第1章 蛋白质化学3

1、 蛋白质复杂的蛋白质复杂的组成组成和和结构结构是其多种多样生是其多种多样生物学功能的基础；而蛋白质独特的物学功能的基础；而蛋白质独特的性质性质和和功功能能则是其结构的反映。则是其结构的反映。 蛋白质一级结构包含了其分子的所有信息，蛋白质一级结构包含了其分子的所有信息，并决定其高级结构，高级结构和其功能密切并决定其高级结构，高级结构和其功能密切相关。相关。 保护和支持功能保护和支持功能-结构蛋白，细胞和组织的构建，如微管蛋白、延伸蛋白、胶原蛋白、角蛋白等。 保护和开发蛋白： 一、一级结构与功能的关系一、一级结构与功能的关系（一级结构中的保守序列决定空间结构一级结构中的保守序列决定空间结构）（1）

2、一级结构的变异与分子病一级结构的变异与分子病：保守氨基酸改变，保守氨基酸改变，功能改变功能改变 实例实例：分子病：分子病（2）同源蛋白质的一级结构差异与生物进化同源蛋白质的一级结构差异与生物进化：保守：保守氨基酸不变，功能不变氨基酸不变，功能不变. 实例实例：不同生物的细胞色素不同生物的细胞色素C:真核细胞线粒体内膜真核细胞线粒体内膜含铁单链蛋白质，生物氧化中起传递电子作用含铁单链蛋白质，生物氧化中起传递电子作用.分子病分子病（molecular disease）：）：由于基因结构由于基因结构改变，蛋白质一级结构中的改变，蛋白质一级结构中的关键氨基酸关键氨基酸发生改变，发生改变，从而导致蛋白质

3、功能障碍，出现相应的临床症状，从而导致蛋白质功能障碍，出现相应的临床症状，这类遗传性疾病称为分子病。这类遗传性疾病称为分子病。【经典举例】【经典举例】镰形细胞贫血症镰形细胞贫血症：编码：编码珠蛋白珠蛋白链的链的结构基因第六个密码子由结构基因第六个密码子由CTTCAT，（，（GAA-GUA），相应的多肽序列中相应的多肽序列中N端的第六个氨基酸端的第六个氨基酸由由GluVla； 谷氨酸谷氨酸侧链带负电的羧基，侧链带负电的羧基，缬氨酸缬氨酸侧链不带电荷的疏水基，降低溶解度，血红蛋白侧链不带电荷的疏水基，降低溶解度，血红蛋白分子容易聚集成纤维状，分子容易聚集成纤维状，使红细胞变形成成使红细胞变形成成

4、杆状多聚杆状多聚体（镰形），输氧能力下降，细胞脆弱易溶血而引起贫血。体（镰形），输氧能力下降，细胞脆弱易溶血而引起贫血。 CTT （GAA）CAT （GUA） 1949 Pauling（美）指出美）指出镰刀形红细胞性贫血是一镰刀形红细胞性贫血是一种分子病，并于种分子病，并于1951年提年提出蛋白质存在二级结构。出蛋白质存在二级结构。 1954年获诺贝尔奖年获诺贝尔奖李纳斯李纳斯鲍林（鲍林（Linus Pauling） 细胞色素细胞色素c c分子的空间结构分子的空间结构不变不变的的AAAA残基残基 35个不变的个不变的AA残基，残基，是是Cyt C 的的生物功能所不可缺生物功能所不可缺少的。少的

5、。其中有的可能参加其中有的可能参加维持分子维持分子构象构象；有；有的可能参与的可能参与电子传电子传递递；有的可能参与；有的可能参与“识别识别”并结合细并结合细胞色素还原酶和氧胞色素还原酶和氧化化酶酶。生物生物 与人不同的与人不同的AAAA数目数目黑猩猩黑猩猩 0恒河猴恒河猴 1兔兔 9袋鼠袋鼠 10牛、猪、羊、狗牛、猪、羊、狗 11马马 12鸡、火鸡鸡、火鸡 13响尾蛇响尾蛇 14海龟海龟 15金枪鱼金枪鱼 21角饺角饺 23小蝇小蝇 25蛾蛾 31小麦小麦 35粗早链孢霉粗早链孢霉 43酵母酵母 44 不同生物与人的不同生物与人的CytcCytc的的AAAA差异数目差异数目根据细胞色素根据细

