高效液相色谱

1、高效液相色谱高效液相色谱- 原理与方法原理与方法 第一第一节节 基基本原理和术语本原理和术语第二第二节节 高高效液相色谱系统效液相色谱系统第三第三节节 正正相和反相高效液相色谱相和反相高效液相色谱第四第四节节 其其它高效液相色谱方法它高效液相色谱方法第五第五节节 建建立高效液相色谱分析方法的一般步骤立高效液相色谱分析方法的一般步骤第六节第六节 高高效液相色谱的应用效液相色谱的应用第一节第一节 基本原理和术语基本原理和术语液相色谱是指流动相为液体的色谱，包括传统的柱色谱、薄层色谱和纸色谱。20世纪50年代后气相色谱法在色谱理论研究和实验技术上迅速崛起，而液相色谱技术仍停留在经典操作方式，其操作繁

2、琐，分析时间冗长，因而未受到重视。20世纪60年代以后，随气相色谱法对高沸点有机物分析局限性的逐渐显现，人们又重新认识到液相色谱法可弥补的气相色谱法的不足之处。因此，自20世纪60年代末期，液相色谱得到重视。高效液相色谱的定性和定量分析原理和方法与气相色谱基本相同。经典液相色谱（柱色谱）法使用粗粒多孔固定相，并装填在大口径、长玻璃管内。流动相仅靠重力流经色谱柱，溶质在固定相的传质和扩散速度缓慢，因而仅有低柱效、分析时间冗场。高效液相色谱法使用了全多孔微粒固定相，装填在小口径、短不锈钢柱内，流动相通过高压输液泵进入高柱压的色谱仪，溶质在固定相的传质、扩散速度大大加快，从而在短的时间内获得高柱效和

3、高分离能力。与气相色谱比较，高效液相色谱与气相色谱有许多不同之处。气相色谱具有选择性高、分离效率高、灵敏度高和分析速度快的特点。但它仅适于分析蒸气压低和沸点低的样品，而不适用于分析高沸点、高分子量和热稳定定性差的有机物以及生物活性物质，因而使其应用受到限制。在全部有机化合物中仅有20%的样品适用于气相色谱分析。这两种方法的比较可见下表。液相色谱和气相色谱的方法比较液相色谱和气相色谱的方法比较项目液相色谱气相色谱进样方式样品配成溶液，室温样品需要加热气化流动相液相气相输送流动相的压力2 20 MPa0.1 0.5 MPa固定相颗粒的大小5 10 m0.1 0.5 m填充柱柱效103 104102

4、 103毛细管柱效104 105103 104柱温常温常温 300C选择型检测器UVD, PDADFD, ECDECD, FPD, NPD通用型检测器ELSD, RIDTCD, FID应用范围-高效液相色谱的特点：(1)分离效能高 由于新型高效微粒固定填料的使用，液相色谱填充柱的柱效可达 2103 5104 块/米理论塔板数，远远高于气相色谱填充柱 103 块/米理论塔板数的柱效。(2)选择性高 由于液相色谱柱具有高效，并且流动相可以控制和改善分离过程的选择性。因此，高效液相色谱法不仅可以分析不同类型的有机物及其同分异构体，还可以分析在性质上极为相似的旋光异构体。(3)检测灵敏度高 在高效液相

5、色谱中使用的检测器大多数都具有较高的灵敏度。如被广泛使用的紫外吸收检测器，最小间储量可达10-9g；用于痕量分析的荧光检测器，最小检出量可达10-12g。(4)分析速度快 由于高压输液泵的使用，相对于经典液相色谱，其分析时间大大缩短。完成一个样品的分析时间仅需几分钟到几十分钟。 高效液相色谱法具有上述优点，但也有下述局限性： 在高效液相色谱法中，使用多种溶剂作为流动相，分析所需成本高于气相色谱法，且易引起环境污染。但进行梯度洗脱操作时，它比气相色谱法的程序升温操作复杂。 高效液相色谱法中缺少如气相色谱法中使用的通用型检测器，如热导监测器和氢火焰离子化检测器。近年来蒸发激光散射检测器的应用日益增

