《生物化学教程》第三章酶化学

1、第三章第三章 酶化学酶化学 本章内容本章内容第一节第一节 酶引论酶引论第二节第二节 酶动力学酶动力学第三节第三节 酶作用机制和酶活性调节酶作用机制和酶活性调节第一节第一节 酶引论酶引论Ferment（酵素）酵素）Enzyme在酵母中（希腊文）在酵母中（希腊文）Enzyme (in yeast)Enzyme (in yeast) enzymeenzyme是希是希腊腊文文 en = in en = in ， zyme = zyme = yeastyeast一、酶研究的简史（了解）一、酶研究的简史（了解） 对酶的认识起源于生产与生活实践。对酶的认识起源于生产与生活实践。 夏禹时代，人们掌握了夏禹时代

2、，人们掌握了酿酒酿酒技术。技术。 公元前公元前1212世纪周朝，人们酿酒，制作饴糖和酱。世纪周朝，人们酿酒，制作饴糖和酱。 春秋战国时期已知用春秋战国时期已知用麴麴( (曲曲) )治疗消化不良的疾病。治疗消化不良的疾病。 酶者，酒母也酶者，酒母也（一）（一） 酶的早期利用酶的早期利用 （二）（二）1919世纪中叶对发酵本质的探讨世纪中叶对发酵本质的探讨 （三）关于酶的化学本质的认识（三）关于酶的化学本质的认识 1926年年Sumner首次从刀豆中提出脲酶结晶，首次从刀豆中提出脲酶结晶，并并证明具有蛋白质性质证明具有蛋白质性质。 1930年年Northrop等得到了胃蛋白酶、胰蛋白酶等得到了胃蛋

3、白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的结晶，并进一步证明了和胰凝乳蛋白酶的结晶，并进一步证明了酶是酶是蛋白质蛋白质。 J.B.SumnerJ.H.Northrop（三）关于酶的化学本质的认识（三）关于酶的化学本质的认识 某些某些RNA有催化活性有催化活性（ ribozyme，核酶），核酶） 1982年美国年美国T. Cech等人发现四膜虫的等人发现四膜虫的rRNA前前体能在完全没有蛋白质的情况下进行自我加工，发体能在完全没有蛋白质的情况下进行自我加工，发现现RNA有催化活性有催化活性 。 Thomas Cech University of Colorado at Boulder, USA 1983年美

4、国年美国S.Altman等研究等研究RNaseP（由（由20%蛋蛋白质和白质和80%的的RNA组成），发现组成），发现RNaseP中的中的RNA可催化可催化E. coli tRNA的前体加工。的前体加工。 Sidney Altman Yale University New Haven, CT, USA Cech和和Altman各自独立地发现了各自独立地发现了RNA的催化活的催化活性，并命名这一类酶为性，并命名这一类酶为ribozyme（核酶），（核酶），2人共人共同获同获1989年诺贝尔化学奖。年诺贝尔化学奖。 （三）关于酶的反应机制的研究（三）关于酶的反应机制的研究 酶是一类由活性细胞产生的

5、具有催化作用和酶是一类由活性细胞产生的具有催化作用和高度专一性的特殊高度专一性的特殊蛋白质或核蛋白质或核酸。简单说，酶是酸。简单说，酶是一类由活性细胞产生的一类由活性细胞产生的生物催化剂生物催化剂。（四）酶的概念（四）酶的概念二、酶是生物催化剂二、酶是生物催化剂（一）与一般催化剂的相同点（一）与一般催化剂的相同点 1. 提高反应速度，不改变平衡点提高反应速度，不改变平衡点; 2. 只起催化作用，本身不消耗；只起催化作用，本身不消耗； 3. 降低反应的降低反应的活化能活化能。 （二）酶是催化剂，降低反应的活化能（二）酶是催化剂，降低反应的活化能l 概念：指在一定温度下，概念：指在一定温度下，1m

6、ol底物全部进底物全部进入活化态所需要的自由能。入活化态所需要的自由能。 -单位：单位：KJ/moll 酶催化反应的实质：酶催化反应的实质：降低反应的活化能降低反应的活化能（三）酶作为生物催化剂的特点（三）酶作为生物催化剂的特点酶的催化效率高（高效性）酶的催化效率高（高效性）酶的高度专一性（专一性）酶的高度专一性（专一性）酶活力受调节和控制（可调性）酶活力受调节和控制（可调性）酶催化反应条件温和，中性酶催化反应条件温和，中性pH催化效率高催化效率高 酶的催化效率比化学催化剂高酶的催化效率比化学催化剂高107 -1013 倍，比非催倍，比非催化反应高化反应高105 -1017 倍。倍。 (1)过

7、氧化氢分解过氧化氢分解 2H2O2 2H2O + O2 用用Fe3+ 催化，效率为催化，效率为610-4 mol/molS，而用过氧化而用过氧化氢酶催化，效率为氢酶催化，效率为6 106 mol/molS。 (2) -淀粉酶催化淀粉水解淀粉酶催化淀粉水解，1克结晶酶在克结晶酶在65 C条件条件下可催化下可催化2吨淀粉水解。吨淀粉水解。酶的专一性酶的专一性 酶活力受调节酶活力受调节 指通过指通过激活激活或或抑制抑制以改变细胞内已有酶以改变细胞内已有酶分子的分子的催化能力。催化能力。酶活力酶活力的调节的调节酶酶活性活性（活力）的调节（活力）的调节酶酶量量的调节（基因表达的调控）的调节（基因表达的调

8、控）别构别构调节调节共价共价调节调节反馈反馈抑制（顺序）抑制（顺序）反馈反馈抑制（协同）抑制（协同）三、酶的化学本质三、酶的化学本质（一）酶的化学组成（一）酶的化学组成酶酶单纯酶（简单蛋白质）单纯酶（简单蛋白质）缀合酶缀合酶（全酶）（全酶）= 酶蛋白酶蛋白 + 辅因子辅因子单纯酶单纯酶单纯酶（单纯酶（simple enzyme）仅由氨基酸组成。例）仅由氨基酸组成。例如：胃蛋白酶，淀粉酶，核糖核酸酶，脲酶。如：胃蛋白酶，淀粉酶，核糖核酸酶，脲酶。 缀合酶缀合酶有的酶属于缀合蛋白质，除了蛋白质组分外还有有的酶属于缀合蛋白质，除了蛋白质组分外还有非非蛋白蛋白组成，即缀合酶。组成，即缀合酶。羧肽酶NA

