基因工程的下游技术重组蛋白的表达纯化和分析

1、基因工程的下游技术重组蛋白的表达纯化和分析 重组蛋白的表达表达体系： 表达载体 原核 受体细胞 真核第1页/共86页第2页/共86页选择表达载体常用的关键元件：启动子和调节序列（表达强弱、细胞或组织特异性、表达调节等，如本实验的乳糖操纵子。）融合基因（纯化、标签，或增强蛋白可溶性等。如多聚His标签6His，便于镍柱亲和层析纯化。GST融合蛋白用GST柱亲和层析）分泌信号筛选标记其它第3页/共86页6His第4页/共86页 重组蛋白的纯化亲和层析离子交换层析凝胶过滤层析 第5页/共86页 本单元实验流程：细菌（pEF-GFPuv） 亲和层析IPTG诱导细菌总蛋白重组蛋白融合蛋白乳糖操纵子的特性

2、SDS-PAGE初步分析第6页/共86页实验十 重组DNA在大肠杆菌中的诱导表达第7页/共86页一实验目的二实验原理三材料与试剂四实验仪器五操作步骤六注意事项七实验安排八思考与讨论第8页/共86页一实验目的了解和掌握IPTG诱导表达的原理。了解降解物阻遏的现象及其机理。第9页/共86页二实验原理操纵子是基因表达的协调单位。通常由2个以上功能相关的结构基因以及一些调节序列（如启动子序列、操纵序列等）组成。乳糖操纵子由三个结构基因Z、Y、A和操纵序列、启动子、CAP结合位点等调节序列组成。第10页/共86页 乳糖操纵子的诱导表达l 当没有乳糖存在时，调节基因lacI表达，转录的mRNA翻译成阻遏蛋

3、白。阻遏蛋白与操纵序列lacO结合，阻碍了结合在旁边启动子的RNA聚合酶向前移动，使结构基因不能转录，也就不能翻译出蛋白质。也就是说，当没有乳糖存在时，乳糖操纵子处于阻碍状态。第11页/共86页 乳糖操纵子的诱导表达（续）l 当有乳糖存在时，乳糖转化为异乳糖，异乳糖作为诱导物与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白的构象发生改变，而不能结合到操纵序列上，RNA聚合酶可以从启动子向3端移动，于是，结构基因可以转录出mRNA，然后翻译出蛋白质。也就是说，当有乳糖存在时，乳糖操纵子被诱导。l 乳糖操纵子的诱导物是异乳糖。IPTG是异乳糖的结构类似物。由于IPTG不会被分解，它的诱导作用是持久的。第12页/共86页

4、 乳糖操纵子的诱导表达（续）l 本实验所使用的表达载体上含有乳糖操纵子的调节序列，目的基因为绿色荧光蛋白基因。在IPTG的诱导下，目的基因表达可增强105倍。然而，诱导表达常常受到温度和诱导物的影响。第13页/共86页 乳糖操纵子的降解物阻遏l 当细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基中生长时，通常优先利用葡萄糖，而不利用乳糖。只有当葡萄糖耗尽后，细菌才能充分利用乳糖，这种现象称葡萄糖效应，其实质是由葡萄糖降解物引起的阻遏作用，所以又称降解物阻遏（catabolic repression）。第14页/共86页 乳糖操纵子的降解物阻遏（续）l 降解物阻遏的机理：代谢物基因激活蛋白（Catabolite

5、gene Activation Protein，CAP），又称cAMP受体蛋白（cAMP Receptor Protein，CRP）属于激活蛋白的一种，对乳糖操纵子进行正调节。 CAP分子内分别有DNA结合区和cAMP结合区。当CAP与cAMP结合后，就可结合到CAP结合位点上，促进转录。 葡萄糖降解物能抑制腺苷酸环化酶的活性，并活化磷酸二酯酶的活性，从而降低cAMP的浓度，抑制转录。第15页/共86页 阻遏蛋白负调节与CAP正调节的协调 当阻遏蛋白封闭转录时，CAP对该系统不能发挥作用；而没有CAP存在时，即使没有阻遏蛋白与操纵序列结合，操纵子仍无转录活性。只有在CAP存在且没有阻遏蛋白与操