6、多，有望发展成为高效液相色谱法的一种通用型检测器。 高效液相色谱法不能替代气相色谱法，对于要求柱效高达104 块理论塔板数以上的有机样品，必须用毛细管气相色谱法分析才有效。 高效液相色谱法也不能代替中和低压柱色谱法，对于在高压下易分解和变性的具有生物活性的生化样品，不能使用高效液相色谱。基本术基本术语语（1）流动相流动相 液相色谱的流动相就是一种或多种溶剂混合的液体，通过色谱柱运动，携带被分离的组分，也就是通常所说的洗脱剂。大多数液相色谱分离是利用双溶剂作为洗脱剂，它们其中的一个往往对固定相表面的相互作用是惰性的。对于反相高效液相色谱，其流动相中的一个溶剂是水，它与疏水的吸附剂表面不发生作用，

7、不与组分竞争吸附剂表面的位置。对于正相高压液相色谱，其流动相中的一个洗脱剂往往是正己烷，也不与极性的硅胶表面相互作用。任何一个双向溶剂中另外一个溶剂都是活性的，它与吸附剂表面发生相互作用，与被分析的组分竞争吸附表面的吸附位置，随着它的浓度的增加，导致组分的保留值降低。（2）固定相固定相 固定相是表面带有刚性多孔的固体颗粒，也就是我们 所说的吸附剂。常见的有多孔硅胶以及多孔氧化铝。（3）分配系数分配系数 液相色谱中的分配理论完全符合气相色谱中的分配理论。色谱分离是在两相中进行的，可以用分配系数来描述。分配系数是在一定的温度和压力下，溶质分子依据它们在固定液和流动相中的溶解度，分别进入两相进行分配

8、，当系统达到分配平衡时，组分在固定液和流动相中的平均浓度值比值为分配常数。分配系数是一个无因子量，它与组分在固定液的热力学性质有关，并随着柱温柱压的变化而变化，与固定相和流动相的体积无关。例如，A 和 B 二组分的分离，如果组分的分配系数相同，则色谱峰完全重合；反之差别越大，色谱峰分离的越好。（4）吸收系数吸收系数 在液相色谱分析中，固定相是固体吸附剂，它们是 一些多孔的极性微粒物质（如硅胶、氧化铝等），它们的表面存在着分散的吸附中心，溶质分子与流动相分子在吸附剂的吸附表面进行竞争，这种竞争还存在于不同溶质分子以及同一溶质分子中的不同官能团之间。由于这种竞争作用，形成不同溶质在吸附剂表面的吸附

9、和解吸附平衡，其平衡常数为吸附系数。吸附系数的大小与溶质和吸附剂分子相互作用的强弱有关。溶质分子与极性吸附物质相互作用，会随着溶质分子的极性增加而加强，使其在固定相的保留时间增大。不同类型的有机物在吸附剂上的保留值顺序如下：氟碳化合物 饱和烃 烯烃 芳烃 有机卤化物 醚 硝基化合物 氰化物 酯 酮 醛 醇 胺 酰胺 羧酸 磺酸。（5）保留值保留值 保留值是用来描述色谱峰在色谱图上的位置，是色谱分离过程中的重要参数，它反映了被分离物质在流动相和固定相之间的分配过程。它可以用保留时间和保留体积来表示。保留值是色谱过程热力学参数，当色谱操作条件一定是，不同物质有其特定的保留值，这是色谱定性分析的依据

10、。在液相色谱，由于流动相也参与了溶质的分配过程，因此溶质的保留不仅与固定相有关，而且也受到流动相性质的影响。（6）柱效参数柱效参数理论塔板数式中是色谱流出曲线的标准偏差，即峰高0.607处的峰半宽度。对于高斯峰峰底宽 tw = 4，柱理论塔板数可表示为：2RtN2RWt16N塔板高度目前已有很多色谱工作者从理论上解释塔板高度的因素，即板高方程。高效液相色谱的 Van Deemter 方程同样可以可简化为：在高效液相色谱中，由于分子扩散很小，B/u 项可以忽略不计，故上式可写成，CuuBAH(1) CuAH 流速对塔板高度的影响流速对塔板高度的影响(GC(GC 气相色谱；气相色谱；HPLCHPL

11、C 高效液相色谱高效液相色谱) ) 由式由式(1)可知，影响高效液相色谱可知，影响高效液相色谱柱效的主要因素是传质阻力项。柱效的主要因素是传质阻力项。 由图可见，高效液相色谱的由图可见，高效液相色谱的 H-u 曲线与气相色谱不同，曲线与气相色谱不同，随着随着 u 的增的增大，柱效降低，故其最佳流速就在大，柱效降低，故其最佳流速就在 u 很小的地方，一般控制在很小的地方，一般控制在 1ml/min 处。处。（7）分辨率和选择性分辨率和选择性 选择性就是两个色谱峰的容量因子的比值，可以用校正保留值的比值表示。选择性代表了特殊的吸附剂对这个特殊组分混合物的分离能量。这个参数与柱效无关，它只依赖于组分

