新编免疫组化学习教案

1、会计学1第一页，共113页。第一部分第一部分 免疫细胞化学的理论基础免疫细胞化学的理论基础 免疫细胞化学是免疫学与细胞化免疫细胞化学是免疫学与细胞化学相结合的一个分支学科，以免疫学学相结合的一个分支学科，以免疫学的抗原抗体的抗原抗体(kngt)反应为其理论基反应为其理论基础。础。第1页/共112页第二页，共113页。第一节第一节 抗原（抗原（antigenantigen）一、抗原的概念一、抗原的概念 是一类在合适的条件下，能激发是一类在合适的条件下，能激发机体免疫系统发生免疫应答，并能与免疫机体免疫系统发生免疫应答，并能与免疫应答产生应答产生(chnshng)(chnshng)的效应物质在体的

2、效应物质在体内和内和/ /或体外发生特异性结合反应的物质或体外发生特异性结合反应的物质。抗原的性能：免疫原性抗原的性能：免疫原性 产生产生(chnshng)(chnshng)免疫应答免疫应答 反应原性反应原性 产生产生(chnshng)(chnshng)特异性反应特异性反应第2页/共112页第三页，共113页。二、抗原决定簇二、抗原决定簇 是与相应抗体或淋巴细胞抗原识别受体相结合是与相应抗体或淋巴细胞抗原识别受体相结合的部位，是决定和控制抗原特异性的特殊化学的部位，是决定和控制抗原特异性的特殊化学(huxu)基团。基团。类型：功能性抗原决定簇类型：功能性抗原决定簇 隐蔽性抗原决定簇隐蔽性抗原决

3、定簇 免疫优势决定簇免疫优势决定簇 线性或连续性决定簇线性或连续性决定簇 构象决定簇或不连续性决定簇构象决定簇或不连续性决定簇B 细胞所识别的是半抗原决定簇；细胞所识别的是半抗原决定簇；T细胞所识别的是细胞所识别的是免疫原性决定簇或连续性决定簇。免疫原性决定簇或连续性决定簇。第3页/共112页第四页，共113页。三、抗原的性质与种类三、抗原的性质与种类（一）抗原的性质（一）抗原的性质1、抗原的异物性、抗原的异物性 机体能对进入体内的异种、异体的大分子物质产生机体能对进入体内的异种、异体的大分子物质产生免疫应答。该物质与机体的种系关系愈远，其免疫原性免疫应答。该物质与机体的种系关系愈远，其免疫原

4、性愈强，机体的免疫反应也更强。愈强，机体的免疫反应也更强。自身抗原；自身抗体自身抗原；自身抗体(kngt)2、大分子胶体、大分子胶体 作为抗原，分子愈大，其免疫原性愈强作为抗原，分子愈大，其免疫原性愈强 3、抗原的特异性、抗原的特异性 各种抗原物质各有其特异的抗原决定簇，即一种抗各种抗原物质各有其特异的抗原决定簇，即一种抗体体(kngt)只能与相应的抗原起反应而不能与其它抗原只能与相应的抗原起反应而不能与其它抗原反应。反应。第4页/共112页第五页，共113页。（二）抗原的种类方法（二）抗原的种类方法 分类依据分类依据 种类种类单独存在时是否有免疫原性单独存在时是否有免疫原性 半抗原和完全抗半

5、抗原和完全抗原原抗原来源抗原来源 外源性抗原和内外源性抗原和内源性抗原源性抗原抗原与宿主关系抗原与宿主关系 异种抗原，同种异种抗原，同种异体抗原，自身抗原异体抗原，自身抗原B细胞产生抗体时是否需要细胞产生抗体时是否需要T细胞辅助细胞辅助 胸腺依赖抗原，胸腺依赖抗原，胸腺非依赖抗原胸腺非依赖抗原化学物质化学物质 蛋白质，多糖蛋白质，多糖(du tn)，脂蛋白，脂多糖，脂蛋白，脂多糖(du tn)，糖蛋白，糖蛋白， 核酸等核酸等物理状态物理状态 颗粒性抗原，可颗粒性抗原，可溶性抗原溶性抗原产生方式产生方式 天然抗原，人工天然抗原，人工合成抗原，基因工程抗原合成抗原，基因工程抗原抗原特异性程度抗原特

6、异性程度 特异性抗原，共特异性抗原，共同抗原同抗原完全抗原：同时具有免疫原性和反应完全抗原：同时具有免疫原性和反应(fnyng)原性的物质。原性的物质。不完全抗原或半抗原：无免疫原性。不完全抗原或半抗原：无免疫原性。第5页/共112页第六页，共113页。第二节第二节 抗体（抗体（antibodyantibody）一、抗体的概念一、抗体的概念 机体受到抗原刺激后，通过体液机体受到抗原刺激后，通过体液免疫应答，免疫应答，B B淋巴细胞活化、增殖淋巴细胞活化、增殖(zngzh)(zngzh)、分化为浆细胞，由浆细、分化为浆细胞，由浆细胞合成并分泌的仅与该抗原发生特异胞合成并分泌的仅与该抗原发生特异性

7、反应的球蛋白。性反应的球蛋白。二、抗体的性质和种类二、抗体的性质和种类（一）抗体的一般性质（一）抗体的一般性质 免疫球蛋白约等于抗体，分五类：免疫球蛋白约等于抗体，分五类：IgG,IgM,IgA,IgD,IgEIgG,IgM,IgA,IgD,IgE第6页/共112页第七页，共113页。（二）免疫原性和分类特性（二）免疫原性和分类特性 免疫球蛋白都是大分子蛋白质，具有免疫原性，课作为抗原。由免疫球蛋白都是大分子蛋白质，具有免疫原性，课作为抗原。由于存在着轻链和重链，可变区和稳定区，因此，分子结构差异较大，于存在着轻链和重链，可变区和稳定区，因此，分子结构差异较大，免疫原性比较复杂。免疫原性比较复