9、DPH脱氢酶的辅酶过氧化氢酶（二）酶的辅助因子（二）酶的辅助因子 酶的对热稳定的非蛋白小分子物质部分，其酶的对热稳定的非蛋白小分子物质部分，其主要作用是主要作用是作为电子、原子或某些基团的载体作为电子、原子或某些基团的载体参与反应并促进整个催化过程参与反应并促进整个催化过程。辅助辅助因子因子辅酶辅酶 与酶蛋白结合得比较松的小分子有机物。与酶蛋白结合得比较松的小分子有机物。辅基辅基 与膜蛋白结合得紧密的小分子有机物。与膜蛋白结合得紧密的小分子有机物。金属激活剂金属激活剂 金属离子作为辅助因子。金属离子作为辅助因子。酶的催化专一性主要酶的催化专一性主要决定于酶蛋白部分决定于酶蛋白部分，辅因子，辅因

10、子通常是通常是作为电子、原子或某些化学基团的载体作为电子、原子或某些化学基团的载体。重要的例子：重要的例子：(1)(1)传递电传递电子体：子体：如如 卟啉铁卟啉铁、铁铁硫簇；硫簇；(2)(2)传递氢传递氢（递氢递氢体）：体）：如如 FMN/FADFMN/FAD、NAD/NADPNAD/NADP、CoQCoQ、硫辛酸；、硫辛酸；(3)(3)传递酰传递酰基体：基体：如如 CoACoA、TPPTPP、硫辛酸；、硫辛酸；(4)(4)传递传递一一碳碳基基团团：如如 四四氢氢叶酸；叶酸；(5)(5)传递传递磷酸基：磷酸基：如如 ATPATP，GTPGTP；(6)(6)其其它它作用：作用： 转氨转氨基，如基

11、，如 VBVB6 6 ；传递传递COCO2 2，如，如 生物素。生物素。 单纯酶单纯酶 酶酶 酶蛋白酶蛋白 结合酶（全酶）结合酶（全酶） 辅酶辅酶 辅助因子辅助因子 辅基辅基 金属离子金属离子 1、全酶由、全酶由 和和 组成，在催化反应时，组成，在催化反应时，二者所起的作用不同，其中二者所起的作用不同，其中 决定酶的专决定酶的专一性和高效率，一性和高效率， 起传递电子、原子或化起传递电子、原子或化学基团的作用。学基团的作用。2、具有生物活性的全酶，无辅助因子时、具有生物活性的全酶，无辅助因子时A.有活性有活性 B.无活性无活性C.无特异性无特异性D.不易失活不易失活3、TRCech和和S.Al

12、man因各自发现了因各自发现了 而而共同获得共同获得1989年的诺贝尔奖（化学奖）。年的诺贝尔奖（化学奖）。（三）酶的四级缔合（了解）（三）酶的四级缔合（了解）根据酶蛋白分子的特点：根据酶蛋白分子的特点：单体酶：一般由一条肽链组成单体酶：一般由一条肽链组成寡聚酶：为寡聚蛋白，寡聚酶：为寡聚蛋白， 2 2个亚基个亚基多酶复合体多酶复合体：几种酶靠：几种酶靠非共价键非共价键彼此嵌合而成。彼此嵌合而成。-由数个独立的酶组合起来形成络合体，催化由数个独立的酶组合起来形成络合体，催化一系列反应。（如糖代谢、脂代谢）一系列反应。（如糖代谢、脂代谢）溶菌酶（单体酶）溶菌酶（单体酶）丙酮酸脱氢酶复合体丙酮酸脱

13、氢酶复合体1：酰基转移酶（：酰基转移酶（AT）2：丙二酰转移酶：丙二酰转移酶(MT)3：酮脂酰酮脂酰-ACP合成酶合成酶(KS)4：酮脂酰酮脂酰-ACP还原酶还原酶(KR)5：羟羟脂酰脂酰-ACP脱水酶脱水酶(HD)6：烯脂酰烯脂酰-ACP还原酶还原酶(ER)7：酰基载体蛋白（：酰基载体蛋白（ACP）四、酶的命名和分类四、酶的命名和分类 （一）酶的命名（一）酶的命名2、国际系统命名法、国际系统命名法(systematic name)1、习惯命名法、习惯命名法(recommended name)1、习惯命名法、习惯命名法(recommended name)根据其根据其催化底物催化底物来命名来命名

14、( (蛋白酶；淀粉酶）；蛋白酶；淀粉酶）；根据所根据所催化反应的性质催化反应的性质来命名（水解酶；裂解酶）来命名（水解酶；裂解酶）结合上述两个原则来命名（琥珀酸脱氢酶）结合上述两个原则来命名（琥珀酸脱氢酶）有时在这些命名基础上加上有时在这些命名基础上加上酶的来源酶的来源或其它特点或其它特点（胃蛋白酶、胰蛋白酶（胃蛋白酶、胰蛋白酶) )国际系统命名法原则，是以酶所催化的整体国际系统命名法原则，是以酶所催化的整体反应为基础，规定反应为基础，规定每一种酶的名称应当明确每一种酶的名称应当明确标明酶的底物及催化反应的性质标明酶的底物及催化反应的性质。如果一种。如果一种酶催化两个底物起反应，则两个底物都应