12、的性质、吸附剂的表面化学、洗脱剂的类型及组成。一般说来，如果两个组分的选择性等于1，那么无论怎么提高柱效，也无法将其色谱峰分开。分辨率是定量描述混合物中相邻组分在色谱柱中分离情况的主要指标，它等于相邻两个组分保留值之差与两个组分基线宽度之和平均值的比值，用 R 表示。如果 R 1，表明两个组分可以完全分开。反之，两个组分无法分开。第二节第二节 高效液相色谱系统高效液相色谱系统高效液相色谱仪主要由高压泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪和数据处理等部分组成。其中最关键的是高压泵、色谱柱和检测器三部分。一.输液系统在液相色谱中不同极性的流动相因其极性、浓度和黏度差异很大，可选择的流动相很多。在色谱柱

13、中它不仅起冲洗作用，而且还参与分离过程，对分离的影响较大。在选择流动相溶剂时，应满足以下5个条件：溶剂不与固定相发生不可逆反应，保证色谱柱的稳定性。能与检测器相匹配。对试样有足够的溶解性。不干扰试样的回收。易于清洗。输液系统的作用是保证流动相的正常工作。他是由流动相储罐、脱气装置、高压泵和程序控制器组成。流动相在使用前必须进行脱气处理，以除去其中溶解的气体（如O2），以防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气泡。常用的脱气方法有吹氦脱气法、加热回流法、抽真空脱气法、超声波脱气法、在线真空脱气法。二.高压泵高压泵是高效液相色谱的主要元件之一。高压泵的主要作用是保证流动相以

14、稳定的流速流过色谱柱。因此对泵有以下要求：流量稳定，对于 4 5 mm的常规色谱柱，最常用的流量范围是 0.5 2 ml/min，流量变化应小于 1%；耐高压，一般最大的压力范围是14.7 48 MPa；耐腐蚀；泵的死体积小。三.程序控制器程序控制器又称梯度洗脱装置。在液相色谱中，改变流动相可以改善分离效果。因此，在分离复杂混合物时，按照一定的程序改变流动相的比例，可以提高分离效果和加快分析速度。梯度装置就是为这一目的而设计的一种装置。梯度洗脱是使流动相中含有两种或两种以上不同极性的溶剂，在洗脱过程中连续或间断改变流动相的组成，以调节它的极性，使每个流出的组分都有合适的容量因子，并使样品中的所

15、有组分可在最短的时间内，以适当的分离度获得圆满的选择性分离。梯度洗脱已在高效液相色谱法中获得广泛的应用。四.色谱柱色谱柱是高压液相色谱仪最重要的部件。一般采用直形管，标准填充柱柱管内径为 4.6 mm 或 3.9 mm，长 10 50 cm。填料粒度510 m 时，柱效每米达 5000 10000 块理论塔板数。五.检测器一个理想的液相色谱检测器应具备如下4个特征：灵敏度高，对所有的溶质都有快速响应；应对流动相流量和温度变化都不敏感；不引起柱外谱带扩展，线性范围宽；适用的范围广。在液相色谱中，流动相（溶剂）与被测组分（溶质）的物理性质相似，所以检测比较困难，它不可能有相当于气相色谱中使用的热导

16、检测器和氢火焰离子化检测器那样的既通用又灵敏的检测器，至今没有一种检测器能完全具备上列特征。液相色谱常用的检测器为紫外检测器（UVD）、电导检测器（ECD）、折光指数检测器（RID）和荧光检测器（FD）。1.紫外吸收检测器（ultraviolet absorption detector，UVD）紫外吸收检测器是目前应用最广的一种检测器。它对于具有紫外吸收的样品组分均可检测。这种检测器的灵敏度高，可用于紫外吸收度很低的样品。紫外吸收检测器有固定波长紫外检测器 ( =254 或 280 nm）、可变波长紫外检测器 ( =190 600 nm) 和光二极管阵列检测器三种。2.折光系数检测器（refr

17、action index detector，RID）RID 又称示差检测器，是一种通用的检测器，几乎适用于所有物质，它对大多数物质的响应差别不大。它是根据光的折射原理设计的。当移动相中有溶质时，移动相的折射率会发生变化。稀溶液的折射率等于溶剂和溶质各自的折射率乘以各自的浓度之和。溶有样品的流动相和流动相本身之间的折射率之差，即反映出样品在流动相中的浓度。RID 的灵敏度比紫外检测器低，受温度影响大，使用时有一定局限。3.荧光检测器（fluorescence detector，FD）许多化合物被紫外光照射后，吸收能量，电子由基态的最低振动能级跃迁到激发态的高能级。当电子在振动中损失能量时，会由激