8、杂。（三）抗体的种类（三）抗体的种类1、根据抗体的途径或来源不同分为、根据抗体的途径或来源不同分为免疫抗体；天然抗体；自身抗体免疫抗体；天然抗体；自身抗体2、根据抗原抗体在试管内是否出现肉眼反应、根据抗原抗体在试管内是否出现肉眼反应(fnyng)分为分为完全抗体；不完全抗体完全抗体；不完全抗体第7页/共112页第八页，共113页。三、抗原与抗体反应三、抗原与抗体反应 称为免疫学反应。称为免疫学反应。在体内进行称为免疫反应；在体外称为血清学反应在体内进行称为免疫反应；在体外称为血清学反应四、抗体形成的机制四、抗体形成的机制（一）免疫应答的产生（一）免疫应答的产生1、感应阶段（识别及加工处理、感应

9、阶段（识别及加工处理(chl)抗原阶段）抗原阶段）2、反应阶段（淋巴细胞增殖分化阶段）、反应阶段（淋巴细胞增殖分化阶段）3、效应阶段（发生免疫反应阶段）、效应阶段（发生免疫反应阶段）（二）影响抗体产生的因素（二）影响抗体产生的因素1、抗原的质和量、抗原的质和量2、机体方面、机体方面3、佐剂的增强免疫作用、佐剂的增强免疫作用第8页/共112页第九页，共113页。第三节第三节 有关基本技术方法有关基本技术方法一、抗体的制备一、抗体的制备（一）抗体的制备方法（一）抗体的制备方法 能制备出具有能制备出具有(jyu)(jyu)很高特异性和很高特异性和敏感性的高效价多克隆和单克隆抗体。敏感性的高效价多克隆

10、和单克隆抗体。第9页/共112页第十页，共113页。1.1.多克隆抗体（血清抗体：指机体接受抗原主动免疫或被动免疫后多克隆抗体（血清抗体：指机体接受抗原主动免疫或被动免疫后从血清中分离提纯从血清中分离提纯(tchn)(tchn)的抗体。的抗体。2.2.单克隆抗体：是单克隆抗体：是19751975年由年由Kohlenh MilsteinKohlenh Milstein发明的一种新技术。其发明的一种新技术。其原理是将体外培养的骨髓细胞和免疫的脾细胞相融合，产生杂交细胞。原理是将体外培养的骨髓细胞和免疫的脾细胞相融合，产生杂交细胞。这种融合的杂交细胞既有骨髓细胞的无限生长能力，又有浆细胞分泌这种融合

11、的杂交细胞既有骨髓细胞的无限生长能力，又有浆细胞分泌单一抗体的能力。将该免疫细胞纯化，成为单克隆系，就能产生大量单一抗体的能力。将该免疫细胞纯化，成为单克隆系，就能产生大量专一的高纯度的抗体，即单克隆抗体（专一的高纯度的抗体，即单克隆抗体（monoclonal antibody, McAb)monoclonal antibody, McAb)第10页/共112页第十一页，共113页。单克隆抗体单克隆抗体(kngt)(kngt)与多克隆抗体与多克隆抗体(kngt)(kngt)特性的比较特性的比较 特性特性 多克隆多克隆 单克隆单克隆组成组成 多种类抗体多种类抗体(kngt)(kngt)的混合物的

12、混合物 单一种类的抗体单一种类的抗体(kngt) (kngt) 特异性特异性 低低 高高 针对多个抗原决定族针对多个抗原决定族 针对单一的抗原决定族针对单一的抗原决定族亲和力亲和力 平均亲和力较高平均亲和力较高 不定，较低不定，较低交叉反应交叉反应 高高 低低第11页/共112页第十二页，共113页。（二）抗体（二）抗体(kngt)的配制方法的配制方法1、抗体、抗体(kngt)贮存贮存2、抗体、抗体(kngt)使用液的配制使用液的配制第12页/共112页第十三页，共113页。二、组织材料的处理二、组织材料的处理 尽量保存好抗原性不丢失、不扩散、不被破坏尽量保存好抗原性不丢失、不扩散、不被破坏三

13、、免疫染色三、免疫染色1、增强特异性染色方法、增强特异性染色方法蛋白酶消化法；合适的抗体蛋白酶消化法；合适的抗体(kngt)稀释度；温育稀释度；温育时间时间2、减少或消除非特异性染色方法、减少或消除非特异性染色方法3、显色反应的控制、显色反应的控制4、复染、复染第13页/共112页第十四页，共113页。四、对照四、对照(duzho) 阳性对照阳性对照(duzho)；阴性对照；阴性对照(duzho)五、结果的判断五、结果的判断（一）阳性细胞的染色特性（一）阳性细胞的染色特性1、分胞浆、细胞核、细胞膜表面阳性、分胞浆、细胞核、细胞膜表面阳性2、灶状和弥漫性、灶状和弥漫性3、非特异性的认知、非特异性

14、的认知4、切片质量不佳出现的阳性要排除、切片质量不佳出现的阳性要排除（二）染色失败的几种原因（二）染色失败的几种原因第14页/共112页第十五页，共113页。第二部分第二部分免疫荧光细胞化学技术免疫荧光细胞化学技术 Coons等（等（1941）通过荧光标记抗）通过荧光标记抗体，并借助于荧光显微镜观察荧光的发体，并借助于荧光显微镜观察荧光的发光物质，而建立的该项技术。光物质，而建立的该项技术。 近年来，与激光技术、电子计算机、近年来，与激光技术、电子计算机、扫描电镜等技术的结合发展为定量免疫扫描电镜等技术的结合发展为定量免疫荧光技术。加之荧光激活细胞分类器的荧光技术。加之荧光激活细胞分类器的应用

15、和激光共聚焦应用和激光共聚焦(jjio)显微镜的问世，显微镜的问世，开创了免疫荧光技术的新领域。开创了免疫荧光技术的新领域。第15页/共112页第十六页，共113页。第一节第一节 原理原理一、基本原理一、基本原理 免疫荧光技术也是根据抗原抗体免疫荧光技术也是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检测组织或细胞抗体（或抗原）作为探针检测组织或细胞内的相应抗原（或抗体）。内的相应抗原（或抗体）。二、荧光产生的原理二、荧光产生的原理 分子都含有电子，电子载不断的

