南京农业大学生物化学课件

1、第第3节节 核酸的理化性质核酸的理化性质一一 物理性质物理性质 DNADNA为白色纤维状固体为白色纤维状固体; ; RNARNA为白色粉末状固体为白色粉末状固体? ? 1、形态2、溶解性 微溶于水，不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般的有微溶于水，不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般的有机溶剂；机溶剂；DNADNA在溶液中粘度大，在溶液中粘度大，RNARNA粘度小。粘度小。 核酸既含有核酸既含有酸性的磷酸基团，又含有弱碱性的酸性的磷酸基团，又含有弱碱性的碱基，碱基，故可发生两性解离。其解离状态随溶液的故可发生两性解离。其解离状态随溶液的pHpH值而改变。值而改变。 核酸的理化性质核酸的理化性质3 3、两性解离

2、、两性解离 由于磷酸基团的酸性很强，所以由于磷酸基团的酸性很强，所以pIpI较低较低，整个分，整个分子相当于多元酸。子相当于多元酸。 利用核酸的两性解离可以通过调节核酸溶液的等利用核酸的两性解离可以通过调节核酸溶液的等电点来沉淀核酸，也可通过电泳分离纯化核酸。电点来沉淀核酸，也可通过电泳分离纯化核酸。 嘌呤和嘧啶具有共轭双键，能强烈吸收紫外光。嘌呤和嘧啶具有共轭双键，能强烈吸收紫外光。在在260260nmnm处有最大吸收峰。对于纯的处有最大吸收峰。对于纯的DNADNA或或RNARNA，可可以通过测得以通过测得A A260260来测定核酸的含量。来测定核酸的含量。纯的纯的DNADNA：A260/

3、 A280 =A260/ A280 =1.81.8 纯的纯的RNARNA：A260/ A280 =A260/ A280 =2.02.0二二 紫外吸收性质紫外吸收性质 A260/ A280A260/ A280值值可以反映核酸的纯度。可以反映核酸的纯度。 核酸的理化性质核酸的理化性质 核酸变性后，在核酸变性后，在260260nmnm处的吸收值上升，这叫处的吸收值上升，这叫增色效应增色效应( (hyperchromic effect) )。增色效应常增色效应常可用来衡量可用来衡量DNADNA变性的程度。变性的程度。三三 核酸的变性核酸的变性 核酸在某些物理或化学因素的作用下，其核酸在某些物理或化学因

4、素的作用下，其空间空间结构结构发生改变，从而引起理化性质的改变及生物活发生改变，从而引起理化性质的改变及生物活性的降低或丧失叫性的降低或丧失叫变性变性。引起变性的因素有：加热。引起变性的因素有：加热、酸碱、尿素、甲醛等。、酸碱、尿素、甲醛等。1.增色效应 核酸的理化性质核酸的理化性质DNA分子变性分子变性( DNA denaturation ) D.S. DNAS.S. DNA ( 加温加温, 极端极端pH, 尿素尿素, 酰胺酰胺 ) 变性过程的表现变性过程的表现 S.S. DNA粘度降低粘度降低 S.S. DNA 沉降速度加快沉降速度加快 S.S. DNA分子的分子的A 260 nm UV

5、值上升值上升 ( Hyperchromicity ) 热变性中光吸收达到最大吸收（完全变性）一热变性中光吸收达到最大吸收（完全变性）一半（双螺旋结构失去一半）时的温度称为半（双螺旋结构失去一半）时的温度称为DNADNA的熔的熔点或熔解温度（点或熔解温度（TmTm）。2. 熔解温度 核酸的理化性质核酸的理化性质三三 核酸的变性核酸的变性热变性曲线热变性曲线 ( (熔解曲线熔解曲线) )图5-26 Tm的示意图在在DNADNA发生热变性发生热变性的过程中，的过程中，A A260260随随温度的变化曲线。温度的变化曲线。 核酸的理化性质核酸的理化性质1.1851.01.37ODConcentrati

6、on 50 g/mL D.S DNA A260 = 1S.S DNA A260 = 1.37dNTPs A260 = 1.60 Tm = OD增加值的中点温度增加值的中点温度(一般为一般为85-95) Tm值与值与DNA的的均一性均一性、G-C含量含量、介质离子强介质离子强度度、pH等因素有关。等因素有关。 核酸的理化性质核酸的理化性质三三 核酸的变性核酸的变性 Marmur-Doty Formula Evaluation GC% of DNA 1x SSCGC% = 30 70% ( 0.15 M Nacl + 0.015 M Sodium Limonate )Tm1 Tm21.01.185

7、1.37ODwhat is meaning ?Tm = 69.3 + 0.41 GC% l 增色效应的跳跃现象增色效应的跳跃现象 ( Jump of Hyperchromicity ) 高分子量的高分子量的DNADNA分子在热变性过程中分子在热变性过程中, , 富含富含ATAT区区域首先发生域首先发生 变性变性, , 然后逐步扩展然后逐步扩展, , 表现增色效应的表现增色效应的跳跃现象跳跃现象, , 使变形过程加快使变形过程加快. . rich AT rich AT 影响影响 Tm值的因素值的因素 在在 A, T, C, G 随机分布的情况下随机分布的情况下 GC%含量相同的情况下含量相同的情