18、发态的高能级回到激发态的低能级或基态的振动能级时，同时发射出比原来频率较低、波长较长的荧光，可被荧光检测器检测到。荧光检测器具有极高的灵敏度和良好的选择性，在生化分析中应用广泛。4.电化学检测器主要用于那些没有紫外吸收或不能发出荧光但具有电活性的物质，目前已经发展出了电导、库仑、极谱和光电导等不同类型的电化学检测器。液相色谱常用的检测器性能比较液相色谱常用的检测器性能比较参数紫外吸收检测器（UVD）折光系数检测器（RID）荧光检测器（FD）电导检测器（ECD）测量参数吸光度折光指数荧光强度电导率用于梯度洗脱可以不可可以不可线性范围105104103104噪声10-410-710-310-3最小

19、检测浓度（g/ml）10-1010-710-1110-3最小检测量1 ng1 g1 pg1 mg对流速敏感性不敏感不敏感不敏感敏感对温度敏感性低 0.0001C低 2/C第三节第三节 正相和反相高效液相色谱正相和反相高效液相色谱在分配色谱中，固定液被吸附在惰性载体上，由于可作为固定液的有机物种类很多，因此分配色谱对各种样品都能提供良好的选择性。根据固定相和流动相的相对极性的不同，可分为争相分配高效液相色谱和反相高效液相色谱。正相分配高效液相色谱：固定相的极性大于流动相的极性。反相分配高效液相色谱：固定相的极性小于流动相的极性。正相液相色谱中所使用的流动相类似于薄层色谱使用极性吸附剂所用的流动相

20、，流动相主体为正己烷、正庚烷和CHCl3。加入极性改性剂，如异丙醚、CH2Cl2、四氢呋喃、乙酸乙酯、乙醇、乙腈和甲醇等，混合溶剂的洗脱能力随着改性剂的加入明显增强。反相液相色谱中，流动相的主体是水，改性剂为二甲基亚砜、乙二醇、乙腈、甲醇、丙酮、二氧六环、四氢呋喃和异丙醇等。溶质在混合溶剂流动相中的容量因子会随着改性剂的加入而减小，表明混合溶剂的洗脱强度明显增强。 正相和反相分配色谱都可以用于分离同系物以及不同官能团的多组分混合物。在液/液分配色谱中的正反相液相色谱固定相都是在惰性载体上涂布固定液制成液/液色谱柱，在使用过程中由于大量的流动相通过色谱柱，会溶解固定液而造成固定液的流失，导致保留

21、值减小，选择性降低。所以，目前液/液分配色谱更多被化学键合相液相色谱所代替。二.正反相化学键合相液相色谱法 化学键合相色谱法是由液/液分配色谱法发展而来的。分配色谱法虽有较好的分离效果，但在分离过程中由于机械吸附在载体上固定液的流失，使柱效和分离选择性下降。流失的固定液会给基线带来大的噪声而降低检测器的灵敏度。为了解决固定液的流失问题，将各种不同的有机官能团通过化学反应键合到硅胶（载体）表面的游离羟基上，而生成化学键合固定相，并进而发展成为键合相色谱法。化学键合固定相对各种极性溶剂都有良好的化学稳定性和热稳定性，由它制备的色谱柱柱效高、使用寿命长和重现性好。几乎对各种类型的有机物都呈现良好的选

22、择性，特别适用于具有宽范围分配系数的样品的分离，并可用于梯度洗脱操作。至今，键合相色谱法已逐渐取代液/液分配色谱法，获得日益广泛的应用，在高效液相色谱法中占有极重要的位置。现在在广义上提到的正、反相液相色谱实际上都指键合相色谱法。根据键合固定相与流动相相对极性的强弱，可将键合相色谱法分为正相键合相色谱法和反相键合相色谱法。在正相键合相色谱法中，键合固定相的极性大于流动相的极性，适用于分离油溶性或水溶性的极性和强极性化合物。在反相键合相色谱法中，键合固定相的极性小于流动相的极性，适用于分离非极性、极性或离子型化合物，其应用范围比正相键合相色谱法更为广泛。据统计，在高效液相色谱法中，约 70% 8

