王镜岩-生物化学I-第9章酶促反应动力学—第10章酶的作用机制和酶的调节

1、 化学反应的两个基本问题： 反应进行的方向、可能性和限度 反应进行的速率和反应机制一、化学动力学基础一、化学动力学基础化学热力学化学热力学化学动力学化学动力学（一）反应速率及其测定 以单位时间内反应物或生成物 浓度的改变来表示。（二）反应分子数和反应级数（二）反应分子数和反应级数1.反应分子数：反应分子数：反应中真正相互作用的分子的数目反应中真正相互作用的分子的数目 单分子反应：单分子反应：A P 双分子反应：双分子反应：A+B P+Q 单分子反应 v = kc 双分子反应 v = kc1c2 c 、c1、c2 ：反应物浓度（mol/l） k：比例常数/反应速率常数2.反应级数 能以v = k

2、c表示，为一级反应； 能以v = kc1c2表示，则为二级反应； v 与反应物浓度无关，则为零级反应。双分子反应、一级反应双分子反应、一级反应（三）各级反应的特征 1.一级反应： 反应速率与反应物浓度的一次方成正比。反应速率与反应物浓度的一次方成正比。 v = kc C0C0/20tPCt反应物的消耗反应物的消耗产物的增加产物的增加半衰期半衰期t1/2：有一半反应物转化为产物所需的时间有一半反应物转化为产物所需的时间lnC0lnC0/20tCtk当当t=t时时，c c= =1/2c c0 0, ,则则t0.693k,即半衰期与反应即半衰期与反应物的初浓度无关。物的初浓度无关。2.二级反应： v

3、 = k（a- x）（b x） a 、b：反应物A、B的初浓度 x：t时已发生反应的物质浓度 （a- x）、（b x）： t时后A、B的浓度3.零级反应零级反应： v = k一级反应：半衰期与反应物的初浓度无关一级反应：半衰期与反应物的初浓度无关二级反应：半衰期与反应物的初浓度成反比二级反应：半衰期与反应物的初浓度成反比零级反应：半衰期与反应物的初浓度成正比零级反应：半衰期与反应物的初浓度成正比 单底物、单产物反应；单底物、单产物反应； 酶促反应速度一般在规定的反应条件下，酶促反应速度一般在规定的反应条件下，用单位时间内底物的消耗量和产物的生用单位时间内底物的消耗量和产物的生成量来表示；成量来

4、表示； 反应速度取其初速度，即底物的消耗量反应速度取其初速度，即底物的消耗量很小（一般在很小（一般在5 5以内）时的反应速度；以内）时的反应速度； 底物浓度远远大于酶浓度。底物浓度远远大于酶浓度。（S E）二、底物浓度对酶反应速率的影响二、底物浓度对酶反应速率的影响初速度初速度 酶促反应速度逐渐降低酶促反应速度逐渐降低 酶促反应的时间进展曲线酶促反应的时间进展曲线v 在其他因素不变的情况下，底物浓度对反应速在其他因素不变的情况下，底物浓度对反应速度的影响呈度的影响呈矩形双曲线关系。矩形双曲线关系。当底物浓度较低时当底物浓度较低时反应速度与底物浓度成正比；反反应速度与底物浓度成正比；反应为一级反

5、应。应为一级反应。随着底物浓度的增高随着底物浓度的增高反应速度不再成正比例加速；反应反应速度不再成正比例加速；反应为混合级反应。为混合级反应。当底物浓度高达一定程度当底物浓度高达一定程度反应速度不再增加，达最大速度；反应速度不再增加，达最大速度；反应为零级反应反应为零级反应E + S ES P + E（一）中间络合物学说（一）中间络合物学说 k4三个假设：三个假设：（1）E与与S形成形成ES复合物的反应是快速平衡反应，而复合物的反应是快速平衡反应，而 ES分解为分解为E及及P的反应为慢反应，反应速度取决于的反应为慢反应，反应速度取决于慢反应即慢反应即 Vk3ES。（2）S的总浓度远远大于的总浓

6、度远远大于E的总浓度，因此在反应的初的总浓度，因此在反应的初始阶段，始阶段，S的浓度可认为不变即的浓度可认为不变即SSt。 （3）P0 忽略忽略 这步反应这步反应 ESE + Pk4E + S ESE + P（二）酶促反应的动力学方程式（二）酶促反应的动力学方程式1、米氏方程的推导、米氏方程的推导v1913年年Michaelis和和Menten提出反应速度与底提出反应速度与底物浓度关系的数学方程式，即米曼氏方程物浓度关系的数学方程式，即米曼氏方程式，简称米氏方程式，简称米氏方程(Michaelis equation)。S：底物浓度：底物浓度V：不同：不同S时的反应速度时的反应速度Vmax：最大

7、反应速度：最大反应速度(maximum velocity) m：米氏常数：米氏常数(Michaelis constant) VmaxS Km + S 稳态时稳态时ES浓度不变浓度不变 反应速度反应速度 V=k3ES ES的生成速度的生成速度=消耗速度消耗速度 k1ES=k2ES + k3ES E的质量平衡方程的质量平衡方程 E=Et - ESE + S ES P + E()()()稳态时ES浓度不变反应速度 V=k3ES ES的生成速度=消耗速度 k1ES=k2ES + k3ESE的质量平衡方程 E=Et - ESE + S ES P + EV= V VSKm + S V V=Vmax=k3E