8、况下GC%愈高愈高 Tm值愈大值愈大 GC%愈低愈低 Tm 值愈小值愈小 AT形成变性核心，变性加快，形成变性核心，变性加快，Tm 值小值小碱基排列对碱基排列对Tm值具有明显影响值具有明显影响（除变性核心外）（除变性核心外） 5 CG 3 GC n 5 GC 3 CG n 5 TA 3 AT n5 AT 3 TA n碱基堆积面碱基堆积面 和和 碱基积压程度的差异碱基积压程度的差异 例：常温下，活体内例：常温下，活体内 D.S DNA分子中富含分子中富含AT的变性的变性 核心区（核心区（promoter, terminator region ） 常表现氢键的断裂与形成的常表现氢键的断裂与形成的

9、“DNA呼吸现象呼吸现象”37.6 57 Tm碱基排列对碱基排列对Tm值具有明显影响值具有明显影响 大片段大片段D.S DNA分子之间比较分子之间比较片段长短对片段长短对Tm值的影响较小值的影响较小, , 但与组成和排列相但与组成和排列相关关 小于小于100bp 的的 D.S DNA分子比较分子比较片段愈短，片段愈短， 变性愈快，变性愈快，Tm值愈小值愈小 变性液中含有尿素，酰胺等变性液中含有尿素，酰胺等尿素，酰胺与碱基间形成氢键尿素，酰胺与碱基间形成氢键 改变碱基对间的氢键改变碱基对间的氢键 Tm 值值 可降至可降至40左右左右 盐浓度的影响盐浓度的影响 单链单链DNA主链的磷酸基团主链的磷

10、酸基团负电荷的静电斥力负电荷的静电斥力两条单链两条单链DNA的分离的分离 Na+在磷酸基团周围形成的电子云在磷酸基团周围形成的电子云对静电斥力产生屏蔽作用对静电斥力产生屏蔽作用减弱静电斥力减弱静电斥力Tm 当当Na+浓度低浓度低屏蔽作用小屏蔽作用小斥力加强斥力加强Tm TmOD A260 静电斥力静电斥力 0.01M0.1M1.0MNa+当当Na+浓度高浓度高 屏蔽作用大屏蔽作用大斥力减弱斥力减弱熵值熵值(S)上升上升碱基溶解性降低碱基溶解性降低疏水作用力增加疏水作用力增加 pH 12 酮基酮基 烯醇基烯醇基pH 2-3NH2 NH3+ (质子化质子化) 改变氢键的形成与结合力改变氢键的形成与

11、结合力极端极端pH条件的影响条件的影响一切减弱氢键，一切减弱氢键， 碱基堆积力的因素碱基堆积力的因素 均将使均将使Tm 值降低值降低四四 核酸的复性核酸的复性1.复性 (renaturation) DNADNA水溶液加热变性时，双螺旋两条链分开；如水溶液加热变性时，双螺旋两条链分开；如果缓慢冷即，两条链可以完全重新结合成各原来一果缓慢冷即，两条链可以完全重新结合成各原来一样的双股螺旋过程。样的双股螺旋过程。复性是变性的逆转。但需要一定的条件，要在复性是变性的逆转。但需要一定的条件，要在一定的盐浓度下缓慢降温。一定的盐浓度下缓慢降温。 核酸的理化性质核酸的理化性质DNA 分子的复性分子的复性 (

12、anneal or renaturation) D.S DNAS.S DNADenaturation Renaturation 复性过程依赖于单链分子间的随机碰撞复性过程依赖于单链分子间的随机碰撞 ( Depends on the collision of complementary S.S. DNA ) 2. 减色效应( (hypochromic effect)hypochromic effect) 当变性的当变性的DNADNA经复性以重新形成双螺旋结构时，经复性以重新形成双螺旋结构时，其溶液的其溶液的A A260260值则减小，这种现象称为减色效应。值则减小，这种现象称为减色效应。 核酸的

13、理化性质核酸的理化性质四四 核酸的复性核酸的复性 影响影响DNA复性过程的因素复性过程的因素 ： 阳离子浓度阳离子浓度 0.18 0.2M Na+ 可消除可消除polydNt 间的静电斥力间的静电斥力 复性反应的温度复性反应的温度 Tm - 25 (60-65) 以消除以消除S.S. DNA 分子内的部分二级结构分子内的部分二级结构 S.S, DNA 的初始浓度的初始浓度 C0 DNA 分子中分子中, dNt 的排列状况的排列状况 (随机排列随机排列, 重复排列重复排列) S.S. DNA分子的长度分子的长度S.S. DNA愈长愈长S.S. DNA愈短愈短 分子扩散愈慢分子扩散愈慢 复性愈慢复