15、写酶催化两个底物起反应，则两个底物都应写出，中间用出，中间用“：”号隔开。号隔开。 （国际酶学委员会年提出）（国际酶学委员会年提出）例如：例如：习惯名称习惯名称:谷丙转氨酶谷丙转氨酶(GPT, ALT)系统名称系统名称:L-丙氨酸：丙氨酸： -酮戊二酸酮戊二酸氨基转移酶氨基转移酶酶催化的反应酶催化的反应: -酮戊二酸酮戊二酸 + 丙氨酸丙氨酸谷氨酸谷氨酸 + 丙酮酸丙酮酸（二）酶的分类和编号（掌握）（二）酶的分类和编号（掌握）1. 国际系统分类法分类原则国际系统分类法分类原则 氧化还原酶氧化还原酶转移酶转移酶水解酶水解酶裂解酶裂解酶异构酶异构酶连接酶连接酶2. 六大酶类的特征六大酶类的特征 （

16、1 1）氧氧化化还还原酶原酶 OxidoreductaseOxidoreductase氧氧化化还还原酶催化原酶催化氧氧化化- -还还原反原反应应。主要包括主要包括脱氢脱氢酶酶和和氧氧化酶化酶，辅辅酶酶为为NADNAD或或NADP,FADNADP,FAD或或FMN.FMN.反反应应通式：通式：AHAH2 2+BA+BH+BA+BH2 2CHOCHOHCH2OP+NAD+ + PiCOCHOHCH2OPPO+NADH+H+甘油醛甘油醛3磷酸脱氢酶磷酸脱氢酶甘油醛甘油醛3磷酸磷酸甘油醛甘油醛1，3二磷酸二磷酸CH3CHCOOHOHNAD+H+CH3CCOOHONADH（2 2）转转移酶移酶 Tran

17、sferaseTransferase转转移酶催化基移酶催化基团转团转移反移反应应，即，即将将一一个个底物分子底物分子的基的基团团或原子或原子转转移到另一移到另一个个底物的分子上。底物的分子上。反反应应通式：通式：AR+B=A+BRAR+B=A+BR酮戊二酸酮戊二酸L L谷氨酸谷氨酸 酮酸酮酸（3）水解酶）水解酶 hydrolase水解酶催化底物的加水分解反水解酶催化底物的加水分解反应应。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。AB+HAB+H2 2O=AOH+BHO=AOH+BH（4） 裂解酶裂解酶 Lyase催化非水解地除去底物分子中的基团及其逆反催化

18、非水解地除去底物分子中的基团及其逆反应的酶。应的酶。反应通式：反应通式：AB=A+B（5）异构酶）异构酶 IsomeraseIsomerase催化各催化各种种同分同分异构异构体的相互体的相互转转化，即底化，即底物分子物分子内内基基团团或原子的重排或原子的重排过过程。程。反反应应通式：通式：A AB BOCH2O HO HO HO HO HOCH2O HCH2O HO HO HO HOCH2OHHOOHOHOHP磷酸己糖异构酶磷酸己糖异构酶OCH2OHOCH2POHOH果糖果糖6磷酸磷酸葡萄糖葡萄糖6磷酸磷酸（6）连接酶）连接酶 Ligase or Synthetase催化催化两个两个分子合成一

19、分子合成一个个分子的反分子的反应应，通常，通常与与ATPATP的裂解反的裂解反应应相耦相耦联联。反反应应通式：通式：A AB+ATPB+ATPAB+ADP+PiAB+ADP+Pi 在在每一大类酶每一大类酶中又可根据不同的原则，分为中又可根据不同的原则，分为几个亚类几个亚类。每一个亚类再分为每一个亚类再分为几个亚亚类几个亚亚类。最后，再把属于每一。最后，再把属于每一个亚亚类的各种酶按照顺序排好，分别给每一种酶一个亚亚类的各种酶按照顺序排好，分别给每一种酶一个个编号编号。酶的系统编号酶的系统编号：4位数字位数字第一位：第一位：代表六大类反应类型代表六大类反应类型第二位：第二位：亚类亚类（作用的（作

20、用的基团或键基团或键的特点）的特点）第三位：第三位：亚亚类亚亚类（精确表示底物（精确表示底物/产物的性质）产物的性质）第四位：在亚类中的第四位：在亚类中的序号序号 例如：乳酸脱氢酶例如：乳酸脱氢酶(EC 11127)。1、根据国际系统分类法，所有的酶按所催化的、根据国际系统分类法，所有的酶按所催化的化学反应的性质可分为六类为化学反应的性质可分为六类为、和和。2、根据国际酶学委员会的规定，每一种酶、根据国际酶学委员会的规定，每一种酶都有一个唯一的编号。醇脱氢酶的编号是都有一个唯一的编号。醇脱氢酶的编号是EC1.1.1.1，EC代表代表 ，4个数字分个数字分别代表别代表 、 、 和和 。国际酶学委

21、员会国际酶学委员会 酶的分类酶的分类 亚类亚类 亚亚类亚亚类 在亚亚类中的编号在亚亚类中的编号 五、酶的专一性五、酶的专一性（一）酶对（一）酶对S的专一性的专一性结构专一性绝对专一性相对专一性立体专一性几何异构专一性旋光异构专一性族（基团）专一性族（基团）专一性键专一性键专一性酶的专一性酶的专一性（二）关于酶专一性的假说（二）关于酶专一性的假说 三点附着学说三点附着学说 认为酶与底物的认为酶与底物的结合处结合处至少有三个点至少有三个点，而且只，而且只有一种情况是完全结合有一种情况是完全结合的形式。只有这种情况的形式。只有这种情况下，下，不对称催化作用不对称催化作用才才能实现。能实现。 “锁钥锁

22、钥”学说学说 认为整个酶分子的天然构象是具有认为整个酶分子的天然构象是具有刚性刚性结构结构的，酶表面具有的，酶表面具有特定的形状特定的形状。酶与。酶与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样。底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样。刚性模式：刚性模式：Emil Fisher提出提出 该学说认为酶表面并该学说认为酶表面并没有没有一种与底物互一种与底物互补的补的固定形状固定形状，而只是由于，而只是由于底物的诱导底物的诱导才形成了才形成了互补形状互补形状. .The induced-fit model诱导锲合学说六、酶活力的测定（重点）六、酶活力的测定（重点）（一）（一） 酶活力与酶促反应速度酶活力与酶促反应