16、运分子都含有电子，电子载不断的运动着。动着。 一般情况下，电子总是处于一般情况下，电子总是处于(chy)(chy)能量最低的能级（即基态）能量最低的能级（即基态） 在一定的条例下，电子可吸收能量在一定的条例下，电子可吸收能量跃迁到较高的能量级（即激发态），这个跃迁到较高的能量级（即激发态），这个过程叫激发。过程叫激发。第16页/共112页第十七页，共113页。第17页/共112页第十八页，共113页。二、荧光素二、荧光素1、荧光色素、荧光色素 能够产生荧光并能作为染料的化合物称为能够产生荧光并能作为染料的化合物称为。特性：必须具备特性：必须具备(jbi)吸收激发光的光能并发射吸收激发光的光能并

17、发射荧光；具有吸收荧光；具有吸收 一定频率光能的生色团和能产生一定光亮一定频率光能的生色团和能产生一定光亮子的荧光子的荧光 团。团。第18页/共112页第十九页，共113页。2、用于标记抗体的荧光素必须具备以下条件：、用于标记抗体的荧光素必须具备以下条件：1）应具有与蛋白质分子形成共价键的化学基因，结合后不）应具有与蛋白质分子形成共价键的化学基因，结合后不易解离，而未结合的色素及其降解产物容易排除。易解离，而未结合的色素及其降解产物容易排除。2）荧光效率高，与蛋白质结合荧光效率下降不多。）荧光效率高，与蛋白质结合荧光效率下降不多。3）结合抗体蛋白后对抗体的免疫学性质和生化性质无影响。）结合抗体

18、蛋白后对抗体的免疫学性质和生化性质无影响。4）与蛋白质结合的方法简便而快速。）与蛋白质结合的方法简便而快速。5）荧光素容易溶解）荧光素容易溶解(rngji)，溶解，溶解(rngji)后不会与其它后不会与其它物质发生化学反应。物质发生化学反应。6）荧光颜色与背景组织的自发荧光颜色对比鲜明，能清晰）荧光颜色与背景组织的自发荧光颜色对比鲜明，能清晰判断结果。判断结果。第19页/共112页第二十页，共113页。3、荧光、荧光(ynggung)素的类型素的类型1）异硫氰酸荧光）异硫氰酸荧光(ynggung)素（素（fluorescien isothocyanate, FITC)2）四甲基异硫氰酸罗达明（

19、）四甲基异硫氰酸罗达明（tetraethyl rhodamine isothocyanate, TRITC)3）四乙基罗达明（）四乙基罗达明（tetraethyl rhodamine, RB200)4）其它）其它第20页/共112页第二十一页，共113页。三、免疫荧光染色方法三、免疫荧光染色方法1、直接法：用已知特异性抗体与荧光素结合，制成、直接法：用已知特异性抗体与荧光素结合，制成特异特异 性荧光抗体，直接用于细胞和组织性荧光抗体，直接用于细胞和组织(zzh)抗抗原的检查。原的检查。优点：特异性高优点：特异性高缺点：一种荧光缺点：一种荧光 抗体只能抗体只能 检测一种检测一种 抗原。抗原。第2

20、1页/共112页第二十二页，共113页。2、间接法：用特异性的抗体（、间接法：用特异性的抗体（1抗）与细胞或组织标本反应，抗）与细胞或组织标本反应，随后用缓冲液洗去未与抗原随后用缓冲液洗去未与抗原(kngyun)结合的抗体，再用间结合的抗体，再用间接荧光抗体（接荧光抗体（2抗）与结合再抗原抗）与结合再抗原(kngyun)上的抗体结合，上的抗体结合，形成抗原形成抗原(kngyun) 抗体抗体 荧光抗体的复合物。荧光抗体的复合物。优点：荧光亮度增强，优点：荧光亮度增强， 提高了敏感度提高了敏感度第22页/共112页第二十三页，共113页。四、非特异性染色的消除方法四、非特异性染色的消除方法1、非特

21、异性染色的主要因素、非特异性染色的主要因素1）部分荧光素未与蛋白质结合，形成聚合物和衍化物而不能）部分荧光素未与蛋白质结合，形成聚合物和衍化物而不能被透析除去。被透析除去。2）抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可）抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分与组织成分(chng fn)非特异结合。非特异结合。3）组织内类属抗原的存在。）组织内类属抗原的存在。4）从组织中难以提纯抗原性物质。）从组织中难以提纯抗原性物质。5）抗体分子上标记的荧光素太多。）抗体分子上标记的荧光素太多。6）荧光素不纯，标本固定不当。）荧光素不纯，标本固定不当。7）细胞和组织内某些物质自发

22、荧光。）细胞和组织内某些物质自发荧光。8）染色时间过长，温度过高，冲洗不够或标本干燥。）染色时间过长，温度过高，冲洗不够或标本干燥。第23页/共112页第二十四页，共113页。2、消除的方法、消除的方法1）衬染法（可抑制自发荧光）衬染法（可抑制自发荧光）2）胰蛋白酶消化（可抑制非特异性荧光）胰蛋白酶消化（可抑制非特异性荧光）3）吸收（用小属肝粉消除组织非特异性荧光的染色）吸收（用小属肝粉消除组织非特异性荧光的染色(rns)）4）用正常（非免疫）血清（清除自发荧光和非特异性）用正常（非免疫）血清（清除自发荧光和非特异性荧光）荧光）5）提高抗体和荧光抗体的质量）提高抗体和荧光抗体的质量第24页/共

23、112页第二十五页，共113页。五、荧光显微镜及检测方法五、荧光显微镜及检测方法略略六、染色标本六、染色标本(biobn)的保存的保存 原则上应立即再荧光显微镜下观察，拍照，此时原则上应立即再荧光显微镜下观察，拍照，此时荧光最强。荧光最强。 用缓冲甘油封片，保存在用缓冲甘油封片，保存在4中，过夜后特异性中，过夜后特异性荧光强度减弱荧光强度减弱25，保存，保存1周后减弱周后减弱60。第25页/共112页第二十六页，共113页。Nikon荧光荧光(ynggung)显微镜显微镜第26页/共112页第二十七页，共113页。第27页/共112页第二十八页，共113页。第28页/共112页第二十九页，共1