23、0% 的分析任务皆由反相键合相色谱法来完成的。化学键合相色谱法中的固定相特性和分离机理都与借助物理涂渍的液/液色谱法存在着差别，一般不宜将化学键合相色谱法统称作液/液色谱法。1. 分离机理(1)正相键合相色谱法的分离机理在正相键合相色谱法中使用的是极性键合固定相。它是将全多孔微粒硅胶载体经酸活化处理制成表面含有大量硅羟基的载体后，再与含有氨基（NH2）、腈基（CN）和醚基（O）的硅烷化试剂反应，生成表面具有氨基、腈基和醚基的极性固定相。在此类固定相上的分离机理属于分配色谱：其中，SiO2-R-NH2 为氨基键合相，M 为溶剂分子，x 为溶质分子，SiO2-R-NH2M 为溶剂化后的氨基键合相，

24、xM 为溶剂化的溶质分子。2M xNHRSiO M x MNHRSiO2222(2)反相键合相色谱法的分离原理在反相键合相色谱法中使用的是非极性键合固定相。它是将全多孔微粒硅胶载体经酸活化处理后与含烷基链（C4、C8 和 C18）或苯基的硅烷化试剂反应，生成表面具有烷基（或苯基）的非极性固定相。关于反相键合相色谱法的分离原理有两种观点，一个是分配色谱，另一个是吸附色谱。前者与正相键合相色谱法一致。吸附色谱的理论认为组分分子在固定相的保留值是疏溶剂作用的结果。根据这个理论，当组分分子进入极性流动相后，占据流动相中的相应位置，而排斥一部分溶剂分子。当组分分子被洗脱剂带动，与固定相相互作用，非极性部

25、分会将取代非极性固定相表面的溶剂，而直接与非极性固定相上的烷基官能团相结合（吸附）形成缔合络合物，构成单分子吸附层。这种疏溶剂的斥力作用是可逆的，当流动相极性减小时，这种疏溶剂斥力下降，会发生解缔，并将组分分子释放而被洗脱下来。2.保留值的影响因素烷基键合固定相对被分析的组分分子的缔合和解缔作用能力，决定了组分分子在色谱过程中的保留值。主要有 3个因素影响组分保留值。组分分子结构：在反相键合相色谱法中，组分的分离是以它们的疏水结构差异为依据的，组分极性越弱，疏水性越强，保留值越大。固定相性质：烷基键合固定相的作用在于提供非极性作用表面，因此键合到硅胶表面的烷基数量决定着组分分配系数的大小。烷基

26、的疏水特性随碳链的加长而增加，组分的保留值也随烷基碳链长度的增加而增大。流动相性质：流动相的表面张力和介电常数越大，其极性越强。此时组分与烷基键合相的缔合作用越强，流动相的洗脱强度弱，导致组分的保留值越大。在化学键合固定相的制备中，广泛使用全多孔或薄壳型微粒硅胶作为基体。这是由于硅胶具有机械强度好、表面硅羟基反应活性高以及表面积和孔结构易于控制的特点。在键合反应前，为增加硅胶表面参与键合反应的硅羟基数量来增大键合量，通常用 2 mol/L 盐酸溶液浸渍硅胶过夜，使其表面充分活化并除去表面含有的金属杂质。3. 键合固定相的类型：(1)SiOC 键这是首先用来制备键合相的化学反应，利用硅胶的羟基酸

27、性特性，与正辛醇、聚乙二醇400 等醇类进行硅氧反应，在硅胶表面形成单分子层的硅酸酯硅酸酯。此类固定相有良好的传质特性和高柱效，但其易水解、醇解，热稳定性差。Si OHSi OR+ HOR+ H2O(2)SiC 和 SiN 键上面两种类型的 SiC 和 SiN 键的稳定性要比 SiOC 键好，其耐热性、抗水解能力要强于硅酸酯，适合在 pH = 4 8 使用。Si OHSi Cl+ HSO3Cl+ SO2Cl2 Si ClSiMgClRR+ Si ClSi NHR+ NH2R(3)含 SiOSiC 键这种固定相是由硅胶表面的硅羟基与有机硅烷反应得到。其中的SiOSiC 键稳定，是高效液相色谱中性