23、速度1. 酶活力酶活力 概念：酶催化一定化学反应的能力。概念：酶催化一定化学反应的能力。实质：酶催化的实质：酶催化的反应速度越快反应速度越快，酶活力越高酶活力越高，反之则表示该酶活力低。反之则表示该酶活力低。通常以在一定条件下酶所催化的化学反应速通常以在一定条件下酶所催化的化学反应速度来表示。度来表示。即用即用单位时间内，单位体积中底物的减少量单位时间内，单位体积中底物的减少量或产物增加量来表示或产物增加量来表示。2、表示方法、表示方法产物浓度变化曲线产物浓度变化曲线用哪一个速度来表示用哪一个速度来表示酶促反应的速度特征呢？酶促反应的速度特征呢？反应初速度反应初速度 Vo反应反应初初速度表示酶

24、活力速度表示酶活力（二）酶活力单位（二）酶活力单位常用的酶活力单位有三种：常用的酶活力单位有三种：1、国际单位 (IU) 在标准条件在标准条件(25、最适、最适pH、最适底物浓度、最适底物浓度)下，下，酶酶每分钟每分钟催化催化 1m mmol 底物转化所需的酶量定义为底物转化所需的酶量定义为1个国际单位个国际单位 (IU)。单单位：位：molmolmin min -1-1某酶在一定条件下，某酶在一定条件下，5 min内使内使30 mmol底物底物转变为产物，问该酶的活力（转变为产物，问该酶的活力（IU）是多少？）是多少？30mmol 5min30000mol6000 IU 5min 2、 Ka

25、tal是由国际酶学委员会于是由国际酶学委员会于1972年规定的一种新单位年规定的一种新单位在最适条件下，酶每秒钟催化在最适条件下，酶每秒钟催化1mol 底物转化底物转化所需的酶量定义为所需的酶量定义为 1个个Kat 。1 Kat = 60106 IU1 Kat = 6107 IU 3 3、自定义的活力单位（了解）、自定义的活力单位（了解）这种单位简单方便，省去了许多计算；但只能这种单位简单方便，省去了许多计算；但只能进行酶活力的相对比较。进行酶活力的相对比较。酶习惯上或测定时使用的酶习惯上或测定时使用的反应速度的单位反应速度的单位定定义为酶的活力单位。义为酶的活力单位。有的甚至直接用测得的物理

26、量，如单位时间有的甚至直接用测得的物理量，如单位时间内消光值的变化内消光值的变化 (D DA/t) 表示酶活力单位。表示酶活力单位。-淀粉酶活力单位淀粉酶活力单位：每小时分解：每小时分解1g可溶性淀粉的酶可溶性淀粉的酶量为一个酶单位量为一个酶单位糖化酶活力单位糖化酶活力单位：在规定条件下，每小时转化可溶：在规定条件下，每小时转化可溶性淀粉产生性淀粉产生1mg还原糖（以葡萄糖计）所需的酶量为还原糖（以葡萄糖计）所需的酶量为一个酶单位。一个酶单位。蛋白酶蛋白酶：规定条件下，每分钟分解底物酪蛋白产生：规定条件下，每分钟分解底物酪蛋白产生1g酪氨酸所需的酶量。酪氨酸所需的酶量。DNA限制性内切酶限制性

27、内切酶：推荐反应条件下，一小时内可：推荐反应条件下，一小时内可完全消化完全消化1g纯化的纯化的DNA所需的酶量。所需的酶量。1、有、有1g淀粉酶制剂，用水溶解成淀粉酶制剂，用水溶解成1000ml，从中取，从中取出出1ml测定酶活力，测知每测定酶活力，测知每5min分解分解0.25g淀粉。淀粉。(淀淀粉酶活力单位的定义：在最适条件下每小时分解粉酶活力单位的定义：在最适条件下每小时分解1g淀粉的酶量为淀粉的酶量为1U) 求求1g酶制剂中所含有的淀粉酶活力单位数酶制剂中所含有的淀粉酶活力单位数? 由题意每小时分解由题意每小时分解1克淀粉的酶量为克淀粉的酶量为1U，1ml酶液酶液5min水解水解0.2

28、5g淀粉得出：淀粉得出：1ml该酶液该酶液1小时可以小时可以水解淀粉（水解淀粉（120.25）g3g，则，则1ml酶液含活力酶液含活力单位数为单位数为3U，那么，那么1g酶制剂含活力单位数为酶制剂含活力单位数为3U/ml1000ml3000U。（三）酶的比活力（三）酶的比活力1、酶的比活力、酶的比活力指指每毫克每毫克酶蛋白所含的酶蛋白所含的酶活力单位数酶活力单位数比活力 酶活力单位数（U）酶蛋白质量（mg）比活力是酶制剂纯度的常用指标比活力是酶制剂纯度的常用指标 比活力越大比活力越大，表示，表示酶越纯酶越纯有有50 g纯酶制剂，纯酶制剂，5min内催化生成了内催化生成了4 mol产物，产物，计

29、算酶的计算酶的活力活力及及比活力比活力。酶的酶的活力活力= 4 4= 0.8 IU 5 酶的比酶的比活力活力= 0.81000 4= 16 U/mgU/mg 50 2、产率与纯化倍数、产率与纯化倍数纯化倍数纯化倍数 = 每次每次比活力比活力/第一次第一次比活力比活力产率产率 = 每次每次总活力总活力/第一次第一次总活力总活力100% 不同样品同一酶制剂的总活力、总蛋白、比活力比较不同样品同一酶制剂的总活力、总蛋白、比活力比较 纯化纯化进程进程甲甲乙乙丙丙丁丁总活力总活力6432总蛋白总蛋白(mg)201052比活力比活力(U/mg)6/204/103/52/2 从某细胞中提取的一种蛋白水解酶的

