基因的体外重组和转化

1、会计学1基因的体外重组和转化基因的体外重组和转化第1页/共63页第1页/共63页第2页/共63页第2页/共63页第3页/共63页1.同种酶产生的黏末端的连接第3页/共63页第4页/共63页第4页/共63页第5页/共63页第5页/共63页第6页/共63页第6页/共63页第7页/共63页第7页/共63页第8页/共63页第8页/共63页第9页/共63页DNA连接酶讨论： 连接后的重组分子还能被这两种限制酶切割么？第9页/共63页第10页/共63页第10页/共63页第11页/共63页第11页/共63页第12页/共63页 第12页/共63页第13页/共63页第13页/共63页第14页/共63页第14页/

2、共63页第15页/共63页第15页/共63页第16页/共63页第16页/共63页第17页/共63页第17页/共63页第18页/共63页第18页/共63页第19页/共63页第19页/共63页第20页/共63页第20页/共63页第21页/共63页第21页/共63页第22页/共63页第22页/共63页第23页/共63页第23页/共63页第24页/共63页IBamHI第24页/共63页第25页/共63页第25页/共63页第26页/共63页第26页/共63页第27页/共63页（1）在引物上添加酶切位点第27页/共63页第28页/共63页第28页/共63页第29页/共63页！注意添加保护序列nPrimer

3、1: 5 GCGGggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAnPrimer2: 5 GCGGggatccTCTTGTACAGCTCGTCCATGCC引入的酶切位点是单一的第29页/共63页第30页/共63页第30页/共63页第31页/共63页35T载体载体35载体载体T3535AAPCR产物产物第31页/共63页第32页/共63页Taq 酶PCR扩增+335PCR产物产物AA5T载体载体TT5533连接连接转化转化蓝白筛选蓝白筛选 目的片段目的片段第32页/共63页第33页/共63页第33页/共63页第34页/共63页第34页/共63页第35页/共63页第35页/共63页第36页/

4、共63页第36页/共63页第37页/共63页第37页/共63页第38页/共63页第38页/共63页第39页/共63页第39页/共63页第40页/共63页第40页/共63页第41页/共63页第41页/共63页第42页/共63页第42页/共63页第43页/共63页 CaCl2 第43页/共63页第44页/共63页第44页/共63页第45页/共63页第45页/共63页第46页/共63页第46页/共63页第47页/共63页转化项目CaCl2受体菌DNA液体LB皿a阳性对照10ulPBR322DNA100ul 1b阴性对照10ul2ul连接液100ul 2c阴性对照10ul100ul 3d连接液转化组6

5、0ul6ul连接液600ul 4具体操作：具体操作：冰浴30；42 2 ；冰浴2 ；加37预热LB培养45；表中a、b、c各取100ul/皿涂布，连接液转化组d梯度涂布 I 50ul2皿；II.500ul浓缩后2皿）37倒置培养过夜 ；检查细菌生长情况。第47页/共63页第48页/共63页 质粒的质量和浓度质粒的质量和浓度 试剂的质量试剂的质量 杂菌和杂杂菌和杂DNA的污染的污染 第48页/共63页第49页/共63页第49页/共63页第50页/共63页第50页/共63页第51页/共63页第51页/共63页第52页/共63页第52页/共63页第53页/共63页第53页/共63页第54页/共63页第54页/共63页第55页/共63页第55页/共63页第56页/共63页第56页/共63页第57页/共63页第57页/共63页第58页/共63页Taq 酶PCR扩增+335PCR产物产物AA5T载体载体TT5533连接连接转化转化蓝白筛选蓝白筛选 目的片段目的片段第58页