6、纵序列结合时，或者说只有高乳糖低葡萄糖时，操纵子发挥最大转录活性。 这种协调与细菌对碳源的优先利用相一致。第16页/共86页The structure of lac operon调节序列结构基因第17页/共86页Repressor and negative regulation第18页/共86页异乳糖第19页/共86页异丙基硫代半乳糖苷异乳糖第20页/共86页第21页/共86页CAP and positive regulation第22页/共86页 低乳糖时 高乳糖时在协调调节下，lac operon的强诱导作用发生在高乳糖、低葡萄糖的状态。第23页/共86页三材料与试剂1.材料 含pUC18

7、质粒工程菌及含pGFPuv质粒工程菌。2.试剂LB 液体培养基 ： 蛋白胨（tryptone）10g、酵母粉（yeast extract）5g、NaCl 10g，加800mL双蒸水溶解，用10M NaOH调pH至7.2-7.5，定容至1000mL。 分装，高压灭菌，4保存。第24页/共86页氨苄青霉素溶液： 无 菌 双 蒸 水 配 成 1 0 0 m g / m L ， 分 装 ， - 2 0 保 存 ， 使 用 终 浓 度 为 5 0 g / m L 或100g/mL。IPTG溶液： 将238.3mg IPTG溶解于10mL双蒸水，0.22m细菌滤器过滤除菌，分装，-20保存备用，贮存浓度为

8、100 mM。20%葡萄糖溶液： 20g葡萄糖溶解于适量双蒸水，定容至100mL，121，15min 灭菌，4保存。第25页/共86页四实验仪器 超净工作台、 恒温摇床、离心机等。第26页/共86页五操作步骤1.挑取含pUC18质粒工程菌及含pGFPuv质粒工程菌单菌落，分别接种于含氨苄青霉（终浓度为100g/mL，以下同)的5mL的LB培养基中，于37、250rpm过夜培养12h-14h至对数生长期。2.取3支已灭菌的大试管，分别加入5mL含有氨苄青霉素的LB培养液，编号为1#，2#，3#，另取一个250mL的灭菌三角瓶，编号为6#，加入50mL含氨苄青霉素的LB培养液。第27页/共86页3

9、.1#：接50L空载工程菌（含pUC18）过夜培养物，25-28培养10 h-12h； 2#：接50L重组菌（含pGFPuv）过夜培养物，25-28培养10 h-12h； 3#：接50L重组菌（含pGFPuv ）过夜培养物，37培养至O.D600约为0.5（约3h-4h)，然后加入20%葡萄糖50L至终浓度为0.2%，及100mM IPTG 5L至终浓度为0.1mM，25-28培养8h-10h或过夜； 6#：接500L重组菌（含pGFPuv）过夜培养物，37培养至O.D600约为0.5（约3h-4h)，然后只加入100mM IPTG 50L至终浓度为0.1 mM，25-28培养8h-10h或过

10、夜。第28页/共86页4. 收集菌体。分别将1#-3#全部培养物收集到三个7mL离心管中，编上相应编号，离心弃上清；三角瓶培养的50mL菌液混匀后取5mL于7mL离心管中（编号为4#），离心，上清收集到另一个指管，编号为5#，其余的培养液用 50mL离心管于5000rpm，4，离心10min，弃上清，菌体用裂解缓冲液重悬后用超声波破碎细胞或保存于20备用（见实验十二）。 5. 于紫外灯下观察1# -5#管收集的菌体或上清液，观察哪支管有荧光，记录观察到的现象。注意：把1#和2#管置4保存。分别标Sample1和Sample2。 第29页/共86页1236pUC18pGFPuv挑取单菌落，接种于