8、Smax=k3EtKm= k2 + k3 k1 a.当S很小时V=V VS/Km 反应V= V VSKm + Sb.当S很大时V=V VS/S=V V 0 级反应混合混合级级Km=?Km = SV= V VSKm + S若若 VV/2V2V SKm + S1Km + S = 2S2 2、动力学参数的意义、动力学参数的意义（1）米氏常数）米氏常数Km的意义的意义KmS Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位是时的底物浓度，单位是mol/L。2Km + S Vmax VmaxS Km是酶的特性常数： 与pH 、温度、离子强度、酶及底物种类有关

9、，与酶浓度无关，可以鉴定酶。可以判断酶的专一性和天然底物可以判断酶的专一性和天然底物Km值最小的底物值最小的底物最适底物最适底物/天然底物天然底物1/Km近似表示酶对底物的亲和力：近似表示酶对底物的亲和力：1/Km越越大大、亲和力越、亲和力越大大Km= k2 + k3 k1Kmk2（分离能力）/k1（亲合能力）E + S ES P + EKm越越小小，亲和力越，亲和力越强。强。SS很小时，反应速度就能达到很大。很小时，反应速度就能达到很大。性能优，代谢中这类酶更为重要性能优，代谢中这类酶更为重要k2k3时时 Km可帮助判断某代谢反应的方向和途径可帮助判断某代谢反应的方向和途径催化可逆反应的酶对

10、正催化可逆反应的酶对正/逆两向底物逆两向底物Km不同不同 Km较小者为主要底物较小者为主要底物根据根据Km：判断某判断某s时时v与与Vmax的关系的关系判断抑制剂的类型判断抑制剂的类型乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶（1.710-5）丙酮酸脱氢酶丙酮酸脱氢酶（1.310-3）丙酮酸脱羧酶丙酮酸脱羧酶（1.010-3）丙酮酸丙酮酸乳酸乳酸乙酰乙酰CoA乙醛乙醛丙酮酸浓度较低时：丙酮酸浓度较低时：代谢哪条途径决定于代谢哪条途径决定于Km最小的酶最小的酶一底物多酶反应一底物多酶反应（2）Vmax和和k3（kcat)的意义的意义一定酶浓度下，酶对特定底物的一定酶浓度下，酶对特定底物的Vmax也是一也是一个常数。个

11、常数。S很大时，很大时， Vmax k3E 。k3表示当酶被底物饱和时，每秒钟每个酶分子表示当酶被底物饱和时，每秒钟每个酶分子转换底物的分子数，转换底物的分子数，又称为转换数、催化常数又称为转换数、催化常数kcat kcat越大，酶的催化效率越高越大，酶的催化效率越高（3） kcat/km的意义：的意义：V= V VmaxSKm + SVmax=kcatEt V=kcatEtSKm + S当S Km时，EEt是是E和和S反应形成产物的表观二级速率常数。反应形成产物的表观二级速率常数。 其大小可用于比较酶的催化效率。其大小可用于比较酶的催化效率。kcat/km k3k1k2+k3 kcat/km

12、的上限为的上限为k1,即生成即生成ES的速率，即酶的速率，即酶的催化效率不超过的催化效率不超过E和和S形成形成ES的结合速率的结合速率kcat/kmkcat/km的大小可以比较不同酶或同一种酶的大小可以比较不同酶或同一种酶催化不同底物的催化效率。催化不同底物的催化效率。（1）Lineweaver-Burk双倒数作图法双倒数作图法3 3、 KmKm与与V V的求取的求取蔗糖酶米氏常数（蔗糖酶米氏常数（Km）的测定）的测定1. 配12支蔗糖底物溶液，浓度分别为0、0.005、0.00625、0.0075、0.00875、0.010、0.0125、0.015、0.02、0.025、0.0375、0.

13、050M，在35水浴保温；2. 加入3U/ml已在35 水浴保温的酶溶液，准确作用5分钟，终止反应；3. 各吸取0.5ml反应液与3，5-二硝基水杨酸，沸水浴5分钟，冷却后在540nm测定吸光度OD值；4. 作图 （2）Eadie-Hofstee作图法作图法v=Vmax-KmvS v VSVmax斜率斜率Km （3）Hanes-Woolf作图法作图法 Sv =SVmax +KmVmax 斜率斜率= 1/Vm-KmVmax=v+vS Km vVmaxS3Km2KmKm（4）Eisenthal和和Cornish-Bowden线性作图法线性作图法（三）多底物的酶促反应动力学（三）多底物的酶促反应动力

14、学 分为单底物、双底物和三底物反应分为单底物、双底物和三底物反应1.酶促反应按底物分子数分类：酶促反应按底物分子数分类：有序反应（有序反应（ordered reactions）领先底物领先底物释放释放释放释放A和和Q竞争地与自由酶结合竞争地与自由酶结合（1 1）序列反应或单置换反应）序列反应或单置换反应2.多底物反应按动力学机制分类：多底物反应按动力学机制分类：随机反应（随机反应（random reactions）如肌酸激酶使肌酸磷酸化的反应如肌酸激酶使肌酸磷酸化的反应 A AE PE P E E Q EQ EB B A和和Q竞争自由酶竞争自由酶E形式形式 B和和P竞争修饰酶形式竞争修饰酶形式