14、性愈慢 分子扩散愈快分子扩散愈快 复性愈快复性愈快复性发生的过程讨论复性发生的过程讨论遵循second order kinetics formula （二级反应动力学）二级反应动力学）dCt / dt = -KCt2 两条部分同源的两条部分同源的S.S. DNA, 在复性过程中形成的部分在复性过程中形成的部分 双链区是不稳定的双链区是不稳定的 单链单链DNA的随机碰撞的随机碰撞 过程（过程（ randomly collision ）反应初始反应初始 t = 0单链单链 DNA浓度浓度 = C0反应达反应达 t 时时单链单链DNA浓度浓度 = Ct dCt / dt = -KCt2 积分积分 C

15、t / C0 = 1 / 1+KC0t 当当 Ct / C0 = 1/2 时时Ct / C0 = 1/2 = 1 / 1+ KC0t(1/2)K = 1 / Cot(1/2)Cot(1/2) = 1/K (mol. Sec / L) 不同的不同的DNA Cot 是不同的，是不同的， Cot 不但与不但与K值有关，也与值有关，也与DNA的复杂性有关；的复杂性有关； K值取决于阳离子浓度、温度、片断大小及值取决于阳离子浓度、温度、片断大小及DNA分子复杂性；分子复杂性； 如果将其它因子固定，则如果将其它因子固定，则K与复杂性与复杂性X的关的关系为：系为： K=1/X, 所以，所以， Cot =1/

16、K =X：Cot(1/2) = 1/K (mol. Sec / L) 复杂性复杂性(X)-DNA中没有重复碱基的排列顺中没有重复碱基的排列顺序的数值。序的数值。e.g. (A)n, X =1; (AT)n, X =2; (AGC)n, X =3; (AGCT)n, X =4; (AGCTG)n, X =5; Cot 代表代表DNA顺序的复杂程度。顺序的复杂程度。Cot(1/2) = 1/K (mol. Sec / L)3. 分子杂交 (hybridization) 核酸的理化性质核酸的理化性质四四 核酸的复性核酸的复性 不同来源的单链不同来源的单链DNA与单链与单链DNA RNA与与 单链单链

17、DNA分子间分子间 在长于在长于20 bp的同源区域内的同源区域内 以氢键连接方式互补配对以氢键连接方式互补配对 形成稳定的双链结构的过程形成稳定的双链结构的过程3. 分子杂交 (hybridization) 核酸的理化性质核酸的理化性质四四 核酸的复性核酸的复性 DNADNA链在复性时，其中的一条单链可以内异体链在复性时，其中的一条单链可以内异体DNADNA单链，按照碱基互补原则合成一段单链，按照碱基互补原则合成一段DNA-DNADNA-DNA或或DNA-RNADNA-RNA双链的过程。双链的过程。3. 分子杂交 (hybridization) 核酸的理化性质核酸的理化性质四四 核酸的复性核

18、酸的复性杂交检测杂交检测 D.S. DNAX-filmColumn absorb D.S DNAp32 or biotinlabeledS.S. DNA ( as probe) S.S. DNA 种类种类 液相分子杂交液相分子杂交 固相分子杂交固相分子杂交 （1975 1975 E. M. SouthernE. M. Southern） 1975 1975 E. M. SouthernE. M. Southern 1977.1977. J.C. AlwineJ.C. Alwine 1978. 1978. Hany TowbinHany Towbin 原位分子杂交原位分子杂交 (In situ

19、hybridization ) Southern blotNorthern blotWestern blotS.S. DNA S.S. DNA S.S. RNA S.S. DNAProtein antibodySouthern BlottingNorthern BlottingWestern Blotting 五五 DNA 一一 级级 结结 构构 分分 析析 （DNA sequencing ） 1972. Herbert Boyer1972. Herbert Boyer 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶II (RE-II) Sanger C.Sanger C. “ , ” 法法 Maxam G

20、ilbert Maxam Gilbert 化学定序法化学定序法 Sanger C.Sanger C. ddNTP(酶酶)法法 1. 历史历史 (1) Chemical (1) Chemical sequencingsequencing G系统；系统； pH 8.0 硫酸二甲酯硫酸二甲酯 G m7G C8N9断裂断裂 脱脱G A+G系统；系统；pH 2.0 哌啶甲酸哌啶甲酸（pidinepidine） 嘌呤环嘌呤环 N质子化质子化 脱嘌呤脱嘌呤 C系统；系统； 1.5 mol/L NaCl C + 肼（肼（hydrazinehydrazine） 脱脱C T + C系统；系统； 肼肼( (hydrazine)hydrazine) 打开嘧啶环打开嘧啶环 重新重新5C环化环化脱嘧啶脱嘧啶 2. 方法方法Chemical sequencingChemical sequencing G系统系统 脱脱G A+G系统系统 脱嘌呤脱嘌呤 C系统系统 脱脱C T + C系统系统 脱嘧啶脱嘧啶 AACAGCTTCA(2) 双脱氧法双脱氧法 H H N 4ddNTP系统中系统中DNA链均终止链均终止在在