11、5mLLBA培养基中。37过夜培养。按1:100接种对照IPTG+GlcIPTG第30页/共86页12361234525 -28培养过夜5000rpm离心，收菌体取5mL离心其余离心收菌体，提取蛋白第31页/共86页第32页/共86页第33页/共86页六注意事项1.本实验的目的是比较该重组DNA在大肠杆菌中表达时受IPTG和葡萄糖存在的影响。在转管培养及收菌时要注意各管编号要相应对好，不能混乱。 1#、2#管不加IPTG和葡萄糖。3#管除加IPTG外还加入葡萄糖（浓度要大于0.2%以上）。 6#瓶仅加IPTG 。第34页/共86页2.不同的重组DNA在不同的宿主菌中蛋白的表达量往往受到IPTG

12、浓度和培养温度的影响。在科研中一般都采用不同温度或不同浓度的IPTG来诱导，以获得最大的蛋白表达量。3.本实验所表达的绿色荧光蛋白基因，其产物在大肠杆菌中有很强的荧光。离心后收集的菌体在紫外线的照射下可见黄绿色荧光，所以把1#、2#、3#、4#沉淀菌体放在紫外灯下观察其是否有荧光以及荧光的强弱，就可判断其是否有表达及其所表达的强度。第35页/共86页七实验安排 第一天： 上午配试剂，灭菌； 下午开始接种，约3 h-4h后开始诱导。（步骤2、3） 第二天： 收菌、紫外观察结果和拍照； 破碎细菌，分离上清，待过柱。第36页/共86页八思考与讨论1.对紫外灯下观察到的结果作出解释。2.为什么诱导表达

13、的大肠杆菌要在其OD600浓度约为0.5时加入IPTG？3.大肠杆菌的诱导表达常受哪些因素的影响？第37页/共86页实验十二 金属鳌合亲和层析分离目的蛋白质 第38页/共86页一实验目的二实验原理三材料与试剂四实验仪器五操作步骤六注意事项七实验安排八思考与讨论第39页/共86页一实验目的 学习亲和层析的原理。 掌握亲和层析法分离蛋白质的技术与操作。第40页/共86页二实验原理 以普通凝胶作载体，连接上金属离子制成螯合吸附剂，用于分离纯化蛋白质，这种方法称为金属螯合亲和层析。 蛋白质对金属离子具有亲和力是这种方法的理论依据。已知蛋白质中的组氨酸和半胱氨酸残基在接近中性的水溶液中能与镍或铜离子形成

14、比较稳定的络合物，因此，连接上镍或铜离子的载体凝胶可以选择性地吸附含咪唑基和巯基的肽和蛋白质。第41页/共86页 过渡金属元素镍在较低pH范围时（pH 6-8），有利于选择性地吸附带咪唑基和巯基的肽和蛋白质。在碱性pH时吸附更有效，但选择性降低。 金属螯合亲和层析在很大程度上，由被吸附的肽和蛋白质分子表面咪唑基和巯基的稠密程度所支配，吲哚基可能也很重要。 用IPTG诱导表达的蛋白质含有特定的组氨酸标签，这种可溶性蛋白质能用金属亲和层析法进行分离，且操作简单，快速，纯化效率高。第42页/共86页三材料与试剂1.材料 含pUC18质粒工程菌及含重组pGFPuv质粒工程菌经诱导表达的细胞裂解蛋白。2

15、.试剂0.05mol/L EDTA-0.5mol/L NaCl溶液 50mL2mol/L NaCl 溶液 50mL1mol/L NaOH溶液 50mL0.2mol/L NiSO4溶液 30mL第43页/共86页起始缓冲液：50mmol/L Tris-HCl; 500mmol/L NaCl; pH7.0 500mLChelating Sepharose Fast Flow 4-5 mL大肠杆菌细胞裂解蛋白样品 10-20mL洗涤液：50mmol/L咪唑；50mmol/L Tris-HCl； 0.5mol/L NaCl，pH 7.0洗脱液：300mmol/L咪唑；50mmol/L Tris-HCl

16、；0.5mol/L NaCl，pH7.0 第44页/共86页四实验仪器 1.5cm X 50cm层析柱、自动分部收集器、紫外分光光度计、紫外检测仪及记录仪等。第45页/共86页第46页/共86页五操作步骤1.样品的制备: 细胞的培养及荧光蛋白表达见实验十，细胞的破碎及蛋白的收集如下： 收集在25培养的细胞培养液，5000r/min，离心10min，去上清液，菌体用起始缓冲液洗涤一次，离心收集菌体，用三分之一（细胞培养液）体积（15mL）的起始缓冲液充分悬浮，冰浴下进行超声波处理，功率为400W，工作4秒，间隙4 秒，为一次，99次为一周期。共处理六周期。然后8000r/min,离心30min，