30、粗提液从某细胞中提取的一种蛋白水解酶的粗提液300mL含有含有150mg蛋白质蛋白质，总活力为总活力为360单位单位。经过一系列纯化以后得。经过一系列纯化以后得到的到的4mL酶制品酶制品(含有含有0.08mg蛋白蛋白)，总活力为总活力为288单位单位。请。请问问回收率回收率是多少？是多少？纯化纯化了多少倍？了多少倍？第一次酶的比活力第一次酶的比活力= 360 = 2.4 150 最后酶的比活力最后酶的比活力= 288 = 3600 0.08产率产率 = 每次每次总活力总活力/第一次第一次总活力总活力100% 288/360288/3608080纯化倍数纯化倍数 = 每次每次比活力比活力/第一次

31、第一次比活力比活力 3600/2.4=1500P147 第第10题题 某酶的粗提液经过一次纯化后测得数据如下表所示：某酶的粗提液经过一次纯化后测得数据如下表所示：步骤体积/mL总蛋白/mg单位体积活力/（IU/mL）细胞匀浆（粗提液）100100020亲和层析510300 试计算该酶的比活力、纯化倍数和回收率？试计算该酶的比活力、纯化倍数和回收率？最终酶的比活力最终酶的比活力=(3005)/10=150IU/mg最初的比活力最初的比活力=(20100)/1000=2IU/mg纯化倍数纯化倍数=150/2=75回收率回收率=（3005）/（20100）=75%（五）酶活力的测定（了解）（五）酶活

32、力的测定（了解） 测定完成一定反应所需的时间测定完成一定反应所需的时间 测定单位时间内酶催化的化学反应量测定单位时间内酶催化的化学反应量（1）分光光度法：）分光光度法： 利用底物利用底物/产物光吸收性质不同产物光吸收性质不同 选择适当波长来测定。选择适当波长来测定。（2）荧光法：）荧光法： 利用底物利用底物/产物荧光性质的差别。产物荧光性质的差别。紫外紫外/可见光可见光（3）同位素测定方法：）同位素测定方法： 放射性同位素标记底物，放射性同位素标记底物， 经酶作用得到相应产物，经酶作用得到相应产物， 经适当分离，测定产物脉冲数即可。经适当分离，测定产物脉冲数即可。（4）电化学法：）电化学法：

33、包括包括pH测定法，离子选择电极法等。测定法，离子选择电极法等。 前者跟踪反应过程中前者跟踪反应过程中H+的变化，的变化， 后者用氧电极测定一些耗氧的酶反应。后者用氧电极测定一些耗氧的酶反应。七、核酶七、核酶- -非蛋白质生物催化剂非蛋白质生物催化剂（一）核酶的发现（一）核酶的发现（ribozyme） ）u核酶是核酶是具有催化功能的具有催化功能的RNARNA分子，是分子，是生物催化剂生物催化剂，可降解特异的，可降解特异的mRNAmRNA序列。序列。 u它的发现打破了酶是蛋白质的传统观念。它的发现打破了酶是蛋白质的传统观念。有一些被有一些被DNADNA分子同样具有催化功能。分子同样具有催化功能。

34、（二）核酶的种类（自我催化）（二）核酶的种类（自我催化）剪切型核酶剪切型核酶（self- cleavage） -是转录后加工方式之一是转录后加工方式之一剪接型核酶剪接型核酶（self-splicing） -剪切与连接剪切与连接需要鸟苷和需要鸟苷和Mg2+参与参与不需要鸟苷的参与不需要鸟苷的参与 其他类型其他类型-如核苷酸转移，脱磷酸作用如核苷酸转移，脱磷酸作用 （三）核酶的研究意义（三）核酶的研究意义RNA可作为可作为生物催化剂生物催化剂。打破了只有蛋白质才能有酶催化作用。打破了只有蛋白质才能有酶催化作用。为进化先有核酸、先有为进化先有核酸、先有RNA提供证据。提供证据。可用于制药和临床治疗。

35、可用于制药和临床治疗。 内容回顾l 酶的活力及比活力及如何计算指指每毫克每毫克酶蛋白所含的酶蛋白所含的酶活力单位数酶活力单位数比活力 酶活力单位数（U）酶蛋白质量（mg）第二节第二节 酶动力学酶动力学q酶促反应动力学酶促反应动力学 研究研究各种因素各种因素对酶促反应对酶促反应速度速度的影响。的影响。q影响因素包括有影响因素包括有酶浓度、酶浓度、底物浓度底物浓度、pHpH、温度、温度、抑制剂抑制剂、激活剂等。、激活剂等。酶动力学酶动力学一、有关的化学动力学概念（了解）一、有关的化学动力学概念（了解） 化学反应的两个基本问题：化学反应的两个基本问题： 反应进行的反应进行的方向、可能性和限度方向、可

36、能性和限度-化学热力学化学热力学 反应进行的反应进行的速率和反应机制速率和反应机制-化学动力学化学动力学1. 1. 反应分子数反应分子数反应中真正相互作用的分子的数目反应中真正相互作用的分子的数目单分子反应：单分子反应：AP双分子反应：双分子反应：A+BP+Q2. 2. 反应级数反应级数能以能以v = kc表示，为表示，为一级一级反应；反应；能以能以v = kc1c2表示，则为表示，则为二级二级反应；反应；v 与反应物浓度无关，则为与反应物浓度无关，则为零级零级反应。反应。双分子反应、一级反应双分子反应、一级反应二二. 底物浓度对酶促反应速率的影响底物浓度对酶促反应速率的影响（一）中间复合体学

37、说（一）中间复合体学说单单底物、底物、单单产物反应；产物反应；酶促反应速度一般在规定的反应条件下，酶促反应速度一般在规定的反应条件下，用单用单位时间内底物的消耗量和产物的生成量来表示；位时间内底物的消耗量和产物的生成量来表示；反应速度取其反应速度取其初速度初速度，即底物的，即底物的消耗量很小消耗量很小（一般在（一般在5 5以内）时的反应速度；以内）时的反应速度；底物浓度底物浓度远远大于远远大于酶浓度。酶浓度。（S E）1. 1. 中间复合体学说中间复合体学说E + S ES P + E k4三个假设：三个假设：（1）E与与S形成形成ES复合物的反应是复合物的反应是快速平衡快速平衡反应，而反应，