15、E A和和Q不同不同E结合结合 B和和P也不与也不与E结合。结合。(2)乒乓反应或双置换反应乒乓反应或双置换反应3.3.双底物反应的动力学方程双底物反应的动力学方程（1）序列机制的底物动力学方程及动力学图 在在B的浓度达到饱和时的浓度达到饱和时A的米氏常数的米氏常数 在在A的浓度达到饱和时的浓度达到饱和时B的米氏常数的米氏常数 底物底物A与酶结合的解离常数与酶结合的解离常数 底物底物A、B都达到饱和时最大反应速率都达到饱和时最大反应速率（2）乒乓机制的底物动力学方程及动力学图 在在B的浓度达到饱和时的浓度达到饱和时A的米氏常数的米氏常数 在在A的浓度达到饱和时的浓度达到饱和时B的米氏常数的米氏

16、常数 底物底物A、B都达到饱和时最大反应速率都达到饱和时最大反应速率 三、酶的抑制作用三、酶的抑制作用w失活作用失活作用：使酶：使酶Pr变性而引起酶活力丧失。变性而引起酶活力丧失。w抑制作用抑制作用：使酶活力下降但不引起变性。：使酶活力下降但不引起变性。w抑制剂抑制剂：能引起抑制作用的物质。：能引起抑制作用的物质。（一）抑制程度的表示方法V0 ：Vi ：不加入抑制剂时的反应速率不加入抑制剂时的反应速率加入抑制剂后的反应速率加入抑制剂后的反应速率以反应速率的变化表示以反应速率的变化表示1.1.相对活力分数（残余活力分数）相对活力分数（残余活力分数）a =v iv 0 a%=viv0 100 2.

17、相对活力百分数（残余活力百分数）相对活力百分数（残余活力百分数） V0 Vi Vi V03.3.抑制分数抑制分数指被抑制而失去活力的分数指被抑制而失去活力的分数i=1a=1viv0 V0 Vi 4.抑制百分数抑制百分数i=(1a) 100 =（1viv0 ）100 Vi V0 抑抑制制率率 依据依据： 能否用透析、超滤等物理方法能否用透析、超滤等物理方法 除去抑制剂，使酶复活除去抑制剂，使酶复活。不可逆抑制不可逆抑制与与可逆抑制可逆抑制（二）抑制作用的分类（二）抑制作用的分类1 1、不可逆抑制作用、不可逆抑制作用 ： 抑制剂与酶必需基团以牢固的共价键相连抑制剂与酶必需基团以牢固的共价键相连 很

18、多为剧毒物质很多为剧毒物质 重金属、有机磷、有机汞、有机砷、重金属、有机磷、有机汞、有机砷、 氰化物、青霉素、毒鼠强等。氰化物、青霉素、毒鼠强等。不可逆抑制不可逆抑制不可逆抑制剂 非专一性非专一性不可逆抑制剂不可逆抑制剂（作用于一（作用于一/几类基团）几类基团） 专一性专一性不可逆抑制剂不可逆抑制剂（作用于某一种酶的（作用于某一种酶的 活性部位基团）活性部位基团）2、不可逆抑制剂、不可逆抑制剂不可逆抑制不可逆抑制 （1） 非专一性不可逆抑制剂非专一性不可逆抑制剂 重金属离子重金属离子 Ag+ 、 Cu2+ 、 Hg2+ 、 Pb2+ 、 Fe3+ 高浓度时可使酶蛋白变性失活；高浓度时可使酶蛋白

19、变性失活； 低浓度时对酶活性产生抑制。低浓度时对酶活性产生抑制。 通过加入通过加入EDTA解除解除 H2N-CH-COOH CH2 SH H2N-CH-COOH CH2 S-CH2COOHICH2COOHHI烷化剂烷化剂（多为卤素化合物）（多为卤素化合物）+碘乙酸碘乙酸有机磷化合物（敌百虫、沙林）有机磷化合物（敌百虫、沙林）胆碱胆碱酯酶酯酶OHPOC2H5OC2H5S有机磷农药部分+(CH3)3N+CH2CH2OCOCH3(CH3)3N+CH2CH2OH +CH3COOHH2O胆碱乙酰化酶胆碱乙酰化酶胆碱酯酶胆碱酯酶胆碱胆碱乙酰胆碱乙酰胆碱积累导致神经中毒症状积累导致神经中毒症状如何紧急救治？

20、如何紧急救治？排毒排毒 洗胃、喝鸡蛋清牛奶洗胃、喝鸡蛋清牛奶 导泄、利尿导泄、利尿 血液透析（清除游离状态毒物）血液透析（清除游离状态毒物） 解毒药：解磷定解毒药：解磷定NCH3CHNOHRO O RO ORO X RO OE P + EOH P + HX有机磷化合物有机磷化合物 羟基酶羟基酶 磷酰化酶磷酰化酶( (失活失活) ) 酸酸RO ORO OE P + -CHNOH磷酰化酶磷酰化酶( (失活失活) )NN+ +CH3 -CHNNN+ +CH3O ORO OR +EOH P解磷定解磷定解毒解毒 - - - - - - 解磷定解磷定(PAM)(PAM)：有机汞、有机砷化合物有机汞、有机砷

21、化合物与酶分子中-SH作用； 可通过加入过量巯基化合物解除。氰化物、硫化物和氰化物、硫化物和COCO 与酶中金属离子形成稳定的络合物与酶中金属离子形成稳定的络合物 如氰化物与含铁卟啉细胞色素氧化酶结合如氰化物与含铁卟啉细胞色素氧化酶结合青霉素（青霉素（penicillinpenicillin） 与细菌糖肽转肽酶与细菌糖肽转肽酶Ser-OHSer-OH活性，活性， 影响细胞壁合成。影响细胞壁合成。（2 2） 专一性不可逆抑制剂专一性不可逆抑制剂 KsKs型型 具有底物类似的结构具有底物类似的结构（设计）（设计） 带有一活泼基团：与必需基团反应（抑制）带有一活泼基团：与必需基团反应（抑制） 利用对