17、取上清液。放冰箱备用。第47页/共86页2. 亲和层析柱的安装 把层析柱固定在铁支架上，柱下端出口封闭。加入少量的无离子水，排去下端的空气泡。取出20%乙醇浸泡的螯合凝胶4mL到烧杯中，加入少量的无离子水制成糊状，沿着贴紧柱内壁的玻璃棒把糊状凝胶倒进柱内，打开下端的排水口，让亲和凝胶剂随水流自然沉下。亲和层析剂为4-5mL。第48页/共86页3.亲和凝胶的再生处理： 用10 倍柱体积的再生溶液（0.05mol/L EDTA、 0.5mol/L NaCl）过柱，流速3mL/min。1drops/2s! 用5倍柱体积的2 mol/L NaCl 溶液洗亲和层析柱除去多余的EDTA。流速3mL/min

18、。 用5倍柱体积的1 mol/L NaOH溶液洗涤层析柱，流速2mL/min。 用10倍柱体积的无离子水洗至pH8-9，流速3mL/min。 用2倍柱体积的0.2mol/L的硫酸镍溶液过层析柱，使凝胶金属镍离子结合, 流速2mL/min。过完后放置5 分钟。 用10倍柱体积的无离子水洗涤层析柱除去多余的镍离子。流速3mL/min。 用5 倍柱体积的起始缓冲溶液平衡层析柱，备用。第49页/共86页4. 上样： 先从15mL裂解上清液中取出50L准备用于电泳，作为亲和层析分离前上清液中的总蛋区带对照图谱（Sample3）。然后以每分钟1mL的流速上层析柱，分部收集流出液，每管3mL，（测得的OD2

19、80值曲线为穿流峰，取最高的一管样品液用作电泳，标Sample4）。再用10mL起始缓冲液过层析柱，操作同前。5. 洗涤： 用含50 mmol/L咪唑的洗涤缓冲液25mL洗脱，分部收集洗脱液，每管5mL，取中间管样品电泳（Sample5） 。第50页/共86页6. 洗脱： 用含300mmol/L咪唑的洗脱缓冲液10mL洗脱，用Ep管分部收集洗脱液。每管收0.5mL。（测得的OD280值曲线峰为目的蛋白峰GFP，标Sample6 ）。7. 12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测：进行12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测亲和层析分离纯化的结果。Sample1-6，外加Marker（见实验十一）。

20、第51页/共86页第52页/共86页 六注意事项1. 不管是装柱还是上样、洗脱，在整个操作过程中，水或溶液面都不能低于凝胶柱平面。否则，凝胶柱会产生气泡，就会影响层析效果。2. 样品上柱和洗脱过程，其流速都要慢，分离效果才好。3. 亲和层析剂可回收，经再生可循环使用。该亲和层析剂用20%20%乙醇浸泡于冰箱保存。4. 亲和层析柱在再生处理、上样、洗脱过程中其颜色都有明显变化（白、蓝、绿），只要细心操作，样品是否被吸附上去或被洗脱下来？都能观察到从而作出判断。第53页/共86页七实验安排 先用母液配制其它未配制溶液，再生镍柱；然后，过柱纯化重组蛋白。 第54页/共86页八思考与讨论1.解释IPT

21、G诱导表达的荧光蛋白经12 SDS-PAGE电泳结果图谱。2.镍柱在再生处理、上样、洗脱过程中其颜色有何变化？为什么？3.要达到好的分离效果要注意哪些问题？第55页/共86页实验十一 SDS-PAGE电泳分离蛋白质第56页/共86页一实验目的二实验原理三材料与试剂四实验仪器五操作步骤六注意事项七实验安排八思考与讨论第57页/共86页一.实验目的 1. 了解SDS-PAGE灵敏度高，分辩率强的原理。2. 用此法分析不同条件下培养的菌其荧光蛋白表达情况。 第58页/共86页二实验原理聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（acrylamide