38、而 ES分解为分解为E及及P的反应为的反应为慢反应慢反应，反应速度取决于，反应速度取决于慢反应即慢反应即 Vk3ES。（2）S的总浓度的总浓度远远大于远远大于E的总浓度，因此在反应的初的总浓度，因此在反应的初始阶段，始阶段，S的浓度可认为不变即的浓度可认为不变即SSt。 （3）P0 忽略忽略 这步反应这步反应 ESE + Pk4E + S ESE + P+中间复合体学说中间复合体学说2. 2. 底物浓度对酶促反应速度的影响底物浓度对酶促反应速度的影响在其他因素不变的情况下，底物浓度对反应速在其他因素不变的情况下，底物浓度对反应速度的影响呈矩形双曲线关系。度的影响呈矩形双曲线关系。E + S k

39、1k2k3ESE + P当底物浓度较低时当底物浓度较低时反应速度与底物浓度成正比；反反应速度与底物浓度成正比；反应为应为一级反应一级反应。随着底物浓度的增高随着底物浓度的增高反应速度不再成反应速度不再成正比例正比例加速；反应加速；反应为混合级反应。为混合级反应。当底物浓度高达一定程度当底物浓度高达一定程度反应速度不再增加，达反应速度不再增加，达最大速度最大速度；反应为反应为零级零级反应反应（二）酶促反应动力学的基本公式（二）酶促反应动力学的基本公式米米-曼氏方程曼氏方程1、米氏方程及其推导、米氏方程及其推导 快速平衡理论快速平衡理论的基础上的基础上BriggsBriggs和和HaldaneHa

40、ldane在在稳态平衡理论稳态平衡理论的基础上的基础上并对米化方程进行了修正，但为纪念仍称米氏方程。并对米化方程进行了修正，但为纪念仍称米氏方程。V=Vmax SKm + SS：底物浓度：底物浓度 V ：反应速度：反应速度 Vmax：最大反应速度：最大反应速度m：米氏常数：米氏常数v1913年年Michaelis和和Menten提出反应速度与底提出反应速度与底物浓度关系的数学方程式，即米曼氏方程物浓度关系的数学方程式，即米曼氏方程式，简称米氏方程式，简称米氏方程(Michaelis equation)。S：底物浓度：底物浓度V：不同：不同S时的反应速度时的反应速度Vmax：最大反应速度：最大反

41、应速度(maximum velocity) m：米氏常数：米氏常数(Michaelis constant) VmaxS Km + S 米米氏氏方方程程的的推推导导 121kkkESSESSEt令令：Kmkkk121将将（4）代入代入（3），则，则： SKSVvmmax1kES 1kES2kEP ESEt SESES生成速度生成速度： SESEkvt11，ES分解速度分解速度：ESkESkv212即即： ESkESkSESEkt211则则： SSESESKmtE(1)经整理得经整理得： SKSEmtES由于酶促反应速度由由于酶促反应速度由ES决定，即决定，即ESkv22kvES，所以所以(2)将

42、将（2）代入代入（1）得得： SKSEkvmt2 SKSEkmt2v(3)当酶反应体系处于当酶反应体系处于稳态稳态时时：21vv 当当Et=ES时时，mVv tmEkV2(4)所以所以 a.当当S很小时很小时V=VS/Km 一级反应一级反应V= V VSKm + Sb.b.当当SS很大时很大时V=V=V VS/S=S/S=V V 0 级反应级反应混合级混合级2、米氏方程所确定的曲线、米氏方程所确定的曲线KmS * Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位是的底物浓度，单位是mol/L。2Km + S Vmax VmaxS Km的意义的意义

43、uKm值是酶的值是酶的特征性常数之一特征性常数之一，但，但不同条件下具不同条件下具有不同的有不同的Km值。值。uKm值可表示值可表示酶与底物之间的亲和程度酶与底物之间的亲和程度u同一种酶对不同底物有不同的同一种酶对不同底物有不同的Km值，可帮助值，可帮助推推断某一代谢反应的方向和途径断某一代谢反应的方向和途径Km= k2 + k3 k1Kmk2Kmk2（分离能力）（分离能力）/k1/k1（亲合能力）（亲合能力）E + S ES P + EKm越越小小，亲和力越，亲和力越强。强。SS很小时，反应速度就能达到很大。很小时，反应速度就能达到很大。性能优，代谢中这类酶更为重要性能优，代谢中这类酶更为重

44、要k2k3时时Km值表示酶与底物之间的亲和程度值表示酶与底物之间的亲和程度 KmKm值可以判断酶的专一性和天然底物值可以判断酶的专一性和天然底物：有有的酶可作用于几种底物，因此就有几个的酶可作用于几种底物，因此就有几个KmKm值，其中值，其中KmKm值最小的底物称为该酶的最适值最小的底物称为该酶的最适底物底物，也就是天然底物。也就是天然底物。 KmKm愈小，达到最大反应速率一半所需要的愈小，达到最大反应速率一半所需要的底物浓度就愈小底物浓度就愈小 ，底物最适。底物最适。Km值表示酶与底物之间的亲和程度值表示酶与底物之间的亲和程度Km值可以帮助推断某一代谢反应的方向和途径值可以帮助推断某一代谢反

45、应的方向和途径在可逆反应中，两个在可逆反应中，两个Km值中最小值中最小的反应方向的反应方向是该酶促反应的是该酶促反应的主要方向主要方向.如果代谢途径各酶的如果代谢途径各酶的Km已知，已知，Km最大最大的酶的酶是是限速酶限速酶.4 4、VmaxVmax和和k k3 3（k kcatcat) )的意义的意义定义：定义：Vmax是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度成是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度成 正比。正比。 意义：意义：Vmax=K3 E如果酶的总浓度已知，可从如果酶的总浓度已知，可从Vmax计算计算酶的转换数酶的转换数，即动力学常数即动力学常数K3。即单位时间内每个酶分子催化底物