24、13页。肾活检肾活检(hu jin)（直（直接法）接法）肾活检肾活检(hu jin)（直接法）直接法）第29页/共112页第三十页，共113页。肾活检肾活检(hu jin)（直接法）（直接法）低倍视野低倍视野肾活检（直接肾活检（直接(zhji)法），表法），表达弱达弱第30页/共112页第三十一页，共113页。肾活检肾活检(hu jin)（直接（直接法）法）第31页/共112页第三十二页，共113页。肾活检肾活检(hu jin)（直（直接法）接法）第32页/共112页第三十三页，共113页。左图：表达左图：表达(biod)在细胞核（在细胞核（FITC）右图：表达右图：表达(biod)在胞膜在胞

25、膜第33页/共112页第三十四页，共113页。左图：左图：DAPI 染色染色(rns)（染核）（染核）右图：第34页/共112页第三十五页，共113页。第35页/共112页第三十六页，共113页。胃胃粘粘膜膜上上皮皮细细胞，胞，胞胞浆浆胞胞膜膜阳阳性性(yngxng)第36页/共112页第三十七页，共113页。血血管管内内弹弹力力(tnl)膜膜阳阳性性第37页/共112页第三十八页，共113页。胃胃腺腺癌癌(xin i)第38页/共112页第三十九页，共113页。第三部分第三部分免疫酶细胞化学技术免疫酶细胞化学技术 免疫酶细胞化学技术是免疫组免疫酶细胞化学技术是免疫组织化学中最常见的方法织化学

26、中最常见的方法(fngf)之之一，它是在抗原抗体特异性反应存一，它是在抗原抗体特异性反应存在的前提条件下，借助于酶学细胞在的前提条件下，借助于酶学细胞化学手段，检测某种物质（抗原化学手段，检测某种物质（抗原/抗抗体）组织细胞内存在部位的一门新体）组织细胞内存在部位的一门新技术。技术。第39页/共112页第四十页，共113页。第一节第一节 免疫组织免疫组织(zzh)(zzh)化学的基本化学的基本技术技术一、取材一、取材1.1.实验动物实验动物 麻醉麻醉 （处死），锋利刀片切成大小（处死），锋利刀片切成大小适中，厚度适中，厚度3mm3mm4mm4mm。 小型实验动物：灌注（流）固定后取小型实验动物

27、：灌注（流）固定后取材材 （生理盐水和（生理盐水和4 4多聚甲多聚甲醛）醛） 2.2.人体材料人体材料 活检组织活检组织(zzh)(zzh)、手术标本、细胞、手术标本、细胞和组织和组织(zzh)(zzh)第40页/共112页第四十一页，共113页。二、固定二、固定 原则是保持组织原则是保持组织(zzh)(zzh)形态良好和被检测抗原的形态良好和被检测抗原的前提下，应采用前提下，应采用浓度最低的固定剂和最短的固定时间，固定时间一般浓度最低的固定剂和最短的固定时间，固定时间一般为为1 112h12h。1.1.常用的固定剂常用的固定剂（1 1）甲醛缓冲液）甲醛缓冲液 广泛应用于病理标本的固定，甲醛在

28、很好地保护广泛应用于病理标本的固定，甲醛在很好地保护组织组织(zzh)(zzh)形态结构完整的同时也有效地保存某些抗形态结构完整的同时也有效地保存某些抗原。由于甲醛的交联作用会影响被固定细胞膜的通透原。由于甲醛的交联作用会影响被固定细胞膜的通透性不利于染色时抗体的渗透，因此染色前常用酶进行性不利于染色时抗体的渗透，因此染色前常用酶进行消化以使抗原决定簇充分暴露，固定时间不直超过消化以使抗原决定簇充分暴露，固定时间不直超过24h24h。第41页/共112页第四十二页，共113页。（2 2）4 4多聚甲醛磷酸缓冲液多聚甲醛磷酸缓冲液 广泛应用于光镜细胞化学研究广泛应用于光镜细胞化学研究(ynji)

29、(ynji)。（3 3）戊二醛多聚甲醛缓冲液）戊二醛多聚甲醛缓冲液 适用于光镜、电镜免疫组织化学研究适用于光镜、电镜免疫组织化学研究(ynji)(ynji)。（4 4）其它）其它 如如PLPPLP液（过碘酸液（过碘酸 赖赖AAAA多聚甲醛固定液）、丙酮及醇多聚甲醛固定液）、丙酮及醇 类、锇酸等。类、锇酸等。第42页/共112页第四十三页，共113页。2.2.固定注意事项固定注意事项（1 1）固定液的选择标准：）固定液的选择标准：A. A. 组织形态结构保存良好。组织形态结构保存良好。 B. B. 最大限度保存抗原的抗原性。最大限度保存抗原的抗原性。（2 2）组织块的大小：）组织块的大小：1.5

30、cm1.5cm1.5cm1.5cm0.5cm0.5cm为宜。为宜。（3 3）固定时间：与组织块大小成正比，与固定液浓度成反比。）固定时间：与组织块大小成正比，与固定液浓度成反比。（4 4）温度：一般在室温）温度：一般在室温(sh wn)(sh wn)下进行，电镜标本和固定时下进行，电镜标本和固定时间较长时间较长时 可放置在可放置在44冰箱。冰箱。（5 5）固定后处理：充分冲洗，除去多余固定剂。）固定后处理：充分冲洗，除去多余固定剂。第43页/共112页第四十四页，共113页。三、包埋三、包埋 1. 1.石蜡包埋石蜡包埋 2. 2.冷冻冷冻(lngdng)(lngdng)包埋包埋 3. 3.环氧