6、胞色素 C（真核细胞线粒体内膜含真核细胞线粒体内膜含铁蛋白质，生物氧化起传递作用）铁蛋白质，生物氧化起传递作用）的顺序的顺序种属差异建立起来的进化树种属差异建立起来的进化树进化分支点进化分支点 二、空间结构与功能的关系二、空间结构与功能的关系空间结构中的空间结构中的特定区域特定区域体现生物活性体现生物活性1、空间结构体现、空间结构体现生物特异性生物特异性2、空间结构体现、空间结构体现生物活性生物活性 核糖核酸酶核糖核酸酶实验证明，蛋白质氨基酸序实验证明，蛋白质氨基酸序列决定它的构象，而构象又决定其功能。列决定它的构象，而构象又决定其功能。 n别构效应别构效应（别位效应、变位效应，（别位效应、变

7、位效应，allosteric effect）：）：蛋白质分子的特定部位（调节部位）与小分子化合蛋白质分子的特定部位（调节部位）与小分子化合物（效应物）结合后，引起空间构象发生改变，从物（效应物）结合后，引起空间构象发生改变，从而促使生物学活性变化的现象称为变构效应。包括而促使生物学活性变化的现象称为变构效应。包括正协同、负协同效应正协同、负协同效应【经典举例】【经典举例】血红蛋白（血红蛋白（Hb）：）：由由22四聚体组四聚体组成，每个亚基含有成，每个亚基含有1个血红素辅基；个血红素辅基；Hb的氧解离曲的氧解离曲线呈线呈“S”型。型。n多种空间构象，多种活性状态多种空间构象，多种活性状态3、空间

8、结构的灵活性，体现了生物活性的、空间结构的灵活性，体现了生物活性的可调节特性可调节特性血红蛋白由血红蛋白由去氧形式去氧形式(T)变为变为氧合形式时氧合形式时(R)亚基的移动亚基的移动血红蛋白的血红蛋白的别构效应充别构效应充分地反映了分地反映了它的生物学它的生物学适应性、结适应性、结构与功能的构与功能的高度统一性高度统一性。与氧亲和力低空气中CO 0.06-0.08%有中毒危险,0.1%则窒息死亡. 4、 空间构象并非生物活性的唯一影响因素空间构象并非生物活性的唯一影响因素【举例】低温下酶活性低，但并不影响构象；盐【举例】低温下酶活性低，但并不影响构象；盐析时沉淀的酶无活性，但构象不变。析时沉淀

9、的酶无活性，但构象不变。 5、蛋白构象疾病：、蛋白构象疾病：错误构象相互聚集，形成抗错误构象相互聚集，形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病。蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病。n老年痴呆老年痴呆n疯牛病疯牛病n亨汀顿舞蹈病亨汀顿舞蹈病 （二级结构多为二级结构多为螺旋、螺旋、对蛋白酶敏感、水溶性对蛋白酶敏感、水溶性）（一级结构相同，但二级结构全为一级结构相同，但二级结构全为折叠，折叠，抗蛋白酶、水溶性差、蛋白聚集成淀粉抗蛋白酶、水溶性差、蛋白聚集成淀粉样沉淀）样沉淀） 蛋白质的重要性质蛋白质的重要性质一、一、 两性解离性质及等电点两性解离性质及等电点二、二、 蛋白质胶体性质蛋

10、白质胶体性质三、三、 蛋白质的沉淀蛋白质的沉淀四、四、 蛋白质的变性与复性蛋白质的变性与复性五、五、 蛋白质的紫外吸收特性蛋白质的紫外吸收特性六、六、 蛋白质成色反应蛋白质成色反应 同同“氨基酸两性解离氨基酸两性解离”一、一、 两性解离性质及等电点两性解离性质及等电点 蛋白质两性解离性质和等电点蛋白质两性解离性质和等电点pH = pI 净电荷净电荷=0 pH pI净电荷为负净电荷为负PrCOOHNH3+ + H+ OH- + H+ OH-PrCOO-NH2PrCOO-NH3+ 当蛋白质溶液在某一定当蛋白质溶液在某一定pH值时，使某特定蛋白质分子上所带正负值时，使某特定蛋白质分子上所带正负电荷相