46、转即单位时间内每个酶分子催化底物转变为产物的分子数。变为产物的分子数。l 底物浓度对酶促反应速率的影响内容回顾l Km的概念及意义u 概念：当酶促反应速度达到最大反应速度概念：当酶促反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度一半时的底物浓度. .u 物理意义：酶的物理意义：酶的特征性常数特征性常数，只有酶的性，只有酶的性质有关，与酶的浓度无关质有关，与酶的浓度无关. .5、 Km和和Vmax的测定的测定（1）Lineweaver-Burk双倒数作图法双倒数作图法将米氏方程改写成：将米氏方程改写成： maxmaxmV1S1VKv1 -4-202468100.00.20.40.60.81.01/S(

47、1/mmol.L-1)1/v1/Vmax斜率斜率=Km/Vmax-1/Km（2）v对对 作图（作图（Eadie-Hofstee法）法） SvmaxmVSvKv Eadie-Hofstee方程式：方程式：maxmmaxVKSV1vS （3）S/v对对S作图（作图（Hanes-Woolf法）法） 小结小结SKSVvmmax 米氏方程米氏方程maxmaxmV1S1VKv1 根据下图所给出的动力学数据，查出该酶的根据下图所给出的动力学数据，查出该酶的Km值是多少？（值是多少？（ ）-4 -2 0 2 4 6 76543211/S1/v借助米借助米-曼氏方程曼氏方程VmaxS/(KmS)研究研究底物浓度

48、对酶反应速度影响的一种有用的方法是，底物浓度对酶反应速度影响的一种有用的方法是，在规定的实验条件下检验这个方程。在下述条件在规定的实验条件下检验这个方程。在下述条件下，方程呈什么形式？下，方程呈什么形式？当当S=Km时；时；当当SKm时；时；当当SKm时。时。 米氏常数随酶浓度增加而变大。（ ）酶促反应的米氏常数与所催化反应的底物无关（ ）.三三. 多底物的酶促反应（了解）多底物的酶促反应（了解）1.酶促反应按底物分子数分类酶促反应按底物分子数分类 分为单底物、双底物和三底物反应分为单底物、双底物和三底物反应2.多底物反应按动力学机制分类多底物反应按动力学机制分类 （1）序列反应或单置换反应）

49、序列反应或单置换反应随机单置换反应（随机单置换反应（random reactions）如肌酸激酶使肌酸磷酸化的反应如肌酸激酶使肌酸磷酸化的反应AB有序反应（有序反应（ordered reactions）领先领先底物底物释放释放释放释放A和和Q竞争地与自由酶结合竞争地与自由酶结合(2)(2)乒乓乒乓反反应应或或双双置换置换反反应应 A AE PE P E E Q EQ EB B A和和Q竞争自由酶竞争自由酶E形式形式 B和和P竞争修饰酶形式竞争修饰酶形式E A和和Q不同不同E结合结合 B和和P也不与也不与E结合。结合。AQ3.3.双底物反应的动力学方程双底物反应的动力学方程（1 1）序列机制序列

50、机制的底物动力学方程及动力学图的底物动力学方程及动力学图 在在B的浓度达到饱和时的浓度达到饱和时A的米氏常数的米氏常数 在在A的浓度达到饱和时的浓度达到饱和时B的米氏常数的米氏常数 底物底物A与酶结合的解离常数与酶结合的解离常数 底物底物A、B都达到饱和时最大反应速率都达到饱和时最大反应速率（2 2）乒乓机制的底物动力学方程及动力学图）乒乓机制的底物动力学方程及动力学图 在在B的浓度达到饱和时的浓度达到饱和时A的米氏常数的米氏常数 在在A的浓度达到饱和时的浓度达到饱和时B的米氏常数的米氏常数 底物底物A、B都达到饱和时最大反应速率都达到饱和时最大反应速率四、四、 影响酶促反应速率的其他因素影响

51、酶促反应速率的其他因素影响酶促反应速度的因素：影响酶促反应速度的因素：u酶浓度酶浓度Eu底物浓度底物浓度SupH u反应温度反应温度u激活剂激活剂Au抑制剂抑制剂I 酶浓度对反应速度的影响酶浓度对反应速度的影响当当SSEE，反应速，反应速度与酶浓度成正比。度与酶浓度成正比。0 V E 关系式为：关系式为：V = KV = K3 3 E E（一）（一）pH对酶促反应的影响对酶促反应的影响1、酶反应的最适、酶反应的最适pH 在一定的在一定的pH pH 下下, , 酶具有最酶具有最大的大的催化活性催化活性, ,通常称此通常称此pH pH 为最适为最适 pHpH。反反应应速速度度pH最最适适p pH

52、H68100 酶的最适酶的最适pH不是一个固定的常数不是一个固定的常数，它受到底，它受到底物的种类、浓度物的种类、浓度; 缓冲液的种类、浓度缓冲液的种类、浓度; 酶的纯度酶的纯度;反应的温度、时间等的影响。反应的温度、时间等的影响。例例: 碱性磷酸酶催化磷酸苯酯水解时碱性磷酸酶催化磷酸苯酯水解时 s为为2.5x10-5 M，最适，最适pH为为 8.3 s为为2.5x10-2 M，最适，最适pH为为10.0 2、pH影响反应速度的原因影响反应速度的原因 极端的极端的pH引起酶蛋白的引起酶蛋白的变性变性，因而使酶的，因而使酶的活力丧失活力丧失；pH的改变影响酶分子上酸性及碱性的改变影响酶分子上酸性

