医学免疫学实验：NK细胞毒活性

1、免疫学实验免疫学实验1NKNK细胞毒检测细胞毒检测免疫学实验免疫学实验2v实验分组及材料实验分组及材料v实验原理实验原理v检测方法检测方法v主要操作步骤主要操作步骤v结果判定结果判定 主主 要要 内内 容容免疫学实验免疫学实验3v器材器材1.75%酒精酒精 若干若干2.无菌纱网无菌纱网 1块块/组组3.无菌平皿无菌平皿 1块块/组组4.无菌吸头（大、中、小）无菌吸头（大、中、小）3盒盒/room5.无菌无菌96孔培养板孔培养板 1块块/组组6.可调微量加样器可调微量加样器 1套套/组组7.细胞计数板细胞计数板 1套套/组组8.显微镜显微镜 1台台/组组9.EP管管 若干若干10. 眼科剪、小镊

2、子眼科剪、小镊子 1套套/ 组组11. 细胞培养箱细胞培养箱 1台台/room12. 酶标仪酶标仪 1台台13. 离心机离心机 2个个/room14. 超净台超净台 1台台/组组v动物、细胞及试剂动物、细胞及试剂1.小鼠小鼠 1只只/组组(NS,OVA)2.YAC-1 1*106 * 2ml 3.培养液（培养液（DMEM) 无无FCS 4ml/ 组组4.培养液培养液(DMEM)10%FCS 10ml/组组3.LDH底物底物 3ml/组组4.柠檬酸（终止液）柠檬酸（终止液） 1ml/组组实验分组及材料实验分组及材料免疫学实验免疫学实验4 NK（natural killer ）细胞属非特异性免疫细

3、胞，）细胞属非特异性免疫细胞，为机体的天然免疫系统中主要的效应细胞，是与为机体的天然免疫系统中主要的效应细胞，是与T、B细细胞并列的第三类群淋巴细胞。胞并列的第三类群淋巴细胞。 NK细胞可非特异直接杀伤靶细胞，这种天然杀伤活性细胞可非特异直接杀伤靶细胞，这种天然杀伤活性既不需要预先由抗原致敏，也不需要抗体参与，且无既不需要预先由抗原致敏，也不需要抗体参与，且无MHC限制。限制。YAC-1细胞为细胞为Moloney鼠科白血病毒鼠科白血病毒(Mo-MuLV)感染的鼠感染的鼠T淋巴瘤细胞，对淋巴瘤细胞，对NK细胞敏感，可用于检测细胞敏感，可用于检测NK细胞的杀伤活性。细胞的杀伤活性。 原原 理理免疫

4、学实验免疫学实验5v密度梯度离心密度梯度离心vFicoll 密度梯度离心密度梯度离心vPercoll密度梯度离心密度梯度离心v磁化细胞分离器分离法磁化细胞分离器分离法 NKNK细胞分离方法细胞分离方法免疫学实验免疫学实验6v同位素释放法：同位素释放法：51Cr、3H-TdR、125I-UdR v乳酸脱氢酶释放法乳酸脱氢酶释放法 (本次实验采用本次实验采用) 常用的检测方法常用的检测方法免疫学实验免疫学实验7Na251CrO4、 3H-TdR、125I-UdR 均值均值自然释放孔最大释放孔均值均值自然释放孔试验孔cpmcpmcpmcpmSI 同位素释放法同位素释放法免疫学实验免疫学实验8v应用放

5、射性同位素（应用放射性同位素（ 如如51Cr）标记靶细胞，当靶）标记靶细胞，当靶细胞受到细胞受到NK细胞攻击，靶细胞被破坏，释放出细胞攻击，靶细胞被破坏，释放出51Cr。51Cr辐射辐射射线，通过测定受损伤或死亡射线，通过测定受损伤或死亡靶细胞释放到上清中靶细胞释放到上清中51Cr的放射脉冲数的放射脉冲数(cpm)，即可计算出即可计算出NK细胞毒活性。细胞毒活性。同位素释放法同位素释放法免疫学实验免疫学实验9乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶(LDH)存在于细胞内，正常情况下，存在于细胞内，正常情况下，不能透过细胞膜。当细胞受到损伤时，不能透过细胞膜。当细胞受到损伤时，LDH可从细胞内可从细胞内释放至培养液

6、中。释放出来的释放至培养液中。释放出来的LDH在催化乳酸生成丙酮在催化乳酸生成丙酮酸的过程中，使氧化型辅酶酸的过程中，使氧化型辅酶I(NAD+)变成还原型辅酶变成还原型辅酶(NADH)，后者再通过递氢体，后者再通过递氢体-吩嗪二甲酯硫酸盐吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)还还原碘硝基氯化氮唑蓝原碘硝基氯化氮唑蓝(INT)或硝基氯化四氮唑蓝或硝基氯化四氮唑蓝(NBT)形形成有色的甲基化合物，在成有色的甲基化合物，在570nm波长处有一吸收峰，利波长处有一吸收峰，利用读取的值，可测得杀伤细胞毒活性。用读取的值，可测得杀伤细胞毒活性。 乳酸脱氢酶释放法乳酸脱氢酶释放法- -原理原理免疫学实验免疫学实验10

7、乳酸脱氢酶释放法乳酸脱氢酶释放法最大释放均值（最大释放均值（Max）=最大释放孔最大释放孔cpm均值均值-最大释放对照孔最大释放对照孔cpm均值均值自发释放均值（自发释放均值（S自发自发）=自发释放孔自发释放孔cpm均值均值-培养基对照孔培养基对照孔cpm均值均值 杀伤率杀伤率( %)=Max- S自发自发实验值实验值-自发释放值自发释放值 100免疫学实验免疫学实验11操作流程操作流程 1W无菌取脾无菌取脾研磨成单细胞悬液研磨成单细胞悬液+2ml 1640（无（无FBS)细胞计数细胞计数 【?/ml】取取20ul细胞细胞+980ul的的1640混匀后取出混匀后取出20ul细胞细胞+20ul台

