基因工程和基因组学2

1、基因工程和基因组学22/74一 基因工程概述遗传工程广义狭义：细胞工程、染色体工程、细胞器工程等基因工程第1页/共78页3/74是指将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。一 基因工程概述也称为DNA重组技术(DNA Recombination)、或分子克隆(Molecular cloning)第2页/共78页4/74基因工程的基本操作程序包括：(1) 目的基因的分离或合成；(2) 用工具酶对目的基因和载体（Vector）进行加工 处理，把目的基因与载体结合成重组DNA分子；(3)把重组DNA分子引入受体

2、细胞，并使目的基因和 载体上其他基因得以表达；（4）转化体细胞的扩增；（5）重组体细胞的鉴定与筛选。第3页/共78页5/7471年，美国Smith,H.O.等分离出一种限制性酶，可酶切病毒的DNA分子；1972年：erg, P.等 实现不同酶切DNA片段的体外连接； 1973年：Cohen,s.等将体外重组的DNA 转入大肠杆菌细胞并得以表达。 一 基因工程概述第4页/共78页6/741973 Cohen第一例成功的克隆实验1978 Genentech公司 人胰岛素 世界上第一种基因工程蛋白 药物 1982 第一个基因工程药物-重组人胰岛素在英、美获准使用 1985 第一批转基因家畜（兔、猪和

3、羊），中国 转基因鱼 1993 基因工程西红柿在美国上市1997 英国罗斯林研究所 多莉羊1999.9 中国获准加入人类基因组计划.负责测定人类基因组全 部序列的1%2000.6.26 科学家公布人类基因组工作草图2001.2.11 公布人类基因组基本信息生物技术工程：基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程第5页/共78页7/74一 基因工程概述 从供体细胞中分离出目的基因；(简称“切”) 用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片断接到载体上，形成DNA重组分子(“接”)； 借助细胞转化手段将DNA重组分子导入受体细胞(“转”)；第6页/共78页8/74一 基因工程概述 培养转化细胞，以扩增DN

4、A重 组分子，使其整合到受体细胞 的基因组中（ “增”）； 鉴定转化细胞，获得外源基因 高效表达的细胞（ “检”）；由此可见，基因工程的操作过程可简化为：“切、接、转、增、检”第7页/共78页9/74 基因克隆示意图目的基因 载体DNA(限制性内切酶切开)重组体宿主细胞已转化的宿主细胞繁殖阳性克隆株表达第8页/共78页10/74二 限制性内切核酸酶 限制性内切核酸酶或限制性酶：(restriction enzymes)在细菌中此酶的功能是降解外来DNA分子，以限制(restriction )或阻止病毒侵染。 该类能识别双链DNA分子中一段特异的核苷酸序列，并将双链DNA分子切断。第9页/共78

5、页11/74工具酶常用的工具酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶切割切割DNADNA连接酶连接酶生成生成3- 5磷酸二酯键磷酸二酯键DNA聚合酶聚合酶探针标记、补平探针标记、补平3末端末端反转录酶反转录酶cDNA合成合成多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶5磷酸化、探针标记磷酸化、探针标记末端转移酶末端转移酶3末端多聚尾末端多聚尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基第10页/共78页12/741 限制性内切核酸酶 限制性酶据其作用特点，可分为两类。 第类限制性酶：每隔一段DNA序列随机切割双链DNA分子，没有序列特异性。 第类限制性酶：能识别一段特异的DNA序列，准确地酶切双链DNA的特异序

6、列。其识别的序列是对称的，即在一条链中从5到3方向的序列，与其互补链从5到3方向的序列完全相同。这种序列称为回纹对称序列(palindrome)。第11页/共78页13/74第12页/共78页14/74第13页/共78页15/74第14页/共78页16/74第15页/共78页17/742 DNA聚合酶DNA聚合酶的主要作用是在体外大量合成目的基因第16页/共78页18/743、DNA连接酶 在大肠杆菌和动物细胞中都发现了DNA连接酶，这种酶能够催化DNA中相邻的 3一OH和5一磷酸基末端之间形成磷酸二酯键。4、逆转录酶 RNA DNA第17页/共78页19/74三 载体 一个DNA片段只有与适