22、,简称ACR）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（N,N-methylene bisacrylsmide 简称BIS）在催化剂的作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶，通过改变单体浓度与交联剂的比例可以得到不同孔径的凝胶。第59页/共86页聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：（1）化学聚合：催化剂采用过硫酸铵，加速剂为N、N、N、N四甲基乙二胺（简称TEMED）。通常控制这两种溶液的用量使聚合在1h内完成。（2）光聚合：通常用核黄素为催化剂，通过控制光照时间和强度来控制聚合时间也可加速反应。本实验采用化学聚合。聚丙烯酰胺凝电泳常分为二大类：第一类为连续的凝胶（仅有分离胶）电泳；第二类为不连续的凝胶（浓缩胶

23、和分离胶）电泳。第60页/共86页 通常聚丙烯酰胺凝胶（不连续）电泳有三种效应：电荷效应；（电泳物所带电荷的差异性）。 凝胶的分子筛效应。（凝胶的网状结构及电泳物的大小形状不同所致）浓缩效应，（凝胶浓度的不连续性、缓冲液离子成分的不连续性、电位梯度的不连续性以及pH的不连续性所致）。因此，样品分离效果好，分辨率高。第61页/共86页 SDS-PAGE，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）。SDS破坏蛋白质的二级和三级结构；强还原剂使半胱氨酸之间的二硫键断裂，因此，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物。这种复合物

24、由于结合大量的SDS，降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异。而由于SDS与蛋白质的结合是按大小成比例的，在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数。第62页/共86页三试剂30%的凝胶贮备液: Acr 29g + Bis 1g溶于100mL去离子水中。避光贮存棕色瓶中。3M Tris-HCl (pH8.9): 36.6g Tris-base + 48mL 1M HCl + dH2O至100mL5Tris-甘氨酸电泳buffe

25、r（pH8.3): Tris-base15.1g + 甘氨酸94g + 5gSDS + H2O至1L（用时稀释5倍）。 第63页/共86页10%SDS：10g SDS溶解于100mL去离子水中，贮存于室温中。0.5M Tris-HCl(pH6.8): 6.05g Tris-base + 48mL 1M HCl + dH2O至100mLTEMED(四甲基乙二胺):浓度10%，20 mL (共用)10% AP(过硫酸铵):10 mL，1g AP溶解于10mL去离子水中，新鲜配制。 第64页/共86页 2x样品缓冲液： 100mM Tris-HCl(pH6.8) 200mM DTT(二硫苏糖醇) 4

26、% SDS 0.2% 溴酚蓝 20% 甘油 考马斯亮蓝染色液：0.25g考马斯亮蓝R250溶于45mL甲醇中，加10mL冰醋酸 + H2O至100mL。（滤纸过滤除去不溶物） 脱色液：75mL冰乙酸 + 50mL甲醇 + 875mL H2O（如只配500mL，各物质减半）第65页/共86页四实验仪器 电泳仪、垂直板电泳装置、微量进样器（5050LL）、染色/ /脱色摇床等。第66页/共86页五操作步骤1.胶板模型的安装：在干净的带隔板的玻璃板的三条边上把橡胶条压上，然后将另一块凹形玻璃板压上，放入电泳槽中。（示范）2.12%分离胶的制备（每次配10 mL） 去离子水 3.2mL 30% 凝胶液

27、 4.0mL 3mol/L Tris-HCl(pH8.9) 2.6mL 10% SDS 0.1mL 10% APS 0.1mL TEMED 0.005mL 第67页/共86页 用手轻摇约2分钟混匀(注意不要产生气泡）,小心将混合液注入准备好的玻璃板间隙中，为浓缩胶留足够的空间，轻轻在顶层加入几毫升去离子水复盖，以阻止空气中氧对凝合的抑制作用。刚加入水时可看出水与胶液之间有界面，后渐渐消失，不久又出现界面，这表明凝胶已聚合。再静置片刻使聚合完全。 ！注意：为避免凝胶过快聚合，配胶用的无离子水、30%的凝胶液及Tris-HCl缓冲液应事先于4或冰上放置,以下同。第68页/共86页3.浓缩胶的制备：