11、等，成为两性离子，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，电荷相等，成为两性离子，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的此时溶液的pH值即为该蛋白质的值即为该蛋白质的等电点等电点 （isoelectric point，pI） 二、二、 蛋白质胶体性质蛋白质胶体性质具有胶体溶液的布朗运动、丁达尔效应以及不能透过半透膜具有胶体溶液的布朗运动、丁达尔效应以及不能透过半透膜. 蛋白质胶体性质蛋白质胶体性质 可溶性蛋白质分子表面分布着大量可溶性蛋白质分子表面分布着大量极性氨基酸极性氨基酸残基，对水有很高的亲和性，通过水合作用在蛋白残基，对水有很高的亲和性，通过水合作用在蛋白质颗粒外面形成一层质颗粒外面形

12、成一层水化层水化层，同时这些颗粒带有，同时这些颗粒带有电电荷荷，因而蛋白质溶液是相当稳定的，因而蛋白质溶液是相当稳定的亲水胶体亲水胶体。 蛋白质胶体性质的应用蛋白质胶体性质的应用 透析法透析法（dialysisdialysis） : :利用蛋白质不能透过半透膜利用蛋白质不能透过半透膜的的性质，将含有小分子杂质的蛋白质溶液放入透析的的性质，将含有小分子杂质的蛋白质溶液放入透析袋再置于流水中，小分子杂质被透析出，大分子蛋白袋再置于流水中，小分子杂质被透析出，大分子蛋白质留在袋中，以达到纯化蛋白质的目的。质留在袋中，以达到纯化蛋白质的目的。 盐析法盐析法: :在蛋白质溶液中加入在蛋白质溶液中加入高浓

13、度高浓度的硫酸铵、硫酸的硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等中性盐，可有效地破坏蛋白质颗粒的钠、氯化钠等中性盐，可有效地破坏蛋白质颗粒的水化层水化层。同时又中和了蛋白质表面的。同时又中和了蛋白质表面的电荷电荷，从而使，从而使蛋白质颗粒集聚而生成沉淀，这种现象称为蛋白质颗粒集聚而生成沉淀，这种现象称为盐析盐析（salting outsalting out）。不同蛋白质析出时需要的盐浓度不不同蛋白质析出时需要的盐浓度不同，利用分段盐析分离制备蛋白质同，利用分段盐析分离制备蛋白质。 如果加入适当的试剂使蛋白质分子处于等电点状如果加入适当的试剂使蛋白质分子处于等电点状态或失去水化层（态或失去水化层（消除相同电荷，

14、除去水膜消除相同电荷，除去水膜），蛋白），蛋白质胶体溶液就不再稳定并将产生沉淀。质胶体溶液就不再稳定并将产生沉淀。 三、三、 蛋白质的沉淀蛋白质的沉淀 高浓度中性盐（盐析、盐溶）高浓度中性盐（盐析、盐溶）-保持生物活性保持生物活性 酸碱（等电点沉淀）酸碱（等电点沉淀） 有机溶剂沉淀：有机溶剂沉淀：-低温时保持生物活性，低温时保持生物活性，有机溶剂（乙醇、有机溶剂（乙醇、丙酮等）作为脱水剂破坏水化层，降低介电常数，增强分子间作用丙酮等）作为脱水剂破坏水化层，降低介电常数，增强分子间作用。重金属盐类沉淀：重金属盐类沉淀：HgHg2+2+、AgAg2+2+、PbPb2+2+等与带电基团形成不溶解盐等

15、与带电基团形成不溶解盐 ( (pHpIpHpI 生物碱试剂和某些酸类沉淀：生物碱试剂和某些酸类沉淀：苦味酸、三氯乙酸、丹宁酸等与蛋苦味酸、三氯乙酸、丹宁酸等与蛋白质带正电基团生成不溶性盐。（白质带正电基团生成不溶性盐。（pH pIpH pI）（）（生物碱试剂生物碱试剂: :能引起生物碱沉淀的一类试剂。能引起生物碱沉淀的一类试剂。加热变性沉淀加热变性沉淀四、蛋白质的四、蛋白质的变性变性(denaturation)与与复性复性(renaturation)（1）变性：）变性：蛋白质各自所特有的高级结构，是表现蛋白质各自所特有的高级结构，是表现其其物理物理性质和性质和化学化学特性以及特性以及生物学生物