7、合的载体(vector)DNA连接构成重组DNA后，在载体DNA的运载下，才可以高效率地进入宿主细胞(host cell)，并在其中复制、扩增、克隆出多个拷贝。可作为DNA载体的有质粒、噬菌体、病毒、细菌或酵母菌人工染色体（BAC、YAC）等。第18页/共78页20/74三 载体 作为载体DNA分子，需具备四个条件：具复制原点(ori)，能携带的外源DNA片段独立地自我复制；具有多克隆位点，即具有多种限制性酶的切点，用于克隆外源DNA片段；至少具有一个选择标记基因；易从宿主细胞中回收。 第19页/共78页21/741. 细菌质粒 质粒是细菌细胞内独立于细菌染色体而自然存在的、能自我复制、易分离

8、和导入的环状双链DNA分子。这些质粒的适应范围广，拷贝数多。进入宿主细胞复制后，每个细胞的质粒拷贝数可高达1000个。第20页/共78页22/742. 噬菌体 第21页/共78页23/743. 柯斯质粒 第22页/共78页24/744. 穿梭载体 第23页/共78页25/745. 细菌人工染色体 第24页/共78页26/746. 酵母人工染色体第25页/共78页27/747. Ti质粒及其衍生载体 第26页/共78页28/744.1 目的基因的获得4.2 目的基因和载体的连接4.3 重组DNA导入受体菌4.4 筛选转化子4.5 克隆基因的表达4 重组DNA技术基本原理第27页/共78页29/7

9、44.1 目的基因的获取目的基因的获取大概有以下途径：1化学合成法如已知目的基因的核酸序列，则可以利用化学合成法进行人工合成。2 基因组DNA可以从基因文库中筛选出目的基因。第28页/共78页30/743 cDNA法通过提取mRNA，然后进行反转录得到目的基因。4 PCR法用特异的引物，通过聚合酶链式反应来扩增目的基因。第29页/共78页31/74PCR的基本原理变性、复性、半保留复制PCR三步曲变性 9097退火 4555延伸 72左右变性延伸退火909540607075第30页/共78页32/74P C R操作流程90 0 0 C50 0 0 C70 0 0 C第31页/共78页33/74

10、PCR 的三个步骤为一次循环，约需510 分钟。每经一次循环，所找到的目的基因扩充一倍。经过 20 次循环，即可扩增 106 倍，总共只需几个小时。第32页/共78页34/744.2 目的基因和载体的连接外源基因离开染色体是不能复制的。如果将外源基因连到复制子上，外源基因则可作为复制子的一部分进行复制。这种复制子就是载体。载体可分为复制载体和表达载体。表达载体是将外源基因在寄主细胞内表达成蛋白质的载体。作为表达载体必须具有强的启动子和终止子，而且启动子必须是受控制的，所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号。第33页/共78页35/74选择了载体后，就要将载体和目的基因在体外进行连接，即DNA的

11、体外重组。DNA的体外重组是依靠连接酶在体外将连接。第34页/共78页36/744.3 重组DNA导入受体菌外源DNA与载体在体外连接成重组的DNA分子后，需要将其导入受体菌。随着受体菌生长、增殖，重组DNA分子得以复制、扩增、表达。在选择了适当的受体菌后，经过特殊的方法处理后，使之成为感受态细胞，具备接纳外源DNA的能力。感受态的细胞制备有氯化钙法、电击发等。第35页/共78页37/74第36页/共78页38/744.4重组体的筛选筛选就是将众多的转化菌落和菌斑区分开来，并鉴定那一个菌落或菌斑所含的重组DNA带有目的基因。第37页/共78页39/74筛选的方法有以下种：第38页/共78页40

12、/74常用的方法有以下几种：1 遗传检测法：如果载体携带有某些抗药性标志基因，转化后，只有含有这种抗药基因的转化子细菌才能在含有该抗生素的培养板上生存并且形成菌落。抗药性：以上两种方法仅仅是初步筛选。插入失活：载体一般含有多克隆位点，在没有外源DNA插入时该基因可正确表达，当外源基因插入时该基因就不能正确表达。这就是插入失活。第39页/共78页41/742 重组质粒的快速提取和酶切鉴定3 PCR法如果质粒中重组有外源基因，则可以先快速提取少量质粒进行酶切，然后通过电泳法检查是否含有目的基因片段。可提取质粒，用特异的引物进行扩增，如能扩增出目的基因片段，则证明目的基因已重组入质粒。第40页/共7