22、酶亲合性进行修饰利用对酶亲合性进行修饰 亲合标记试剂（亲合标记试剂（affinity labeling reagentaffinity labeling reagent）Kcat型型具有底物类似的结构具有底物类似的结构本身是酶的底物本身是酶的底物还有一潜伏的反应基团还有一潜伏的反应基团“自杀性底物自杀性底物” 抑制作用可通过透析等方法除去。 原因：非共价键结合可逆抑制可逆抑制竞争性抑制竞争性抑制(competitive inhibition)非竞争性抑制非竞争性抑制(non-competitive I.）反竞争性抑制反竞争性抑制(uncompetitive I.) 3 3、可逆抑制作用：、可逆

23、抑制作用：（1）竞争性（）竞争性（Competitive)抑制抑制 抑制剂（抑制剂（ inhibitor）【举例】【举例】G 丙二酸丙二酸与琥珀酸竞争琥珀酸脱氢酶与琥珀酸竞争琥珀酸脱氢酶COOH CH2 CH2COOH COOH COOH CH2 丙二酸丙二酸琥珀酸琥珀酸琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶FADFADH2延胡索酸延胡索酸琥珀酸琥珀酸竞争性抑制竞争性抑制G 磺胺类药物的抑菌机制：磺胺类药物的抑菌机制：与与对氨基苯甲酸对氨基苯甲酸竞争竞争二氢叶酸合成酶二氢叶酸合成酶二氢蝶呤啶二氢蝶呤啶 对氨基苯甲酸对氨基苯甲酸 谷氨酸谷氨酸二氢叶酸二氢叶酸合成酶合成酶二氢叶酸二氢叶酸COOH H2N SO2

24、NHR H2N 磺磺 胺胺 类类 药药 物物利用竞争性抑制是药物设计主要思路利用竞争性抑制是药物设计主要思路磺胺类药磺胺类药抗菌机理：抗菌机理： （与对氨基苯甲酸（与对氨基苯甲酸是结构类似物）是结构类似物）竞争性抑制细菌叶酸形成，抑制细菌繁殖竞争性抑制细菌叶酸形成，抑制细菌繁殖人通过食物直接补充叶酸，对人无毒害。人通过食物直接补充叶酸，对人无毒害。生物碱麻醉生物碱麻醉竞争性替代竞争性替代 生物碱吗啡、海洛因、可卡因、尼古丁 吗啡吗啡 海洛因海洛因麻醉机理源自源自37C37C医学网医学网痛觉神痛觉神经信号经信号阿片阿片鸦片类物质鸦片类物质生物碱竞争性替代脑生物碱竞争性替代脑肽肽麻醉致幻麻醉致幻脑

25、肽脑肽(E)(E)控制痛控制痛觉信号的释放觉信号的释放抑制物抑制物（2）非竞性（）非竞性（Non-competitive)抑制抑制无法形成产物wNoncompetitive inhibition（3）反竞争性（）反竞争性（Uncompetitive ）抑制）抑制1：反应体系不加：反应体系不加I2： 体系中加入体系中加入一定量不可逆抑制剂一定量不可逆抑制剂3：体系中加入：体系中加入一定量可逆抑制剂一定量可逆抑制剂v123E(三三)可逆和不可逆抑制作用的鉴别可逆和不可逆抑制作用的鉴别Ev不可逆抑制剂不可逆抑制剂的作用的作用Ev可逆抑制剂可逆抑制剂 的作用的作用I I ( (四）可逆四）可逆抑制作用

26、抑制作用动力学动力学1.1.竞争性抑制竞争性抑制消去消去ES斜率斜率斜率斜率竞争性：I与S与酶活性中心结合机会均等V下降发生抑制Km增大增大亲和力亲和力Vmax不变不变S 增大，增大，I结合机率减小结合机率减小Km 变大，变大，Vmax不变不变2.2.非竞争性抑制非竞争性抑制截距截距V下降发生抑制Km不变亲和力不受影响Vmax减小部分酶始终失活Km不变，不变，Vmax变小变小 3. 3. 反竞争性抑制作用反竞争性抑制作用Km、Vmax都变小都变小上图反映出温度如何影响酶活力？产产物物累累积积量量 最适温度最适温度 最适温度最适温度w动物酶动物酶 3540w植物酶植物酶 4050w微生物微生物

27、大部分大部分 4050w个别高温菌个别高温菌 90以上以上 四、温度对酶反应的影响四、温度对酶反应的影响温度越高，活化分子越多，反应速度快；温度越高，活化分子越多，反应速度快；酶变性时间越短，反应速度下降也迅速。酶变性时间越短，反应速度下降也迅速。 五、五、pH 对酶反应的影响对酶反应的影响w最适最适pH时的酶时的酶活力最大活力最大最适最适pH因酶而异，因酶而异，多数酶在多数酶在7.0左右左右是酶的特性之一是酶的特性之一 六、激活剂对酶反应的影响六、激活剂对酶反应的影响无机离子无机离子阳离子阳离子 K K+ +、CaCa2+2+、NaNa+ +、2+2+、ZnZn2+2+等等阴离子阴离子 Cl