28、先吸去已聚合好的分离胶上层的水，用水洗界面一次，再用滤纸吸干残留的水液。按下列配方制备5毫升浓缩胶溶液。混合后将其注入分离胶上端，插入梳子应小心避免气泡。 去离子水 3.2mL 30% 凝胶液 0.83mL 0.5M Tris-HCl(pH6.8) 0.75mL 10% SDS 0.050mL 10% AP 0.050mL TEMED 0.005mL第69页/共86页4.在浓缩胶聚合的同时，将样品与5样品缓冲液（16L 4L）混合，100加热3分钟以变性蛋白质。Sample1,2用600L起始缓冲液悬浮，取16L同上操作。5.浓缩胶聚合完全后，小心地拔出梳子，用无离子水冲洗梳孔，将凝胶模板放入

29、电泳槽上固定好，上下槽均加入1X电泳缓冲液，检查有无漏液，除去两玻璃板间凝胶底部的气泡，上样前用上槽缓冲液冲洗梳子孔。6.按次序上样：用微量进样器往凝胶梳孔中加样品混合液，20L/孔，一孔加一个样品，同时安排已知分子量的标准物作对照。第70页/共86页7.电泳：开始时浓缩胶电压为80V，染料进入分离胶后，将电压增到120V，继续电泳至染料（溴酚蓝）到分离胶底部，断开电源。8固定及染色：取下凝胶放入大培养皿，用考马斯蓝染色液固定并染色 ，最好放在摇床缓慢转动30min 。9脱色：先用水洗去染料，再放入脱色液中浸泡，更换1-2次，至条带清晰，背景呈淡蓝色，然后换脱色液，至背景清晰， 约4h-8h。

30、10将脱色后凝胶中的蛋白质分离色带照相或干燥。也可无限期地用塑料袋封闭在含20%甘油的水中。第71页/共86页 1 2 3 4 5 1 1：细菌总蛋白（含pBSKpBSK）；2 2：未经诱导细菌总蛋白（含pGFPuvpGFPuv）；3 3：经诱导细菌总蛋白（含pGFPuvpGFPuv）；4 4：穿流峰流出液；5 5：纯化的GFPuvGFPuv。第72页/共86页 1 2 3 4 5 6 7 1 1：MarkerMarker；2 2：细菌总蛋白（含pUC18pUC18）；3 3：未经诱导细菌总蛋白（含pGFPuvpGFPuv）；4 4：经诱导细菌总蛋白（含pGFPuvpGFPuv）。第73页/共

31、86页Marker L1 L2 L3 L4 L5 L6 L1：细菌总蛋白（含pUC18）sample1；L2：未经诱导细菌总蛋白（含pGFPuv） sample2；L3：经诱导细菌总蛋白（含pGFPuv）sample3 ；L4：穿流峰流出液sample4 ；L5： 50mmol/L咪唑洗脱液sample5；L6：纯化的GFPuv sample6。提交电泳图：第74页/共86页六注意事项1.制备聚丙烯酰胺凝胶时，如果倒胶后出现漏胶液现象，常常是因为二块玻璃板与塑料条之间没夹紧，留有空隙，所以这一步要特别留心操作。2.点样总量一般不超过20L，如果点样量太多而溢出梳孔，就会污染旁边泳道。要根据样品浓度来加样。每点一个样品后换一支吸头或清洗吸头后再点另一个样品。3.电泳完毕取凝胶时要小心细致，不能用死力弄坏玻璃板（尤其是凹形板）。4.固定及染色：考马斯亮蓝染色液盖过凝胶即可，染色后染色液要回收，可重复使用多次。第75页/共86页七实验安排 SDS-PAGE，观察结果并拍照。第76页/共86页八思考与讨论1.在不连续体系SDS-PAGE中,当分离胶加完后,需在其上加一层水,为什么?2.电极缓冲液中甘氨酸的作用?3.在不连续体系SDS-PAGE中,分离胶与浓缩