31、树脂包理环氧树脂包理四、切片四、切片 1. 1.载玻片的处理载玻片的处理（1 1）清洗）清洗 （2 2）涂胶（防止脱片）。常用粘附剂：）涂胶（防止脱片）。常用粘附剂：明胶：铬矾明胶和甲醛明胶。树脂胶：也称白胶。明胶：铬矾明胶和甲醛明胶。树脂胶：也称白胶。 多聚赖氨酸（多聚赖氨酸（PLLPLL）。商品化粘附剂。）。商品化粘附剂。第44页/共112页第四十五页，共113页。2.2.切片类型切片类型（l l）石蜡切片）石蜡切片 厚约厚约3 3 5m 5m，放置，放置3737温箱烘烤过夜，以减少脱片。温箱烘烤过夜，以减少脱片。（2 2）冷冻切片：）冷冻切片：2m2m。（3 3）振动切片：特点是组织经固

32、定后不需包埋，只要）振动切片：特点是组织经固定后不需包埋，只要(zhyo)(zhyo)用胶水粘在载物台上即可切片。切片较厚，可将阳用胶水粘在载物台上即可切片。切片较厚，可将阳性部位作电镜包埋。神经组织应用较多。性部位作电镜包埋。神经组织应用较多。第45页/共112页第四十六页，共113页。第二节第二节 免疫组化染色过程中基本技术免疫组化染色过程中基本技术一、蛋白酶消化技术一、蛋白酶消化技术 进行固定时，抗原决定簇有可能被进行固定时，抗原决定簇有可能被固 定 剂 所 封 闭 ， 因 此 在 抗 原 抗 体固 定 剂 所 封 闭 ， 因 此 在 抗 原 抗 体(kngt)(kngt)反应前，常用蛋

33、白酶处理组反应前，常用蛋白酶处理组织切片，使抗原决定簇充分暴露出来，织切片，使抗原决定簇充分暴露出来，并使组织的通透性增高，以利抗原抗体并使组织的通透性增高，以利抗原抗体(kngt)(kngt)最大限度地结合增强特异性最大限度地结合增强特异性染色。染色。1.1.常用的消化酶常用的消化酶 胰蛋白酶、胃蛋白酶胰蛋白酶、胃蛋白酶2.2.消化时间消化时间 因组织而异，一般为因组织而异，一般为5 530min30min，消，消化时间不宜太长，以免损伤组织形态，化时间不宜太长，以免损伤组织形态，破坏抗原决定族。消化结束后要充分洗破坏抗原决定族。消化结束后要充分洗涤，以除去残留的蛋白酶。涤，以除去残留的蛋白

34、酶。第46页/共112页第四十七页，共113页。3.3.非特异染色的控制非特异染色的控制 非特异染色或背景染色是指在免疫组化染色过程中凡不属于非特异染色或背景染色是指在免疫组化染色过程中凡不属于特异性抗原抗体反应所出现的染色。特异性抗原抗体反应所出现的染色。（1 1）原因分析）原因分析组织方面：主要有组织的自发荧光、内源性过氧化物酶或碱组织方面：主要有组织的自发荧光、内源性过氧化物酶或碱 性磷酸酶、内源性生物素等性磷酸酶、内源性生物素等. .试剂试剂(shj)(shj)方面：因抗体不纯、标记的酶和荧光不纯或标记过量方面：因抗体不纯、标记的酶和荧光不纯或标记过量等。等。（2 2）消除方法）消除方

35、法 加加1 1抗前加正常血清抗前加正常血清101030min30min，以封闭组织中带电荷的基因，以封闭组织中带电荷的基因，避免与避免与1 1抗的非特异性结合。抗的非特异性结合。 第47页/共112页第四十八页，共113页。减少非特异性染色：减少非特异性染色：a.a.免疫酶组化染色时，在加免疫酶组化染色时，在加1 1抗前，用抗前，用0.3%0.3%的的H2O2H2O2甲醇溶液将组织切片甲醇溶液将组织切片处理处理30min30min（3%3%的的H2O2H2O2甲醇溶液处理甲醇溶液处理5 510min10min）。）。b.b.免疫荧光染色时，可用免疫荧光染色时，可用0.010.010.050.0

36、5伊文思蓝稀释荧光抗体。伊文思蓝稀释荧光抗体。二、对照二、对照 阳性对照片阳性对照片(zhopin)(zhopin)：用已知抗原为阳性的标本作对照：用已知抗原为阳性的标本作对照 阴性对照片阴性对照片(zhopin)(zhopin)：确认不含己知抗原的标本作对照：确认不含己知抗原的标本作对照第48页/共112页第四十九页，共113页。三、抗体的分装、稀释、滴加及保存三、抗体的分装、稀释、滴加及保存1.1.抗体的分装抗体的分装 不能用完的抗体分装在小的不能用完的抗体分装在小的EPEP管内，保存在管内，保存在-20-20-40-40的低温冰箱中持用可保持数年有效。的低温冰箱中持用可保持数年有效。2.

37、2.抗体稀释抗体稀释 常用常用0.01MPBS0.01MPBS（磷酸缓冲溶液）或（磷酸缓冲溶液）或BSABSA（牛血清白（牛血清白蛋白）蛋白）3.3.滴加滴加 滴加抗体要充分覆盖组织切片，一般加滴加抗体要充分覆盖组织切片，一般加 30 3050L,50L,最好最好(zu ho)(zu ho)在滴加前，用蜡笔或特制的组在滴加前，用蜡笔或特制的组化笔在组织周围画一圈化笔在组织周围画一圈, ,以防溶液的扩散。以防溶液的扩散。4.4.保存保存 未用完的抗体可在低温冰箱或冻干保存，已稀释未未用完的抗体可在低温冰箱或冻干保存，已稀释未用完的抗体最好用完的抗体最好(zu ho)(zu ho)在一周内用完，不