28、 Cl - -、Br Br - -等等中等大小的有机分子中等大小的有机分子某些激酶某些激酶第十章第十章 酶的作用机制和酶的调节酶的作用机制和酶的调节一、酶的活性部位一、酶的活性部位二、酶催化反应的独特性质二、酶催化反应的独特性质三、影响酶催化效率的有关因素三、影响酶催化效率的有关因素四、酶催化反应机制的实例四、酶催化反应机制的实例五、酶活性的调节控制五、酶活性的调节控制六、同工酶六、同工酶一、酶的活性部位一、酶的活性部位活性中心：酶分子中结合底物并起催化作用的少数氨基活性中心：酶分子中结合底物并起催化作用的少数氨基酸残基，包括底物结合部位（决定酶的专一性）、催化酸残基，包括底物结合部位（决定酶

29、的专一性）、催化部位（决定酶所催化反应的性质）。部位（决定酶所催化反应的性质）。频率最高的活性中心的氨基酸残基：频率最高的活性中心的氨基酸残基：SerSer、HisHis、CysCys、TyrTyr、AspAsp、GluGlu、LysLys。不需要辅酶的酶：活性中心是酶分子在三维结构上比较不需要辅酶的酶：活性中心是酶分子在三维结构上比较靠近的少数几个氨基酸残基或是这些残基的某些基团。靠近的少数几个氨基酸残基或是这些残基的某些基团。 需要辅酶的酶：辅酶分子或辅酶分子的某一部分结构往需要辅酶的酶：辅酶分子或辅酶分子的某一部分结构往往就是活性中心的组成部分。往就是活性中心的组成部分。 （一）酶活性部

30、位的特点（一）酶活性部位的特点接触残基：接触残基：R1、R2、R6、R8、R9、R163辅助残基：辅助残基：R3、R4、R5、R164、R165结构残基：结构残基：R10、R162、R169非贡献残基：其它非贡献残基：其它酶蛋白酶蛋白必需残基必需残基非必需残基非必需残基活性中心活性中心活性中心外活性中心外接触残基接触残基辅助残基辅助残基结构残基结构残基结合残基结合残基催化基团催化基团（1 1）接触残基：）接触残基：结合基团，催化基团。结合基团，催化基团。（2 2）辅助残基：）辅助残基：不与底物接触，辅助酶与底物结合，协助不与底物接触，辅助酶与底物结合，协助接触残基。接触残基。上述两类残基构成上

31、述两类残基构成酶活性中心酶活性中心。（3 3）结构残基：）结构残基：维持酶分子三维构象，与酶活性相关，但维持酶分子三维构象，与酶活性相关，但不在酶活性中心范围内，属于酶活性中心以外的必需残基。不在酶活性中心范围内，属于酶活性中心以外的必需残基。上述三类残基统称酶的上述三类残基统称酶的必需基团必需基团（4 4）非贡献残基（非必需基团）非贡献残基（非必需基团）可能在免疫，酶活性调节，运输转移，防止降解等方面起作可能在免疫，酶活性调节，运输转移，防止降解等方面起作用。用。 酶活性部位的特点：酶活性部位的特点：（1 1）活性部位在酶分子的总体中只占相当小的部分，）活性部位在酶分子的总体中只占相当小的部

32、分，往往只占整个酶分子体积的往往只占整个酶分子体积的1%-2% 1%-2% ；（2 2）酶的活性部位是一个三维实体，）酶的活性部位是一个三维实体，具有三维空间结具有三维空间结构构。 活性中心的空间构象不是刚性的，在与底物接触活性中心的空间构象不是刚性的，在与底物接触时表现出一定的柔性和运动性。（邹承鲁研究酶变性的时表现出一定的柔性和运动性。（邹承鲁研究酶变性的工作）工作）（3 3）通过诱导契合酶和底物结合；）通过诱导契合酶和底物结合；（4 4）酶的活性部位是位于酶表面的一个裂隙内，裂隙）酶的活性部位是位于酶表面的一个裂隙内，裂隙内是一个相当疏水的环境，从而有利于同底物的结合；内是一个相当疏水的

33、环境，从而有利于同底物的结合；（5 5）底物通过次级键较弱的力结合到酶上。）底物通过次级键较弱的力结合到酶上。（二）研究酶活性部位的方法（二）研究酶活性部位的方法（1 1）通过酶的专一性：）通过酶的专一性：研究酶的专一性底物的结构特研究酶的专一性底物的结构特点、酶的竞争性抑制剂结构特点等。点、酶的竞争性抑制剂结构特点等。（2 2）酶的化学修饰法：）酶的化学修饰法：例如例如1.1.用用共价修饰的试剂共价修饰的试剂作用作用于酶，查明保持酶活力的必需基团；于酶，查明保持酶活力的必需基团；2.2.亲和标记（合成亲和标记（合成底物类似物）；底物类似物）；3.SH3.SH保护剂的使用。保护剂的使用。（3

34、3）X X射线晶体衍射法射线晶体衍射法（4 4）分子生物学的方法）分子生物学的方法二、酶催化反应的独特性质二、酶催化反应的独特性质（1 1）酶反应分为两类：仅涉及）酶反应分为两类：仅涉及电子转移电子转移和涉及和涉及电子和电子和质子两者或者其他基团的转移质子两者或者其他基团的转移。（2 2）催化作用是以氨基酸侧链上的功能基团和辅酶为）催化作用是以氨基酸侧链上的功能基团和辅酶为媒介。媒介。（3 3）酶催化反应的最适）酶催化反应的最适pHpH范围通常狭小。范围通常狭小。（4 4）酶分子很大，而活性部位通常只比底物稍大一些，）酶分子很大，而活性部位通常只比底物稍大一些，一个巨大的酶结构对稳定活性部位的