28、能优良、用途广泛的固定相。它不仅用作正相色谱，也可用于反相色谱的固定相。SiOSiOSiOHOHOHSiOSiOSiOOOSiC18H37+n-C18H37SiCl3+3HCl类型类型官能团官能团性质性质色谱分离色谱分离应用范围应用范围烷基C8，C18 (CH2)7CH3 (CH2)17CH3非极性反相中等极性混合物，水溶性极性化合物。如肽、甾醇、核苷酸等。苯基 (CH2)3C6H5非极性反相非极性至中等极性化合物。如脂肪酸、甾醇、萜类等。酚 (CH2)3C6H4OH弱极性反相中等极性化合物。如稠环、极性芳香化合物。环氧基 (CH2)3OCH2CH2OCH2弱极性反相或正相酚类、硝基化合物等。

29、二醇 (CH2)3OCH2CHOHCH2OH弱极性正相或反相有机酸、肽。硝基苯 (CH2)3C6H4NO2弱极性正相或反相双键化合物、芳香环、稠环化合物。腈基 CN极性正相或反相极性化合物。氨基 (CH2)3NH2极性正相(反相）阴离子交换极性化合物。如糖类、肽类、有机酸等。常见键合液相色谱固定常见键合液相色谱固定相相 非极性烷基键合固定相是目前应用最广泛的柱填料，其中最重要的是十八烷基硅烷（Octadecylsilyl，ODS）。在反相液相色谱分析中，大部分都采用这种填料。 键合相色谱的流动相与液-液色分配色谱相似，在正相键合色谱中，流动相的主体是己烷（庚烷）。在反相键合色谱中，流动相的主体

30、是水。在组分的分离中，选择洗脱剂是至关重要，因为当样品一旦确定了色谱柱，唯一可改变的条件是溶剂的极性。如果化合物的性质相差很大，可以采用梯度洗脱。第四节第四节 其它高效液相色谱方法其它高效液相色谱方法高效液相色谱法可依据溶质（样品）在固定相和流动相分离过程的物理化学原理，除了液/液分配色谱外还有液/固吸附色谱、离子交换色谱、凝胶渗透色谱和亲和色谱。一.液/固吸附色谱液/固液相色谱柱内填充固体吸附剂，利用吸附剂表面活性中心进行吸附，以不同极性溶剂作流动相，依据样品中各组分在吸附剂上吸附性能的差别来实现分离。液/固吸附色谱在分离的原理于薄层色谱有很大相似，因此可以应用将薄层色谱的条件到液/固吸附色

31、谱上。液/固吸附色谱的固定相可分为两类：极性固定相和非极性固定相。极性固定相主要有硅胶、氧化镁、硅酸镁和分子筛等，通常液/固吸附色谱的吸附剂采用全多孔微粒硅胶，由于它们的粒度均匀，孔径均匀，装在510 cm 的短柱上，就可实现对样品的高效、快速分离。非极性固定相有高强度的多孔活性炭，5 10m 多孔石墨化的炭黑以及高交联的苯乙烯-而乙烯苯共聚物的单分散多孔微粒和碳多孔小球。液/固吸附色谱中，流动相的选择与薄层层析相似，如果是用硅胶和氧化铝等极性固定相，应该以非极性的溶剂为主体。如戊烷、己烷、庚烷作为流动相的主体，适当加入CH2Cl2、CHCl3、乙醚、异丙醚、乙酸乙酯等溶剂或者四氢呋喃、乙腈、

32、异丙醇、甲醇、水作为改良剂，调节极性。如果用高交联的苯乙烯-二乙烯苯聚合物和石墨微球等非极性的固定相，则以水、甲醇、乙醇作为流动相的主体，乙腈和四氢呋喃作为改良剂。二.二.离子交换色谱离子交换色谱 离子交换色谱主要用于分析溶液中能离解成正负离子的试样，色谱柱填充离子交换树脂，即用离子交换剂作固定相，以具有一定 pH值的缓冲溶液作流动相，依据离子型化合物中各离子组分与离子交换剂表面带电荷基团进行可逆性离子交换能力的差别而实现分离。其分离的基本原理如下：其中，X = 样品离子，Y = 流动相离子；R = 在交换剂上带离子的部分。在阴离子交换色谱中，样品离子 X- 与流动相的离子Y- 争夺离子交换剂

33、上的 R+ 离子；在阳离子交换色谱中，样品离子 X+ 与流动相的离子 Y+ 争夺离子交换剂上的 R- 离子。因此，在离子交换色谱中实际上有两个因素决定组分的保留值，一是试样离子与流动相离子对离子交换剂上的离子的竞争交换，另外一个是试样中各组分离子彼此之间的竞争。在离子交换色谱中，可以通过改变离子交换剂，也可以改变流动相来改变离子交换的选择性。XR Y YR XXR Y YR X-三.三.凝胶色谱凝胶色谱凝胶色谱也称之为排斥色谱、凝胶渗透色谱和凝胶过滤色谱。它是用化学惰性的多孔性凝胶作固定相，按固定相对样品中各组分分子体积组织作用的差别来实现分离。以水溶液作流动相的体积排阻色谱法，称为凝胶过滤色