13、8页42/744.5 克隆基因的表达重组DNA技术的目的是为了扩增目的基因并且使目的基因表达，实现生命科学研究、医药或商业目的。克隆基因在受体细胞表达或大量生产涉及正确的基因转录、mRNA的翻译以及后加工等问题。这些过程的进行在不同的表达体系是不一样的，这些差别不但与基因的来源、性质有关，而且与载体和表达体系有关。第41页/共78页43/74常用的表达体系有原核表达体系和真核表达体系。大肠杆菌是当前采用最多的原核表达体系。真核表达体系有酵母、昆虫、哺乳动物细胞等。第42页/共78页44/74第43页/共78页45/74第44页/共78页46/74第45页/共78页47/74第46页/共78页4

14、8/74第47页/共78页49/74五 基因工程的应用 (一)基因工程工业(二)植物基因工程(三) 转基因动物(四) 遗传疾病诊断第48页/共78页50/74(一)基因工程药物胰岛素的人工生产第49页/共78页51/74(二)植物基因工程 1. 根癌农杆菌介导的植物转化植物基因转化：是指将外源基因转移到植物细胞内、并整合到植物基因组中稳定遗传和表达的过程。根癌农杆菌介导的植物转化第50页/共78页52/742. 基因枪转化技术 通过高压气体等动力，高速发射包裹有重组DNA的金属颗粒，将目的基因直接导入受体细胞，并整合到染色体上的方法。此法已广泛用于转化水稻、小麦、玉米、大豆等主要作物。第51页

15、/共78页53/74(三) 转基因动物 与转基因植物相比，转基因动物的发展要慢些。 例如，利用转基因羊大量表达人类的抗胰蛋白酶。将人的抗胰蛋白酶-1基因克隆在羊奶产生相关基因启动子的下游，这种启动子仅在乳腺细胞中表达，使羊奶中含有大量有功能的人类抗胰蛋白酶；可利用家禽作为生物反应器，生产人类大量需要的重要蛋白质。 大象的生长基因转到猪身上第52页/共78页54/74(四) 遗传疾病诊断第53页/共78页55/74(五) 基因治疗 利用基因工程技术，将特异基因导入并整合到具有遗传缺陷的患者的基因组中，以治疗遗传疾病的方法，通常叫做基因治疗(gene therapy)。目前最常用的方法是利用病毒D

16、NA作载体，构建重组DNA分子，用病毒包装物包装后形成的重组去毒病毒感染患者的细胞，将正常基因整合到染色体上。 第54页/共78页56/74第二节 基因组学 基因组学(genomics)：是遗传学研究进入分子水平后发展起来的一个分支，主要研究生物体全基因组(genome)的分子特征。 特点：是以基因组为研究单位，而不是以单个基因，目标：是认识基因组的结构、功能及进化，弄清基因组包含的全部遗传信息及相互关系，为最终充分合理利用各种有效资源，预防和治疗人类遗传疾病提供科学依据。 第55页/共78页57/74第56页/共78页58/74构建基因组的遗传图谱(genetic map)；构建基因组的物理

17、图谱(physical map)；测定基因组DNA的全部序列；构建基因组的转录本图谱；分析基因组的功能。 基因组学的重要组成部分是基因组计划(genome project)，u大体上可分为：第57页/共78页59/74人类基因组计划(human genome project，HGP) ：水稻基因组计划(rice genome project，RGP) 模式生物基因组计划：如酵母、线虫、果蝇、小鼠、家猪、拟南芥第58页/共78页60/74一 基因组图谱的构建 鸟枪射击法(shotgun) 基因组序列测定 第59页/共78页61/74遗传图谱的构建物理图谱的构建一 基因组图谱的构建 第60页/共7

18、8页62/74(一) 遗传图谱的构建 图谱标记 图谱构建中需要可以鉴别的标记(marker)，在构建遗传图谱中，可用基因和DNA作为标记。(1) 基因标记 (2) DNA标记 第61页/共78页63/74(二) 物理图谱的构建第62页/共78页64/74第63页/共78页65/74拟南芥 第64页/共78页66/74第65页/共78页67/74第66页/共78页68/74二 基因组图谱的应用 基因定位基因组比较分析 标记辅助选择(marker-assisted selection，MAS) 基因的克隆与分离第67页/共78页69/74三 后基因组学 后基因组学(post-genomics)：是在完成基因组图谱构建以及全部序列测定的基础上，进一步研究全基因组的基因功能、基因之