35、构象是必要的。一个巨大的酶结构对稳定活性部位的构象是必要的。（5 5）酶具有复杂的折叠结构。）酶具有复杂的折叠结构。三、影响酶催化效率的有关因素三、影响酶催化效率的有关因素（一）底物和酶的邻近效应与定向效应（一）底物和酶的邻近效应与定向效应邻近效应：邻近效应：酶与底物形成中间复合物后使底物之间、酶酶与底物形成中间复合物后使底物之间、酶的催化基团与底物之间相互靠近，提高了反应基团的有的催化基团与底物之间相互靠近，提高了反应基团的有效浓度。效浓度。定向效应：定向效应：由于酶的构象作用，底物的反应基团之间、由于酶的构象作用，底物的反应基团之间、酶与底物的反应基团之间正确取向的效应。酶与底物的反应基团

36、之间正确取向的效应。酶把底物分子从溶液中富集出来，使它们固定在活性中酶把底物分子从溶液中富集出来，使它们固定在活性中心附近，反应基团相互邻近，同时使反应基团的分子轨心附近，反应基团相互邻近，同时使反应基团的分子轨道以正确方位相互交叠，反应易于发生。道以正确方位相互交叠，反应易于发生。邻近效应与定向效应对反应速度的影响：邻近效应与定向效应对反应速度的影响：使底物浓度在活性中心附近很高使底物浓度在活性中心附近很高 酶对底物分子的电子轨道具有导向作用酶对底物分子的电子轨道具有导向作用 酶使分子间反应转变成分子内反应酶使分子间反应转变成分子内反应邻近效应和定向效应对底物起固定作用邻近效应和定向效应对底

37、物起固定作用 （二）底物的形变和诱导契合（二）底物的形变和诱导契合酶中某些基团可使底物分子的敏感键中某些基团的电子云酶中某些基团可使底物分子的敏感键中某些基团的电子云密度变化，产生电子张力，降低了底物的活化能。密度变化，产生电子张力，降低了底物的活化能。酶从低活性形式转变为高酶从低活性形式转变为高活性形式，利于催化。活性形式，利于催化。底物形变，利于形成底物形变，利于形成ESES复复合物。合物。底物构象变化，过度态结底物构象变化，过度态结构，大大降低活化能。构，大大降低活化能。ZnZnGlu270Tyr248Arg145底物底物 羧肽酶结合底物前后构象变化（三）酸碱催化（三）酸碱催化酶分子的一

38、些功能基团起瞬时质子供体或质子受体的作用。酶分子的一些功能基团起瞬时质子供体或质子受体的作用。影响酸碱催化反应速影响酸碱催化反应速度的两个因素度的两个因素酸碱强度酸碱强度(pK(pK值）。值）。组氨酸咪唑基组氨酸咪唑基的解离的解离常数为常数为6 6，在，在pH6pH6附近附近给出质子和结合质子给出质子和结合质子能力相同，能力相同，是最活泼是最活泼的催化基团的催化基团。给出质子或结合质给出质子或结合质子的速度。咪唑基最子的速度。咪唑基最快，半寿期小于快，半寿期小于1010-10-10秒秒（四）共价催化（四）共价催化酶作为亲核基团或亲电基团，与底物形成一个反应活性酶作为亲核基团或亲电基团，与底物形

39、成一个反应活性很高的共价中间物。很高的共价中间物。酶亲核基团：酶亲核基团：Ser-OHSer-OH，Cys-SHCys-SH，His-NHis-N、Asp-COOHAsp-COOH；底物亲电中心：磷酰基（底物亲电中心：磷酰基（-P=O-P=O），），酰基（酰基（-C=O-C=O），糖基（），糖基（Glu-C-OHGlu-C-OH）某些辅酶，如焦磷酸硫胺素和磷某些辅酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以参与共价催化酸吡哆醛等也可以参与共价催化作用。作用。催化剂通过与底物形成反应活性很高的共价过渡产物，催化剂通过与底物形成反应活性很高的共价过渡产物，使反应活化能降低，从而提高反应速度的过程，称为使

40、反应活化能降低，从而提高反应速度的过程，称为共共价催化价催化。（五）金属离子催化（五）金属离子催化金属酶（金属酶（metalloenzyme):metalloenzyme):含紧密结合的金属离子，含紧密结合的金属离子，FeFe2+2+、CuCu2+2+、ZnZn2+2+、MnMn2+2+、CoCo3+3+。金属金属- -激活酶（激活酶（metal-activated enzyme):metal-activated enzyme):含松散结合的含松散结合的金属离子，金属离子，NaNa+ +、K K+ +、MgMg2+2+、CaCa2+2+。金属离子参加的四种主要催化途径金属离子参加的四种主要催化