38、宜长期在一周内用完，不宜长期保存。保存。 第49页/共112页第五十页，共113页。四、免疫酶组织化学技术和酶标抗体技术四、免疫酶组织化学技术和酶标抗体技术1.1.免疫酶染色原理免疫酶染色原理 用酶作为标记物，可分为直接法、间接法、补体法、用酶作为标记物，可分为直接法、间接法、补体法、免免疫酶桥法、免疫酶双桥法、过氧化物酶抗过氧化物酶法疫酶桥法、免疫酶双桥法、过氧化物酶抗过氧化物酶法（PAPPAP法）和双法）和双PAPPAP法等。法等。（1 1）直接法原理：用酶直接标记在特异性）直接法原理：用酶直接标记在特异性1 1抗上，与标本抗上，与标本(biobn)(biobn)中的中的 抗原结合，让酶催

39、化底物反应产生有色产物，沉淀抗原结合，让酶催化底物反应产生有色产物，沉淀在抗在抗 原抗体反应部位，即可在镜下对标本原抗体反应部位，即可在镜下对标本(biobn)(biobn)的抗的抗原进行检测。原进行检测。优点：简便、快速、特异性强；缺点：敏感性差。优点：简便、快速、特异性强；缺点：敏感性差。 第50页/共112页第五十一页，共113页。（2 2）间接法原理：先用标记的特异性）间接法原理：先用标记的特异性1 1抗与标本中相应抗原结合，再抗与标本中相应抗原结合，再用酶标记的抗球蛋白抗体（用酶标记的抗球蛋白抗体（2 2抗）孵育，然后抗）孵育，然后(rnhu)(rnhu)再加再加 酶的酶的底物，显示

40、抗原抗体抗原抗体复合物存在的部底物，显示抗原抗体抗原抗体复合物存在的部 位，以对抗原位，以对抗原进行检测。进行检测。如：如：1 1抗是由兔产生的多克隆抗体抗是由兔产生的多克隆抗体, ,则则2 2抗常用羊抗兔抗常用羊抗兔IgGIgG； 1 1抗是由鼠产生的单克隆抗体抗是由鼠产生的单克隆抗体, ,则则2 2抗常用羊或马抗鼠抗常用羊或马抗鼠IgGIgG。以上两种方法称为酶标抗体法以上两种方法称为酶标抗体法（3 3）非酶标记的抗体酶法：是以酶为抗原免疫动物，产生抗酶的抗体。）非酶标记的抗体酶法：是以酶为抗原免疫动物，产生抗酶的抗体。通过酶与抗体的特异性结合进行标记。该方法适用于石蜡包埋的组织通过酶与抗

41、体的特异性结合进行标记。该方法适用于石蜡包埋的组织切片。切片。常用的有常用的有PAPPAP、sABCsABC、LsABLsAB法（附图表说明）法（附图表说明）第51页/共112页第五十二页，共113页。（酶标识特异（酶标识特异(ty)抗体抗体（酶标识（酶标识(biozh)二次抗体二次抗体第52页/共112页第五十三页，共113页。生物素生物素 HRPHRPALPALP第53页/共112页第五十四页，共113页。2.2.常用的酶种类常用的酶种类 底物底物 沉淀颜色沉淀颜色(yns)(yns)HRP A.3,3HRP A.3,3氨基联苯胺氨基联苯胺DABDABH2O2 H2O2 深褐色深褐色 B.

42、5 B.5氨基水杨酸氨基水杨酸 H2O2 H2O2 棕色棕色ALP A.ALP A.苯酚磷酸盐重氮盐红色苯酚磷酸盐重氮盐红色 B.P B.P校际酚磷酸盐黄色校际酚磷酸盐黄色酸性磷酸酶酸性磷酸酶 Gomoui Gomoui液液葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶 D D葡萄糖葡萄糖MTTMTT酚嗪磷酸酚嗪磷酸 甲酯化合物甲酯化合物 蓝色蓝色第54页/共112页第五十五页，共113页。第三节第三节 免疫组化的实际操作免疫组化的实际操作1.1.实验准备（必须器材）实验准备（必须器材） （1 1）实验台：光线充足，方便操作。）实验台：光线充足，方便操作。 （2 2）湿润盒：放置抗原抗体反应过程中反应，）湿润盒：放

43、置抗原抗体反应过程中反应，避免干燥。避免干燥。 （3 3）微量移液器：）微量移液器：1 120l,2020l,20200l,100200l,1001000l1000l。 （4 4）其它：滤纸、纱布、吸头、）其它：滤纸、纱布、吸头、EPEP管、染缸、管、染缸、提篮提篮(t ln)(t ln)等。等。2.2.试剂药品试剂药品 （1 1）缓冲液：）缓冲液：PBS,0.01 MPBS,0.01 M磷酸缓冲液磷酸缓冲液（pH7.2pH7.2） TBS,0.05 M Tris TBS,0.05 M Tris盐酸缓冲液盐酸缓冲液（pH7.6pH7.6） （2 2）抗体稀释液）抗体稀释液: 1: 1BSABS

44、A或或0.01 MPBS0.01 MPBS （3 3）10102 2抗免疫动物的正常血清抗免疫动物的正常血清 （4 4）DBADBAH2O2H2O2显色液显色液 （5 5）核复染液：苏木素或甲基绿）核复染液：苏木素或甲基绿第55页/共112页第五十六页，共113页。 3.sABC法的操作过程基本原理：sABC（strepto-avidin-biotin peroxidase complex）链球菌抗生物素（卵白蛋）生物素过氧化物酶复合物生物素(biotin):是一种分子量为244da的小分子的维生素。 抗生物素(avidin):是一种糖蛋白，分子量为68KDa。 生物素与抗生物素有很强的亲和力

45、，两者一旦结合就很难解离。同时(tngsh)生物素与抗生物素都有与其它示踪剂如荧光素，胶体金和过氧化物酶等相结合的能力。所以生物素-抗生物素系统具有灵敏度高、特异性强及方便快速等显着优点。附基本操作步骤第56页/共112页第五十七页，共113页。第57页/共112页第五十八页，共113页。第四节第四节 注意事项及结果判定注意事项及结果判定 要想得到理想的结果，组织细胞形态要想得到理想的结果，组织细胞形态的保存、抗原性的保存、充分的保存、抗原性的保存、充分(chngfn)(chngfn)的显示是非常必要的。要满的显示是非常必要的。要满足这些条件，取材、固定、切片厚度、操足这些条件，取材、固定、切