34、谱；以有机溶剂作流动相的体积排阻色谱法，称为凝胶渗透色谱法。凝胶色谱应用最广泛的是交联的葡萄糖或琼脂糖、聚丙酰胺以及葡萄糖衍生物。日本 Tosoh 公司开发出多孔亲水性凝胶 TSK-Gel，其骨架是聚乙二醇、异丁烯酸缩水甘油酯和二甲基丙烯酸戊季四醇酯共聚。这种凝胶化学稳定性高，可用有机溶剂洗脱。凝胶色谱应用最广的是高分子化合物的分级、测定高分子的分子量分布，如多糖、蛋白质。四四. 亲和色谱亲和色谱亲和色谱是根据流动相中的生物大分子与固定相表面偶联的特异性配基发生亲和作用，有选择性吸附溶液中的溶质而进行的分离方法。其原理是将一对能可逆结合和解离生物分子的一方作为配基（也称配体），与具有大孔径、亲

35、水性的固定相载体相偶联，制成专一的亲和吸附剂。当被分离物质随着流动相经过亲和吸附剂时，亲和吸附剂上的配基就有选择地吸附待分离物质，通过解吸附使待分离物质得以纯化。在自然界生物体中有很多生物大分子与相应的分子间具有专一的可逆结合的特性，如酶与其底物、抑制剂、辅助因子；抗体与抗原；核酸与互补的碱基序列、核酸聚合酶、结合蛋白；激素与其受体、载体蛋白；细胞与其表面特异蛋白它们依靠分子间的氢键、范德华力进行结合，这种专一的可逆结合力称为亲和力。亲和色谱的方法就是根据具有亲和力的生物分子间可逆地结合和解离的原理建立和发展起来的。亲和色谱由于是根据分子和配体的特异性结合进行分离的。一般来说，得到的被分离物质

36、都比较纯，在科研及工业化生产中已广泛应用。第五节第五节 建立高效液相色谱分析方法的一般步骤建立高效液相色谱分析方法的一般步骤一.一.高效液相色谱分析方法的确立高效液相色谱分析方法的确立1.了解样品信息了解样品信息样品的来源，样品中的化学成分或可能的化学成分样品的适合溶剂和溶解度样品中的化合物的分子量、结构或官能团化合物的酸碱性 pH 值和pKa值样品中各成分的含量范围化合物的紫外光谱2. 明确分析目的、任务明确分析目的、任务主成分的定性、定量杂质分析指标性成分的定性、定量合成聚合物的分子量及其分布指纹图谱测定3.样品的制备样品的制备样品过量或杂质过量都会引起柱超载使色谱部分分析失败，因此样品往

37、往需要经过预处理，除去干扰物，使目标成分成为样品混合物中主要成分，使含量较低的目标成分得到富集。4.HPLC方法的确立方法的确立了解了样品信息之后，根据样品的溶解度分析样品的极性，从而决定高效液相色谱类型。极性化合物通常选用吸附色谱法或正相分配色谱法、正相键合相色谱法进行分析；非极性化合物可选用反相分配色谱法或反相键合相色谱法进行分析。水溶性化合物可首先检查水溶液的 pH 值，若呈中性为非离子型化合物，常可用反相（或正相）键合相色谱法进行分析；若 pH 值呈，可采用抑制样品电离的方法，在流动相中加入硫酸、磷酸调节 pH = 23，再用进行分析；若 pH 值呈，可向流动相中加入阳离子型反离子，再

38、用进行分析；若 pH 值呈，可用进行分析。二.二.色谱柱操作参数的选择色谱柱操作参数的选择色谱柱的操作参数指柱长、柱内径、柱内填充固定相的粒度、柱压力降和用理论塔板数 n 表示的柱效。对分析型色谱柱，选择操作参数的一般原则是：色谱柱长 L 10 25 cm柱内径 4 6 mm 固定相的粒度 dp 5 10 m柱压力降 P 5 14 Mpa理论塔板数 n (2 5)103 (2 10)104 块/米三.三.分离条件的选择分离条件的选择1.保留值的选择通常一个简单样品的分析时间控制在 10 30 min。含多个化合物的复杂样品的分析，时间控制在 60 min内。若使用恒定组成流动相洗脱，与组分保留