41、途径（1 1）通过结合底物为反应定向）通过结合底物为反应定向（2 2）通过自身价数的改变参加氧化还原反应）通过自身价数的改变参加氧化还原反应（3 3）屏蔽底物或酶活性中心的负电荷）屏蔽底物或酶活性中心的负电荷（4 4）金属离子通过水的离子化促进亲核催化。）金属离子通过水的离子化促进亲核催化。（六）多元催化和协同效应（六）多元催化和协同效应在酶催化反应中，常常是几个基元催化反应配合在一在酶催化反应中，常常是几个基元催化反应配合在一起共同起作用。起共同起作用。（七）活性部位微环境的影响（七）活性部位微环境的影响 疏水环境疏水环境介电常数低，加强极性基团间的作用。介电常数低，加强极性基团间的作用。电

42、荷环境电荷环境在酶活性中心附近，往往有一电荷离子，可稳定过渡在酶活性中心附近，往往有一电荷离子，可稳定过渡态的离子态的离子 四、酶催化反应机制的实例四、酶催化反应机制的实例（一）溶菌酶（一）溶菌酶（lysozymelysozyme）NAG:N-乙酰氨基葡萄糖乙酰氨基葡萄糖NAM:N-乙酰氨基葡萄糖乳酸乙酰氨基葡萄糖乳酸 溶菌酶-底物复合物酶切位点酶切位点溶菌酶活性中心与底物结合示意图Asp52Glu35（极性区）（极性区）（非极性区）（非极性区）溶菌酶催化反应机理C1+非极性区非极性区极性区极性区HO - E环环H2O（广义酸碱催化）（广义酸碱催化）（二）（二）RNase ARNase A R

43、Nase-底物复合物RNase活性中心的酸碱催化机理核糖核酸链受Rnase水解的位点（三）羧肽酶（三）羧肽酶 A A 羧肽酶活性中心羧肽酶活性中心ZnZn2+2+的中心作用的中心作用羧肽酶活性中心必需基团与底物羧肽酶活性中心必需基团与底物间的结合间的结合ZnZn羧肽酶结合底物前后构象变化羧肽酶活性中心的共价催化机理 145（四）丝氨酸蛋白酶（胰凝乳蛋白酶）（四）丝氨酸蛋白酶（胰凝乳蛋白酶）胰凝乳蛋白酶分子中催化三联体构象His57Asp102Ser195Asp102His57Ser195His57102AspSer195A.酶分子中的电荷中继网酶分子中的电荷中继网B.加上底物后，从加上底物后，

44、从Ser转移一个质子给转移一个质子给His，带正电荷的咪唑基通过带负电荷的带正电荷的咪唑基通过带负电荷的Asp静电静电相互作用被稳定相互作用被稳定Ser195102AspHis57底物底物氢键体系氢键体系- -电荷中继网电荷中继网胰凝乳蛋白酶反应的详细机制（1）结合底物结合底物His57 质子供体质子供体形成共价形成共价ES复合物复合物C-N键断裂键断裂底物底物胰凝乳蛋白酶反应的详细机制（2） 氨基产物释放氨基产物释放四面体中间物四面体中间物的瓦解的瓦解水亲核攻击水亲核攻击羧基产物释放羧基产物释放H2OR-NH2五、酶活性的调节控制五、酶活性的调节控制（一）别构调控（一）别构调控概念概念：酶分

45、子的非催化部位与某些化合物可逆地非共价结酶分子的非催化部位与某些化合物可逆地非共价结合后导致酶分子发生构象改变，进而改变酶的活性状态，合后导致酶分子发生构象改变，进而改变酶的活性状态，称为酶的称为酶的别构调节别构调节(allosteric regulation)(allosteric regulation)，具有这种，具有这种调节作用的酶称别构酶调节作用的酶称别构酶(allosteric enzyme)(allosteric enzyme)。别构酶促。别构酶促反应底物浓度和反应速度的关系不符合米氏方程，呈反应底物浓度和反应速度的关系不符合米氏方程，呈S S型型曲线曲线。凡能使酶分子发生别构作用

46、的物质称为效应物凡能使酶分子发生别构作用的物质称为效应物(effector)(effector)，通常为小分子代谢物或辅因子。如因别构导致酶活性增加通常为小分子代谢物或辅因子。如因别构导致酶活性增加的物质称为正效应物的物质称为正效应物(positive effector)(positive effector)或别构激活剂，或别构激活剂，反之称负效应物反之称负效应物(negative effector)(negative effector)或别构抑制剂。或别构抑制剂。别构调节普遍存在于生物界，许多代谢途径的关键酶利用别构调节普遍存在于生物界，许多代谢途径的关键酶利用别构调节来控制代谢途径之间的平

47、衡，研究别构调控有重别构调节来控制代谢途径之间的平衡，研究别构调控有重要的生物学意义。要的生物学意义。A-非调节酶非调节酶B-正协同别构酶正协同别构酶 的的S形曲线形曲线 别构酶与米氏酶的动力学曲线比较别构酶与米氏酶的动力学曲线比较当底物浓度发生很小当底物浓度发生很小的变化时，别构酶就的变化时，别构酶就极大地控制着反应速极大地控制着反应速度。度。在正协同效应中使得在正协同效应中使得酶反应速度对底物浓酶反应速度对底物浓度的变化极为敏感。度的变化极为敏感。区分酶的类型有两种标准区分酶的类型有两种标准a. Koshlanda. Koshland标准：标准：CICI（cooperativity ind