46、片厚度、操作过程、抗体浓度及特异性的选择、操作作过程、抗体浓度及特异性的选择、操作前蛋白酶的消化、抗原修复及显色等各程前蛋白酶的消化、抗原修复及显色等各程序的操作不当均可导致不满意结果的产生。序的操作不当均可导致不满意结果的产生。第58页/共112页第五十九页，共113页。1. 取材固定取材固定(gdng) 标本要尽可能新鲜，取材固定标本要尽可能新鲜，取材固定(gdng)要及时，固定要及时，固定(gdng)液要新液要新 鲜充足，防止组织破坏和抗原性的失活。鲜充足，防止组织破坏和抗原性的失活。2. 切片切片 切片不宜过厚，一般切片不宜过厚，一般4m左右。切片不宜过大，载玻左右。切片不宜过大，载玻

47、片要涂粘附剂，以防脱片。切好的切片暂放片要涂粘附剂，以防脱片。切好的切片暂放37温箱保温箱保存。存。第59页/共112页第六十页，共113页。3.3.脱蜡脱蜡 脱蜡一定要彻底，新鲜二甲苯脱蜡一定要彻底，新鲜二甲苯 5min 5min3 3。4.4.蛋白酶消化蛋白酶消化 由于组织在固定时抗原决定簇可能由于组织在固定时抗原决定簇可能(knng)(knng)被固定剂所封被固定剂所封闭，因此在抗原抗体反应前常用蛋白酶处理组织切片（根据闭，因此在抗原抗体反应前常用蛋白酶处理组织切片（根据1 1抗抗要求），使抗原决定簇充分暴露出来，并使组织通透性增高，要求），使抗原决定簇充分暴露出来，并使组织通透性增高，

48、使抗体充分结合抗原，增强特异性染色。一般用使抗体充分结合抗原，增强特异性染色。一般用0.1%0.1%胰蛋白酶胰蛋白酶或胃蛋白酶消化或胃蛋白酶消化5 530min30min。5.5.抗原修复抗原修复 一般在柠檬酸钠抗原修复液内，微波炉，一般在柠檬酸钠抗原修复液内，微波炉，85859595，10min10min左右。左右。第60页/共112页第六十一页，共113页。6.6.抗体的选择抗体的选择 选择抗体时要注意是用于冰冻切片还是用于石蜡切片的抗体，或选择抗体时要注意是用于冰冻切片还是用于石蜡切片的抗体，或是是(hu sh)(hu sh)二者均可；其次要看抗体说明，是单抗还是多抗；适用二者均可；其次

49、要看抗体说明，是单抗还是多抗；适用于哪些组织；抗体来源于哪种动物，由此来选择于哪些组织；抗体来源于哪种动物，由此来选择2 2抗；还有抗体的稀抗；还有抗体的稀度（在实验前根据预实验选择最佳浓度。度（在实验前根据预实验选择最佳浓度。7.7.特异性的确定特异性的确定 阴性对照（不加阴性对照（不加1 1抗，用抗，用PBSPBS或或TBSTBS代替）代替） 阳性对照（已知确定阳性的组织）或买阳性对照片阳性对照（已知确定阳性的组织）或买阳性对照片显色：注意显色：注意H2O2H2O2的浓度，必须在显示前加入的浓度，必须在显示前加入H2O2H2O2均匀搅拌，最佳显色均匀搅拌，最佳显色时间在时间在3 35min

50、5min，过短或过长都不会出现满意的效果。，过短或过长都不会出现满意的效果。第61页/共112页第六十二页，共113页。 9. 9.复染复染 一般用苏木素一般用苏木素30s30s1min1min，过长复染将掩盖免疫组化的染色效果，过长复染将掩盖免疫组化的染色效果(xiogu)(xiogu)。10.10.结果判定结果判定 判断是否阳性或阴性，要排除假阳性或假阴性结果。也要学会判断特异判断是否阳性或阴性，要排除假阳性或假阴性结果。也要学会判断特异性染色和非特异性染色。呈色深浅可反映抗原存在的数量，可作为定性、定性染色和非特异性染色。呈色深浅可反映抗原存在的数量，可作为定性、定位和定量的依据。位和定

51、量的依据。 有关阳性结果的定量判断，常规的方法是根据呈色深浅和阳性细胞数量有关阳性结果的定量判断，常规的方法是根据呈色深浅和阳性细胞数量分类计算，以（分类计算，以（- -）,+,+,+,+,+,+等分级和计数统计。等分级和计数统计。以下用图片说明以下用图片说明第62页/共112页第六十三页，共113页。胃癌胃癌(wi i)(wi i)淋巴结淋巴结转移转移cerbB-2cerbB-2癌基因表达癌基因表达sABCsABC法法第63页/共112页第六十四页，共113页。胃癌胃癌(wi i)(wi i)，P53P53抑癌基因表达，抑癌基因表达， sABC sABC法法第64页/共112页第六十五页，共

52、113页。胃癌胃癌(wi i)CerbB-2(wi i)CerbB-2的表达，的表达， sABC sABC法法第65页/共112页第六十六页，共113页。胃癌胃癌(wi i)cerbB-2(wi i)cerbB-2的淋巴管侵袭，的淋巴管侵袭， sABC sABC法法第66页/共112页第六十七页，共113页。胃淋巴组织反应胃淋巴组织反应性增生性增生(zngshng)(zngshng)，CD20/CD43CD20/CD43检测检测sABCsABC法法第67页/共112页第六十八页，共113页。胃组织中的反应性增生的淋巴胃组织中的反应性增生的淋巴(ln b)(ln b)组织，组织，CD43CD43