53、及碱性AA残残基的基的侧链基团的解离状态侧链基团的解离状态；pH的改变也影响的改变也影响底物的解离状态底物的解离状态。（二）温度对酶促反应的影响（二）温度对酶促反应的影响上图反映出温度如何影响酶活力？上图反映出温度如何影响酶活力？产产物物累累积积量量相相对对酶酶活活力力 最适温度最适温度 最适温度最适温度w动物酶动物酶 3540w植物酶植物酶 4050w微生物微生物 大部分大部分 4050w个别高温菌个别高温菌 90以上以上最适温度（最适温度（optimum temperature） 酶表现酶表现活活力最大力最大时时的温度为的温度为最适温度最适温度 最适温度不是一个固定的常数最适温度不是一个固

54、定的常数，它随底物，它随底物的种类、浓度的种类、浓度, 溶液的离子强度溶液的离子强度, pH, 反应时间反应时间等的影响。等的影响。例例: 反应时间短，最适温度高。反应时间短，最适温度高。 反应时间长，最适温度低。反应时间长，最适温度低。（三）激活剂对酶促反应的影响（三）激活剂对酶促反应的影响1、概念：、概念：使酶由无活性变为有活性或使酶活性增加使酶由无活性变为有活性或使酶活性增加的物质。的物质。 2、种类：、种类：大多数的大多数的无机离子无机离子、一些小分子的、一些小分子的有机有机化合物化合物以及以及生物大分子。生物大分子。 -必需激活剂必需激活剂(essential activator)

55、-非必需激活剂非必需激活剂(non-essential activator)五、酶的抑制作用（重点）五、酶的抑制作用（重点）（一）抑制作用的概念（一）抑制作用的概念1、概念、概念u凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白变性的物质统称为酶的抑制剂。变性的物质统称为酶的抑制剂。u抑制剂对酶有一定选择性，而变性的因素抑制剂对酶有一定选择性，而变性的因素对酶没有选择性。对酶没有选择性。w失活作用失活作用：使酶：使酶Pr变性而引起酶活力丧失。变性而引起酶活力丧失。w抑制作用抑制作用：使酶活力下降但不引起变性。：使酶活力下降但不引起变性。2、抑制与失活的比较、抑制与失活的

56、比较3、抑制程度的表示方法（了解）、抑制程度的表示方法（了解）（1 1）相对活力）相对活力a =v iv 0 Vi V0Vi：有：有I存在下的反应初速率存在下的反应初速率V 0：无：无I时的初速率时的初速率2.2.抑制分数抑制分数指被抑制而失去活力的分数指被抑制而失去活力的分数i=1a=1viv0 Vi V0（二）抑制作用的类型（掌握）（二）抑制作用的类型（掌握）根据抑制作用是否可逆根据抑制作用是否可逆: : 1 1）不可逆抑制作用）不可逆抑制作用: : 抑制剂与酶的必需基团以抑制剂与酶的必需基团以共价共价键结合键结合而引起酶活力丧失，不能用透析、超滤等物而引起酶活力丧失，不能用透析、超滤等物

57、理方法除去抑制剂而使酶复活的作用理方法除去抑制剂而使酶复活的作用. . 2 2）可逆抑制作用）可逆抑制作用: : 抑制剂与酶以抑制剂与酶以非共价键非共价键结合而引结合而引起酶活力降低或丧失，能用物理方法除去抑制剂而起酶活力降低或丧失，能用物理方法除去抑制剂而使酶复活，抑制作用是使酶复活，抑制作用是可逆可逆的的. .（三）可逆性抑制作用（三）可逆性抑制作用三种类型三种类型 竞争性抑制竞争性抑制非竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制反竞争性抑制1、竞争性抑制、竞争性抑制（1 1）竞争性抑制作用）竞争性抑制作用l定义：抑制剂与底物的结构相似，能与底物定义：抑制剂与底物的结构相似，能与底物竞争酶的活性中

58、心，从而阻碍酶底物复合物的竞争酶的活性中心，从而阻碍酶底物复合物的形成，使酶的活性降低。形成，使酶的活性降低。l竟争性抑制通常可以通过增大底物浓度，即竟争性抑制通常可以通过增大底物浓度，即提高底物的竞争能力来消除。提高底物的竞争能力来消除。竞竞争争性性抑抑制制剂剂SEIEI=K4K5Ki=K5 K4EII+K3K2K1E+SESE+PV=VmaxS(1+I/Ki)Km+S抑制剂常数抑制剂常数有竞争性抑制剂存在时，有竞争性抑制剂存在时，Km值增大值增大(1+I/Ki)倍，且倍，且Km值随值随I的增高而增大；的增高而增大；在在E固定时，当固定时，当S Km (1+I/Ki), Km (1+I/Ki

59、)项可忽略不计，则项可忽略不计，则v= Vmax，即最大反应速度不变。即最大反应速度不变。 竞争性抑制作用的速度方程：竞争性抑制作用的速度方程：v=VmaxSKm(1+I/Ki)+S1v=Km Vmax(1+ ) +IKi1 S1 Vmax I 正常正常1v1 S1 Vmax-1Km(1+ )I Ki-1 Km竞争性抑制动力学曲线竞争性抑制动力学曲线l I与与S分子结构相似；分子结构相似；l Vmax 不变，不变，Km增大；增大；l 抑制程度取决于抑制程度取决于I与与E的亲和力的亲和力 以及以及I和和S的相对比例；的相对比例；l 增大增大S可减轻或消除抑制作用可减轻或消除抑制作用.琥珀酸延胡索

60、酸草酸盐草酰乙酸丙二酸戊二酸琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶FAD例例1:1:丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制例例2 2：磺胺药对细菌：磺胺药对细菌FHFH2 2合成酶的抑制合成酶的抑制Glu +H2NCOOH +二氢蝶呤FH2FH4H2NSO2NHR磺胺药氨甲蝶呤PABAFH2还原酶FH2合成酶例例3. 3. 抗代谢物的抗癌作用抗代谢物的抗癌作用内容回顾：内容回顾：l 底物浓度对酶促反应速度的影响底物浓度对酶促反应速度的影响 酶浓度对反应速度的影响酶浓度对反应速度的影响当当SSEE，反应速，反应速度与酶浓度成正比。度与酶浓度成正比。0 V E 关系式为：关系式为：V = KV =