48、excooperativity index）协同）协同指数：酶分子中的结合位点被底物饱和指数：酶分子中的结合位点被底物饱和90%90%和和10%10%时底时底物浓度的比值。亦称饱和比值物浓度的比值。亦称饱和比值Rs(saturation ratio)Rs(saturation ratio) Rs= Rs= 酶与底物结合达酶与底物结合达90%90%饱和度时底物浓度饱和度时底物浓度酶与底物结合达酶与底物结合达10%10%饱和度时底物浓度饱和度时底物浓度 Rs=81 Rs=81 米氏类型酶米氏类型酶 RsRs 81 81 具有正协同效应的别构酶具有正协同效应的别构酶 RsRs 81 81 具有负协同

49、效应的别构酶具有负协同效应的别构酶b.Hillb.Hill系数：系数： HillHill系数系数=1 =1 米氏类型酶米氏类型酶 HillHill系数系数 1 1 具有正协同效应的别构酶具有正协同效应的别构酶 HillHill系数系数 1 1 具有负协同效应的别构酶具有负协同效应的别构酶1-非调节酶非调节酶2-正协同别构酶正协同别构酶3-负协同别构酶负协同别构酶 正、负协同别构酶与非调节酶的动力学曲线比较具有负协同效应的酶在底物具有负协同效应的酶在底物浓度较低的范围内酶活力上浓度较低的范围内酶活力上升快，但再继续下去，底物升快，但再继续下去，底物浓度虽有较大的提高，但反浓度虽有较大的提高，但反

50、应速度升高却较小。使得酶应速度升高却较小。使得酶反应速度对底物浓度的变化反应速度对底物浓度的变化不敏感不敏感天冬氨酸转氨甲酰酶（天冬氨酸转氨甲酰酶（ATCaseATCase）ATCaseATP+氨甲酰磷酸氨甲酰磷酸天冬氨酸天冬氨酸CTP-UTPUMP氨甲酰天冬氨酸氨甲酰天冬氨酸E.coli的ATCase的亚基排列c:催化亚基（催化亚基（catalytic subunit）r:调节亚基（调节亚基（ regulative subunit）ATCaseATCase半分子（半分子（c3r3)c3r3)的结构的结构ATCase的别构过渡作用低催化活性构象低催化活性构象T(tense) - 态态CCCCC

51、C R R R R R RCCCCCC高催化活性构象高催化活性构象R(relax) -态态R RR RR RPALAPALA(N-磷乙酰-L-天冬氨酸)结合到ATCase活性中心的模型ATCase变构效应的动力学特征ATP（正效应剂）（正效应剂）CTP（负效应剂）（负效应剂）低催化活性构象低催化活性构象T(tense) - 态态CCCCCC R R R R R RCCCCCC高催化活性构象高催化活性构象R(relax) -态态R RR RR RVmax1/2VmaxKm别构酶的齐变模型S SSSS SSS SST状态（对称亚基）状态（对称亚基）R状态（对称亚基）状态（对称亚基）SSSS对称亚基

52、对称亚基对称亚基对称亚基齐步变化齐步变化别构酶的序变模型SS SS SSSSSSSSSS亚基全部亚基全部处于处于R型型亚基全部亚基全部处于处于T型型依次序变化依次序变化（二）酶的共价修饰（二）酶的共价修饰 某些酶可以通过其它酶对其多肽链上某些基团进行可逆的共某些酶可以通过其它酶对其多肽链上某些基团进行可逆的共价修饰，使其处于活性与非活性的互变状态，从而调节酶活性价修饰，使其处于活性与非活性的互变状态，从而调节酶活性。这类酶称为。这类酶称为共价修饰酶共价修饰酶。目前发现有数百种酶被翻译后都要。目前发现有数百种酶被翻译后都要进行共价修饰，其中一部分处于分支代谢途径，成为对代谢流进行共价修饰，其中一

53、部分处于分支代谢途径，成为对代谢流量起调节作用的关键酶或限速酶。量起调节作用的关键酶或限速酶。 由于这种调节的生理意义广泛，反应灵敏，节约能量，机制多样，在体由于这种调节的生理意义广泛，反应灵敏，节约能量，机制多样，在体内显得十分灵活，加之它们常受激素甚至神经的指令，导致级联放大反应，内显得十分灵活，加之它们常受激素甚至神经的指令，导致级联放大反应，所以日益引人注目。所以日益引人注目。 AP1GEDCBHEa-bEc-dEc-g关键酶（限速酶）关键酶（限速酶）P2蛋白质的磷酸化和脱磷酸化 蛋白激酶蛋白激酶ATPADP蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质Pn蛋白磷酸酶蛋白磷酸酶nPiH2O反应类型反应类型

54、共价修饰共价修饰 被修饰的氨基酸残基被修饰的氨基酸残基共价修饰反应的例子磷酸化磷酸化腺苷酰化腺苷酰化尿苷酰化尿苷酰化Tyr,Ser,Thr.HisTyrTyr甲基化甲基化GluS-腺苷腺苷-MetS-腺苷腺苷-同型同型 CysATP ADP肾上腺素或肾上腺素或胰高血糖素胰高血糖素132 102 104 106 108葡萄糖葡萄糖456 级联系统调控糖原分解示意图意义意义：由于由于酶的酶的共价修饰反应是共价修饰反应是酶促反应，只要酶促反应，只要有少量信号分子有少量信号分子（如激素）存在，（如激素）存在，即可通过加速这即可通过加速这种酶促反应，而种酶促反应，而使大量的另一种使大量的另一种酶发生化学修饰，酶发生化学修饰，从而获得放大效从而获得放大效应。这种调节方应。这种调节方式快速、效率极式快速、效率极高。高。肾上腺素或肾上腺素或胰高血糖素胰高血糖素1、腺苷酸环化酶