53、表达，表达， sABC sABC法法第68页/共112页第六十九页，共113页。IgANIgAN，TGFs2TGFs2表达表达(biod)(biod)，主要在近曲肾小管内，主要在近曲肾小管内， sABC sABC法法第69页/共112页第七十页，共113页。IgAN, TGFs2IgAN, TGFs2的表达的表达(biod)(biod)，sABCsABC法法第70页/共112页第七十一页，共113页。IgANIgAN，bFGFbFGF的表达的表达(biod)(biod)， sABC sABC法法第71页/共112页第七十二页，共113页。IgAN, PDGFIgAN, PDGF的表达的表达(b

54、iod)(biod)， sABC sABC法法第72页/共112页第七十三页，共113页。骨骼肌营养不良，骨骼肌营养不良，myosinmyosin蛋白蛋白(dnbi)(dnbi)表达，表达， sABC sABC法法第73页/共112页第七十四页，共113页。第74页/共112页第七十五页，共113页。第75页/共112页第七十六页，共113页。第76页/共112页第七十七页，共113页。第77页/共112页第七十八页，共113页。第78页/共112页第七十九页，共113页。第五节第五节 免疫免疫(miny)(miny)组织化学在病理组织化学在病理诊断中的应用范围诊断中的应用范围1.1.肿瘤诊断

55、肿瘤诊断 未分化恶性肿瘤性质判定；圆形、梭未分化恶性肿瘤性质判定；圆形、梭形、多形性肿瘤细形、多形性肿瘤细胞鉴别；转移肿瘤的原发部位的确定。胞鉴别；转移肿瘤的原发部位的确定。2.2.淋巴瘤的诊断淋巴瘤的诊断 鉴定反应性增生疾病与淋巴瘤；各种鉴定反应性增生疾病与淋巴瘤；各种淋巴瘤的分型。淋巴瘤的分型。3.3.内分泌肿瘤的诊断（检测肿瘤分泌的激内分泌肿瘤的诊断（检测肿瘤分泌的激素素) )4.4.软组织肿瘤；神经系统肿瘤软组织肿瘤；神经系统肿瘤第79页/共112页第八十页，共113页。5.小活检组织病理检查（能明确显示瘤细胞存在与否小活检组织病理检查（能明确显示瘤细胞存在与否)6.微小癌、微小转移灶

56、（淋巴结和骨髓微小癌、微小转移灶（淋巴结和骨髓)7.细针穿刺（细胞学诊断细针穿刺（细胞学诊断)8.部分肿瘤来源分类部分肿瘤来源分类9.乳腺癌激素受体检测（乳腺癌激素受体检测（ER，PR)10.肿瘤基因肿瘤基因(jyn)产物（产物（p53,cerb-B2,ALK,CDs)11.增殖细胞核抗原（增殖细胞核抗原（Ki-67，PCNA)判定肿瘤的预后判定肿瘤的预后12.病因诊断（病因诊断（HBV，HCV，EBV，CMV，HIV等等)第80页/共112页第八十一页，共113页。第六节第六节 免疫免疫(miny)(miny)组织化学在病组织化学在病理诊断中存在的不足理诊断中存在的不足1.1.与分子生物学等

57、技术相比，范围有限与分子生物学等技术相比，范围有限2.2.并非所有肿瘤均可以做免疫并非所有肿瘤均可以做免疫(miny)(miny)组化，因常无相应的抗体组化，因常无相应的抗体3.3.相当多的肿瘤缺乏特异性抗原的表达，相当多的肿瘤缺乏特异性抗原的表达，同一种抗体，常同一种抗体，常 常可表达多种肿瘤常可表达多种肿瘤4.4.免疫免疫(miny)(miny)组织化学标准化问题组织化学标准化问题第81页/共112页第八十二页，共113页。第四部分第四部分 免疫电子显微镜技术免疫电子显微镜技术一、免疫电镜技术一、免疫电镜技术(immunoelection microscopy) 是利用是利用(lyng)抗

58、原和抗体特异性结抗原和抗体特异性结合的原理，在超微结构水平定位、定合的原理，在超微结构水平定位、定性及半定量显示抗原的技术方法。从性及半定量显示抗原的技术方法。从细胞超微结构水平研究和观察抗原抗细胞超微结构水平研究和观察抗原抗体的免疫反应，必须使抗体带上具有体的免疫反应，必须使抗体带上具有高电子密度的标记物，这样才能在电高电子密度的标记物，这样才能在电镜下观察反应分结果。镜下观察反应分结果。 到目前为止，已有三种标记技术：到目前为止，已有三种标记技术： (1)铁蛋白标记技术铁蛋白标记技术 (2)酶标记技术酶标记技术 (3)胶体金标记技术胶体金标记技术第82页/共112页第八十三页，共113页。

59、二、免疫金标记技术（二、免疫金标记技术（immunogold staining immunogold staining technique)technique) 用胶体状态的金颗粒，作为抗体的标记物，制成免用胶体状态的金颗粒，作为抗体的标记物，制成免疫胶体金来研究抗原抗体的反应。在光镜下，胶体金呈疫胶体金来研究抗原抗体的反应。在光镜下，胶体金呈鲜红色。电镜下，金颗粒电子密度大，有利于超微结构鲜红色。电镜下，金颗粒电子密度大，有利于超微结构的观察。的观察。 根据抗体特异性结合的原理，在亚细胞水平定性定根据抗体特异性结合的原理，在亚细胞水平定性定位。对抗体加以标记，形成位。对抗体加以标记，形成(x

60、ngchng)(xngchng)高电子密度区，高电子密度区，在电镜下观察反应过程。在对细胞内抗原定性研究中，在电镜下观察反应过程。在对细胞内抗原定性研究中，还可用不同的金颗粒标记同一细胞内不同的抗原。进行还可用不同的金颗粒标记同一细胞内不同的抗原。进行多重标记。多重标记。 第83页/共112页第八十四页，共113页。三、免疫电镜的基本技术方法三、免疫电镜的基本技术方法1.1.标本的处理标本的处理(1)(1)取材取材(qci):(qci):各种培养细胞和分离的血细胞应随用随取；各种培养细胞和分离的血细胞应随用随取；游离的培游离的培 养细胞可先进行离心；贴壁细胞可在载玻片上固定，养细胞可先进行离心