39、时间对应的容量因子应保持在1 10 之间。对样品组成复杂、由具有宽范围组分构成的混合物，仅用恒定组成流动相洗脱，无法在希望的分析时间内使所有组分都洗脱出来，此时需要用梯度洗脱技术，才能使样品中每个组分在最佳状态下洗脱出来。当使用梯度洗脱时通常能将组分的保留值减小到原来的 1/10 1/100，从而缩短了分析时间。2.相邻组分的选择性系数和分离度的选择 在色谱分析中通常规定，当色谱图中两个相邻色谱峰达到基线分离时，其分离度 R = 1.5。若分离度 R = 1.0，表明两个相邻组分只分开 94%，可作为满足多组分优化分离的最低指标。 当选定一种高效液相色谱法时，通常很难将各组分的分离度都调至最佳

40、，而只能使少数几对难分离物质对的分离度至少保持 R = 1.0。若 R = 1.0，仅呈半峰分离，则应通过改变流动相组成或改变流动相流速来调节分离度。当色谱图中出现相邻组分的重叠谱峰时，不宜进行定量分析。 在进行未知样品分析时，经常遇到另一个问题，即样品中的所有组分是否都从柱中洗脱出来，是否还有强保留组分被色谱柱的固定相吸留。解决这样的问题通常是对同一种样品可采用两种不同的高效液相色谱法进行分析，相互补充分析。3.流动相的选择在高效液相色谱中应用最多的是反相色谱法，下面以反相色谱流动相为例来说明流动相的选择及对色谱分离效果的影响。(1)流动相的极性 在反相色谱中，常用的柱填料为非极性的键合相硅

41、胶 C18，流动相是极性溶剂，如水、甲醇、异丙醇、乙腈、异丙醇、氯仿和四氢呋喃等。大多数实验常用混合溶剂，如甲醇/水、乙腈/水、四氢呋喃/水，它们的紫外吸收和黏度特性都比较适宜。(2)溶剂类型对分离度的影响 溶剂类型对分离度有重要影响，改变溶剂类型往往可以显著改变色谱的选择性。在选择溶剂类型时，多用极性大小相当的不同种混合溶剂来进行实验，选择分离度较大的溶剂。(3) 溶剂百分比对分离度的影响 在选定了有机溶剂类型后，还要选择溶剂的配比，溶剂的配比决定了溶解的强度，必然会影响分离度。在实验中选择最佳冲洗条件的经验规则是：非（弱）极性化合物试用 70% 90% 甲醇水溶液；对于中等极性化合物试用

42、50% 70% 甲醇水溶液；对于强极性化合物可用 30% 40% 甲醇水溶液。随着溶剂中水随着溶剂中水的含量的增大，的含量的增大，分离效果改进。分离效果改进。从分离效果和从分离效果和分离时间综合分离时间综合评判，甲醇评判，甲醇/水为水为 45/55 时时最好。最好。甲醇甲醇/ /水水=70:30=70:30甲醇甲醇/ /水水=30:70=30:70甲醇甲醇/ /水水=45:55=45:55溶剂的极性可由溶解度参数（ T2 ）来表示。一般来说， T 越大，溶剂极性越强。其中，d 是扩散溶解度参数； o 时偶极取向溶解度参数； in 偶极诱导溶解度参数； a 和 b 为酸碱溶解度参数(也叫氢键溶解

43、度参数)，它们分别与化合物的酸碱强度有关。流动相的洗脱强度是受总溶解度参数T 控制的，但是其选择性是受d、 o、 in 、a 和 b 控制的。 d 是衡量流动相与溶质、固定相色散力作用大小的尺度； o 是衡量流动相偶极作用能力大小的尺度； a 和 b 是衡量流动相酸碱性大小的尺度。因此，选择一种适当 T 的流动相（或混合流动相）后，将样品的容量因子值，调整到最佳范围（一般 10 k 1），然后再通过d、 o、 in 、a 和 b，来选择不同的流动相，以改变流动相的选择性。badin2o2d2T2 2 式中ki 为溶质i 的容量因子；Vi 表示溶质i 的摩尔体积； m、 s 和 i 分别是流动相、固定相和溶质的溶解度参数；ns 和nm 分别表示溶质i 在固定相和流动相中的摩尔数。上式表明可以通过两种途径减小 k 值，一是选择等极性的流动相和固定相（m = s），显然这是难以做