8、盼蓝台盼蓝加板加板(三复孔三复孔)(加法见附图加法见附图)调细胞浓度调细胞浓度1107 /ml5%CO2 37培养培养2小时小时离心，取离心，取100ul上清移入新上清移入新孔，孔， 37孵育孵育10min加入底物加入底物 100ul/well 室温避光孵育室温避光孵育15min 30 l /孔孔 1mol/L柠檬酸柠檬酸 酶标仪测吸光度值：酶标仪测吸光度值：OD570nm结果判定：结果判定：培养培养YAC1细胞细胞10%FBS1640培养液培养液调细胞浓度调细胞浓度1106/ml免疫学实验免疫学实验12v单细胞悬液的制备单细胞悬液的制备1.小鼠脱臼处死，用酒精棉球擦试皮毛消毒。小鼠脱臼处死，

9、用酒精棉球擦试皮毛消毒。2.于超净台内取出脾组织，放入预先盛有于超净台内取出脾组织，放入预先盛有2ml 1640培养液的平皿内。培养液的平皿内。3.用纱网将脾组织包裹住，用直头镊子固定组织，用弯头镊子轻压组织，将用纱网将脾组织包裹住，用直头镊子固定组织，用弯头镊子轻压组织，将其捣碎。然后用其捣碎。然后用1000ul加样器隔着纱网将细胞悬液吸出，放入加样器隔着纱网将细胞悬液吸出，放入50ml 离心管离心管中，中，用剩余用剩余2ml2ml培养液冲洗，将细胞悬液吸出，也放入同一培养液冲洗，将细胞悬液吸出，也放入同一50ml50ml离心管中。离心管中。4.1000rpm，常温离心，常温离心10分钟，弃

10、上清，加分钟，弃上清，加1ml 1640培养液重悬细胞。培养液重悬细胞。v细胞计数：细胞计数：1.取上述制备好的细胞悬液混匀后取出取上述制备好的细胞悬液混匀后取出20ul，加到盛有加到盛有980ul计数液的计数液的EP管中，管中，混匀后取出混匀后取出20ul到一个新的到一个新的EP管中，再向其中加入管中，再向其中加入20ul台盼蓝染料，混匀台盼蓝染料，混匀后取后取20ul计入到细胞计数版上，在显微镜下计数，计数方法见后。计入到细胞计数版上，在显微镜下计数，计数方法见后。2.调脾细胞浓度至调脾细胞浓度至1107/ml，每组所需总量为每组所需总量为1ml3.调调YAC1细胞浓度至细胞浓度至1105

11、/ml，每组需，每组需2ml注意注意:在稀释前一定将原细胞悬液混匀，否则细胞长时间沉淀使细胞数不准。在稀释前一定将原细胞悬液混匀，否则细胞长时间沉淀使细胞数不准。实验步骤实验步骤 免疫学实验免疫学实验13v细胞培养：细胞培养：1.按图所示加板。按图所示加板。2.将板做好标记，在倒置显微镜下观察细胞，然后放于将板做好标记，在倒置显微镜下观察细胞，然后放于37 5%CO2培养箱培养箱中，培养中，培养2小时。小时。vLDH底物：底物：1.在培养在培养2小后，小后，1000rpm，离心，离心5min，取，取100ul上清液移入新孔内，于每上清液移入新孔内，于每孔内加入孔内加入LDH底物底物 100ul

12、，加完后轻轻搕板，使之混匀。，加完后轻轻搕板，使之混匀。2.室温避光保存室温避光保存15min。 3.取出，加入取出，加入1mol/L柠檬酸，柠檬酸， 30 l /孔。孔。酶标仪读数前保证没有气泡。酶标仪读数前保证没有气泡。v结果测定：结果测定：1.结果测量：用酶标仪测定光密度值：结果测量：用酶标仪测定光密度值：OD570nm。记录结果。记录结果。2.结果判定：结果判定：vMax （ 靶细胞最大释放）靶细胞最大释放）=最大释放孔均值最大释放孔均值-最大释放对照孔均值最大释放对照孔均值vS自发自发 （靶细胞自发释放）（靶细胞自发释放） =自发释放孔均值自发释放孔均值-培养基对照孔均值培养基对照孔

13、均值v注：注： S自发自发 0，做，做“0”处理处理 实实 验验 步步 骤骤 SI=Max- S自发自发实验孔值实验孔值-自然释放孔值自然释放孔值100%免疫学实验免疫学实验141-34-67-910-12A自然释放孔自然释放孔100ul YAC-1 cells+100ul 10% 1640B(E:T=100:1） 100ul YAC-1 cells+ 100ul spleen CellsC(E:T=50:1）100ul YAC-1 cells+ 50ul spleen Cells +50ul 10%1640D(E:T=25:1）100ul YAC-1 cells+ 25ul spleen Cells +75ul 10%1640E最大释放孔最大释放孔100ul YAC-1 cells+100ul 1% NP-40F最大释放对照孔最大释放对照孔100ul 1% NP-40 + 100ul 10% 1640G培养基对照孔培养基对照孔200ul 10% 1640Max=E-F S自发自发=A-G 加加 板板 方方 法法Max- S自发自发 B,C,D A 实验孔值实验孔值-自然释放孔值自然释放孔值100%SI=免疫学实验免疫学实验15 结结 果果 处处 理理l