诱导、增殖后，其形态结对愈伤组织形态结构的调控。在愈伤组织被诱导、增殖后，

37、其形态结构各异，有的质地松软，有的坚实，它们之间在培养过程中可由生长调构各异，有的质地松软，有的坚实，它们之间在培养过程中可由生长调节物质进行调控，使其互相转换节物质进行调控，使其互相转换。鹅观草 表6 2,4-D和BA浓度对银胶菊茎段愈伤组织生长的影响 在渗流培养体系中（flow-through system） f f 对愈伤组织形态建成的调控：植物生长调节剂对愈伤组织形态建对愈伤组织形态建成的调控：植物生长调节剂对愈伤组织形态建成起重要调节作用，成起重要调节作用，SkoogSkoog和和MillerMiller（19511951）提出）提出“激素平衡激素平衡”假说，假说，即高浓度的生长素有

38、利于根的形成，而抑制芽的形成，反之，高浓即高浓度的生长素有利于根的形成，而抑制芽的形成，反之，高浓度的激动素促进芽的形成，而抑制根的形成。度的激动素促进芽的形成，而抑制根的形成。苜蓿苜蓿莴苣莴苣B B、乙烯、乙烯 愈伤组织在培养过程中可产生大量乙烯，而且受培愈伤组织在培养过程中可产生大量乙烯，而且受培养基中的生长调节物质的调节，而且生长素和细胞分裂养基中的生长调节物质的调节，而且生长素和细胞分裂素对愈伤组织的某些生理作用可能通过乙烯而起作用。素对愈伤组织的某些生理作用可能通过乙烯而起作用。外加乙烯对愈伤组织的形态结构和形态建成具有调节作外加乙烯对愈伤组织的形态结构和形态建成具有调节作用用。v*

39、pH影响愈伤组织对影响愈伤组织对NO3和和NH4和和Fe的吸收利的吸收利用，用，pH高有利于愈伤组织对高有利于愈伤组织对NH4的吸收利用，反的吸收利用，反之可提高对之可提高对NO3的利用。的利用。 v*pH影响器官发生和体细胞胚胎的发生，它们的发影响器官发生和体细胞胚胎的发生，它们的发生都要求适合的生都要求适合的pH值。如烟草在值。如烟草在pH6.8时易形成花时易形成花粉胚状体；水稻花粉愈伤组织在粉胚状体；水稻花粉愈伤组织在pH7.0培养基上预培养基上预处理处理1天，可提高分化绿苗的潜力。天，可提高分化绿苗的潜力。（4 4）、活性炭等一些惰性物质）、活性炭等一些惰性物质 吸附培养基中某些成分，

40、如激素、琼脂中的不纯抑制物以及吸附培养基中某些成分，如激素、琼脂中的不纯抑制物以及培养基中的盐酸硫胺素、烟酸、铁的络合物。培养基中的盐酸硫胺素、烟酸、铁的络合物。 吸附外植体释放到培养基中的分泌物，如激素、酚类物质等。吸附外植体释放到培养基中的分泌物，如激素、酚类物质等。 吸附培养基中某些气体成分。吸附培养基中某些气体成分。 活性炭释放到培养基中某些杂质影响培养物的代谢。活性炭释放到培养基中某些杂质影响培养物的代谢。 造成基质的黑暗，使其更接近自然土壤调价。造成基质的黑暗，使其更接近自然土壤调价。 （5 5）培养条件）培养条件温度：温度：增值和诱导最适增值和诱导最适2525，分化最适，分化最适

41、24-28 24-28 光：光：1500-2500lx1500-2500lx第五节第五节 愈伤组织的形成及其形态建成的某些生理愈伤组织的形成及其形态建成的某些生理生化基础生化基础在愈伤组织形成和形态建成中植物生长调节物质可能起着在愈伤组织形成和形态建成中植物生长调节物质可能起着“开关开关”的的作用，首先诱导组织，使其成为对随即发生的发育信号产生应答的感作用，首先诱导组织，使其成为对随即发生的发育信号产生应答的感受态，发生一系列细胞和分子水平的变化，包括特定的基因表达及其受态，发生一系列细胞和分子水平的变化，包括特定的基因表达及其调节。调节。 一、芽的分化 *愈伤组织在培养基上生长，在一定条件下

42、首先导致类形成层的细胞成群出现，称为分生原基，也称为“节”或“生长中心”。 *在生长中心出现管胞细胞，并进一步维管化，这是愈伤组织中器官形成部位，最初的分生原基具有可塑性，可形成根或芽，一般根在内部形成，而芽起源于外部，但也有内部分化芽的例子。二、芽分化过程中生理活性变化 淀粉积累淀粉积累 Thorpe和和Murashige（1970）在测定烟草分化和未分化愈）在测定烟草分化和未分化愈伤组织中核酸和蛋白质以及碳水化合物的变化时，发现在伤组织中核酸和蛋白质以及碳水化合物的变化时，发现在愈伤组织的芽形成区愈伤组织的芽形成区RNA和蛋白质含量较高，且有淀粉的和蛋白质含量较高，且有淀粉的大量积累，为芽

43、的形成提供物质和能量。大量积累，为芽的形成提供物质和能量。2. 内源激素水平变化内源激素水平变化v生长在同一种培养基上，处于分化和未分化的愈伤组织间，生长在同一种培养基上，处于分化和未分化的愈伤组织间，内源激素水平明显不同。刘涤等（内源激素水平明显不同。刘涤等（1986）的研究表明，在）的研究表明，在含含6-BA培养基上生长的分化组织，内源激素含量与未分化培养基上生长的分化组织，内源激素含量与未分化的组织差别很大，其中细胞激动素含量为未分化愈伤组织的的组织差别很大，其中细胞激动素含量为未分化愈伤组织的4倍，倍，GA3为两倍。但为两倍。但IAA含量明显下降，仅为未分化的含量明显下降，仅为未分化的1/20，导致分化和未分化组织中细胞激动素与，导致分化和未分化组织中细胞激动素与IAA的比例明的比例明显不同，两者相差显不同，两者相差85倍。倍。3 3、外源激素与器官分化、外源激素与器官分化 有研究表明，有研究表明，芽器官分化过程中对蛋白质合成的依赖芽器官分化过程中对蛋白质合成的依赖型高于核