16、学功能的基础。功能的基础。在某在某些理化因素作用下，蛋白质的空间结构被破坏，从而些理化因素作用下，蛋白质的空间结构被破坏，从而导致其理化性质改变、生物活性丧失的现象称为变性。导致其理化性质改变、生物活性丧失的现象称为变性。 变性不涉及一级结构的变化。变性不涉及一级结构的变化。特征特征：生物活性生物活性丧失；丧失；物理性质物理性质（溶解度、粘度、（溶解度、粘度、扩散系数、光谱特性等）和扩散系数、光谱特性等）和化学性质化学性质（化学反应，（化学反应，被酶解性）改变。被酶解性）改变。理化因素理化因素次级键次级键断裂断裂空间结构空间结构遭破坏遭破坏理化性质改变理化性质改变生物学活性丧失生物学活性丧失紫

17、外吸收上升紫外吸收上升变性原因变性原因变性本质变性本质变性结果变性结果蛋蛋白白变变性性物理因素：加热（物理因素：加热（70-100OC）、）、紫外线等射线照射、超声波、高压、剧烈震荡或搅拌等；紫外线等射线照射、超声波、高压、剧烈震荡或搅拌等；化学因素：强酸、强碱、脲、胍、去垢剂、金属盐、生物碱、有机溶剂等。化学因素：强酸、强碱、脲、胍、去垢剂、金属盐、生物碱、有机溶剂等。 核糖核酸酶变性与复性作用核糖核酸酶变性与复性作用Native ribonucleaseDenative reduced ribonucleaseNative ribonuclease8 M urea and -mercapo

18、toethanolDialysis变性变性复性复性天然状态，天然状态，有催化活性有催化活性8 M尿素、 -巯基乙醇非折叠状态，无活性非折叠状态，无活性 蛋白质变性与复性蛋白质变性与复性 （2）应用）应用 利用变性利用变性：酒精消毒、高压灭菌、酒精消毒、高压灭菌、变性制食品变性制食品（豆腐：加热（豆腐：加热+ +盐卤盐卤MgClMgCl2 2, ,豆腐脑、老豆腐、嫩豆豆腐脑、老豆腐、嫩豆腐）、腐）、加热变性使熟食易消化、抗衰老加热变性使熟食易消化、抗衰老（种子和有（种子和有机体蛋白质缓慢变性，亲水性相应减弱）机体蛋白质缓慢变性，亲水性相应减弱） 防止变性防止变性：低温保存生物制品（酶、疫苗等）：

19、低温保存生物制品（酶、疫苗等） 取代变性取代变性：解毒剂：解毒剂(生牛奶、豆浆、生鸡蛋清与生牛奶、豆浆、生鸡蛋清与重金属生成不溶性盐，用于急救重金属重金属生成不溶性盐，用于急救重金属HgHg2+2+、AgAg2+2+、PbPb2+2+中毒）中毒） 我国生物化学的开拓者吴宪吴宪教授蛋白质研究领域内国际上最具有权威性的综蛋白质研究领域内国际上最具有权威性的综述性丛书述性丛书Advances in Protein Chemistry第第47卷（卷（1995年）发表了美国年）发表了美国哈佛大学教授、蛋白质研究的老前辈哈佛大学教授、蛋白质研究的老前辈J. T. Eddsall的文章的文章“吴宪与第一个蛋

20、白质变性吴宪与第一个蛋白质变性理论（理论（1931）Hsien Wu and the first Theory of Protein Denaturation(1931)”，对吴宪教授的学术成就给予了极高的评价。对吴宪教授的学术成就给予了极高的评价。该卷在该卷在1995年还重新刊登了吴宪教授六十年还重新刊登了吴宪教授六十四年前关于蛋白质变性的论文。四年前关于蛋白质变性的论文。一篇在一篇在1931年发表的论文居然在年发表的论文居然在1995年仍年仍然值得在第一流的丛书上重新全文刊登，不然值得在第一流的丛书上重新全文刊登，不能不说是国际科学界的一件极为罕见的大事。能不说是国际科学界的一件极为罕见的

21、大事。蛋白质的变性就是从卷曲变到伸展的过程。蛋白质的变性就是从卷曲变到伸展的过程。 （3）复性）复性：蛋白质的变性作用如果不过于剧蛋白质的变性作用如果不过于剧烈，则是一种可逆过程，变性蛋白质通常在除烈，则是一种可逆过程，变性蛋白质通常在除去去变性因素变性因素后，可缓慢地重新自发折叠成原来后，可缓慢地重新自发折叠成原来的构象，恢复原有的理化性质和生物活性，这的构象，恢复原有的理化性质和生物活性，这种现象成为种现象成为复性复性（renaturationrenaturation）。）。 五、五、 蛋白质的紫外吸收特性蛋白质的紫外吸收特性测定范围：测定范围：0.10.5mg/ml蛋白质质量浓度蛋白质质

22、量浓度/（mg/ml）=1.45A2801cm - 0.47A 260 1cm 6、蛋白质成蛋白质成色反应：双缩尿反应，茚三酮反应等。色反应：双缩尿反应，茚三酮反应等。双缩脲反应可检测蛋白质的水解程度可检测蛋白质的水解程度 蛋白质在碱性溶液中也蛋白质在碱性溶液中也能与硫酸铜发生相同反应，能与硫酸铜发生相同反应，产生红紫色络合物（产生红紫色络合物（定性定性测定确定蛋白质测定确定蛋白质）；）；540nm比色，比色，定量测定蛋定量测定蛋白质。白质。红紫色络合物红紫色络合物(碱性溶液碱性溶液)硫酸铜硫酸铜Cu2+尿素180OC 蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化蛋白质研究技术（根据分子大小分离） （根据

23、溶解度分离） 等电点沉淀等电点沉淀 （根据带有电荷分离） 蛋白质、核酸、核糖体、病毒等沉降系数蛋白质、核酸、核糖体、病毒等沉降系数1 X 10-13200 X 10-13秒之间，为方便，把秒之间，为方便，把10-13秒作为一个单位称斯维德贝格或秒作为一个单位称斯维德贝格或沉降系数单位（沉降系数单位（Svedberg unit）。）。测定标准条件：测定标准条件：20OC，溶，溶剂为水。剂为水。需需60000-80000rpm离心机，产生相当于地球重力离心机，产生相当于地球重力50-60万倍的万倍的强大离心力，使蛋白质颗粒沉降下来。强大离心力，使蛋白质颗粒沉降下来。 蛋白质的分离纯化总结：蛋白质的

24、分离纯化总结：1、透析、超滤、透析、超滤n根据蛋白质性质：根据蛋白质性质：分子大小分子大小2、盐析（、盐析（salting out）n根据性质：蛋白质的根据性质：蛋白质的溶解度溶解度（沉淀）（沉淀）n作用机理：中性盐中和表面电荷，破坏水化层作用机理：中性盐中和表面电荷，破坏水化层n影响因素：表面电荷、水化层、溶剂性质影响因素：表面电荷、水化层、溶剂性质 3、电泳：、电泳：n根据性质：蛋白质的根据性质：蛋白质的两性解离两性解离n作用机理：异性电荷互相吸引作用机理：异性电荷互相吸引n影响因素：电荷种类及数量、分子大小及形状、影响因素：电荷种类及数量、分子大小及形状、溶液离子强度及溶液离子强度及pH等等4、层析、层析（1）离子交换层析：）离子交换层析：电荷、分子量、分子形状电荷、分子量、分子形状（2）亲和层析：）亲和层析：生物特性生物特性（3）吸附层析：）吸附层析：吸附特性吸附特性 （4）分子筛（凝胶过滤层析）：）分子筛（凝胶过滤层析）：分子大小及形状分子大小及形状n大分子先洗脱下来大分子先洗脱下来5、超速离心：、超速离心：分子大小及形状、溶液特性分子大小及形状、溶液特性 基本策略基本策略： 片段重叠法氨基酸顺序直测法片段重叠法氨基酸顺序直测法 基本步骤：基本步骤：(1) (1) 多肽链的分离，测定蛋白质分子中