基因工程2载体

1、会计学1基因工程基因工程2载体载体第1页/共39页pBR322plasmidF. BolivarR. L. RodriguezBacterial ResistancepBR322酶切图谱第2页/共39页2.pUC系统美国加利福尼亚大学的科学家J. Messing和J. Vieria于1987年首先构建 来自pBR322质粒的复制起点 氨苄青霉素的抗性基因 大肠杆菌-半乳糖酶基因的启动子及其编码的-肽链基因（lacZ） 位于lacZ基因内的一段MCS区段第3页/共39页第4页/共39页第5页/共39页2.pUC系统X-gal X-gal 溴氯吲哚溴氯吲哚+ + -半乳糖苷半乳糖苷-蓝白斑筛选插入

2、片段插入片段 无酶活性无酶活性 白斑白斑未插入片段未插入片段 有酶活性有酶活性 蓝斑蓝斑-半乳糖苷酶半乳糖苷酶第6页/共39页经 Taq DNA 聚合酶扩增后的 PCR 产物末端都带有单个 A 第7页/共39页 食品级微生物 适合于真核基因表达 基因产物外分泌第8页/共39页七、酵母菌质粒载体七、酵母菌质粒载体 多数酵母中含有一种能独立复制的环状双链DNA，称为2质粒，长约6.3kb，有单一的复制起始点和一个自主复制功能区域（ARS片段）。 整合型、复制型、附加型和稳定型整合型、复制型、附加型和稳定型等类型。 含有含有E.coliE.coli质粒的复制起始序列。质粒的复制起始序列。含有酵母的筛

3、选标记（如含有酵母的筛选标记（如LEU2LEU2）具有合适的供外源基因插入的限制酶切割位点。具有合适的供外源基因插入的限制酶切割位点。2.酵母菌质粒载体的特点酵母菌质粒载体的特点1.酵母菌质粒载体的类型酵母菌质粒载体的类型第9页/共39页TypeNameDescriptionbacterial originColE1ColE1 (pUC-type) origin of replicationpromoterGal1-10 promoterGal1-10 yeast promoterselectable markerampRampicillin resistance geneselectable

4、 markerchlRchloramphenicol resistance gene LOST in recombined (with insert) formselectable markerURA3URA3 auxotrophy selectable marker (yeast)yeast centromereCEN4yeast centromeric sequenceyeast originARS1ARS1 yeast origin of replication酵母菌酵母菌稳定型稳定型质粒载体质粒载体 着丝粒着丝粒第10页/共39页第11页/共39页第12页/共39页第13页/共39页一

5、、一、 噬菌体载体噬菌体载体 1. 噬菌体结构特点噬菌体结构特点: 线性双链DNA分子可在E.coli中大量繁殖具非必需区(约1/3长度）两端具12个核苷酸单链互补粘性末端 第14页/共39页第15页/共39页噬菌体线性噬菌体线性DNA分子的粘性末端及其环化作用分子的粘性末端及其环化作用（a）具有互补单链末端（粘性末端）的 DNA分子。（b）当进入宿主细胞后，通过粘性末端之间的碱基配对作用实现的线性分子的环化作用，由此形成的双链区叫做coscos位点位点GGGCGGCGACCTCCCGCCGCTGGATACGcos5-P5-P33粘性末端粘性末端环化作用环化作用（a）（b）第16页/共39页

6、酶切点太多酶切点太多 5 5个个BamH1BamH1位点，位点，6 6个个BglBgl位点，位点，5 5个个EcoREcoR位点。位点。 野生型只能接纳一定长度的野生型只能接纳一定长度的DNADNA。 噬菌体的噬菌体的75-105%75-105%，只能接纳，只能接纳49kb49kb5%=2.45kb5%=2.45kb的的DNADNA。 噬菌体的改造：噬菌体的改造： 切去非必须区段，在切去的同时，加载目的基因（切去非必须区段，在切去的同时，加载目的基因（15-23Kb15-23Kb）；）； 去除过多的酶切位点，每种酶只留去除过多的酶切位点，每种酶只留1-21-2个切口；个切口； 增加选择标记基因

7、（增加选择标记基因（selectable markerselectable marker）；）； 建立建立DNADNA的体外包装。的体外包装。第17页/共39页主要外壳蛋白质主要外壳蛋白质是基因是基因E E的产物的产物头部前体连环DNA基因A的产物在cos位点切割噬菌体DNA包含在外壳中的基因D的产物基因W和FII的产物组装蛋白质加完整的尾部噬菌体的包装过程噬菌体的包装过程第18页/共39页supsup- -细菌细菌头部基因（琥珀突变型）尾部基因（琥珀突变型）转录复制蛋白质合成组装尾部所需要的组分“无头部”的提取物组装头部所需要的组分“无尾部”的提取物温育完整的噬菌体转录复制蛋白质合成T4噬菌

8、体的体外包装DNADNA的体外包装的体外包装体外包装的重组DNA比裸露的DNA导入受体细胞的效率高100-10000倍第19页/共39页4.4.凯伦噬菌体载体克隆过程凯伦噬菌体载体克隆过程第20页/共39页5.噬菌体载体优点噬菌体载体优点:用途用途: :主要用于建立真核生物的基因文库感染高效:比质粒高百倍 容量大:可达15Kb(不得超过原来长度的105%,不得短于原来长度的75%) 易操作,易保藏 第21页/共39页二、二、柯斯柯斯( (COS)COS)载体载体( (cosmid)cosmid) 1.柯斯载体的组成柯斯载体的组成 带有抗药性标记 带有质粒的复制起始点 带有多个限制酶的单一切点

9、带有噬菌体粘性末端片段 由质粒和粘性末端“尾巴”两部分组成。2.柯斯载体的特点柯斯载体的特点 第22页/共39页3.cosmid3.cosmid载体的优点载体的优点 能象DNA一样体外包装，并高效导入受体细胞 可以装载比质粒或DNA大得多的外源DNA片段 cos区 1.7 kb+质粒部分 3.3kb 46.5Kb 外源DNA 由于携带质粒的选择标记，便于筛选 由于质粒上的多种单一酶切位点，便于克隆。 第23页/共39页第24页/共39页利用柯斯载体载体进行基因克隆的一般程序第25页/共39页第26页/共39页三、三、M13M13噬菌体克隆载体噬菌体克隆载体 1.M131.M13的特性的特性:环

10、状,单链DNA,6.407Kb 第27页/共39页2.M13噬菌体作为载体噬菌体作为载体优越性优越性 单链DNA噬菌体的复制，是以双链环形的DNA为媒介的，这种复制形式的DNA简称RFDNA； 不论是RFDNA还是ssDNA都能感染大肠杆菌； 单链DNA噬菌体颗粒的大小，是受其DNA的大小制约的，不存在包装限制问题； 可产生含外源片断的单链DNA分子。第28页/共39页第29页/共39页2.M132.M13载体的构建载体的构建 第30页/共39页其基本原理是将外源DNA片段插入噬菌体编码蛋白基因P中，使外源DNA片段对应的表达产物融合在噬菌体的外壳蛋白中形成融合蛋白，呈现在噬菌体表面。 第31

11、页/共39页第32页/共39页第33页/共39页质粒质粒噬菌体噬菌体柯斯质粒柯斯质粒单链噬菌体单链噬菌体克隆克隆DNADNA大片段大片段* *+ + +- -构建基因组文库构建基因组文库- -+ + +- -构建构建DNADNA文库文库+ +- - - -常规的亚克隆化常规的亚克隆化+ +- - - -构建新型的构建新型的DNADNA结构结构+ +- - - -序列分析序列分析+ +- - -+ +单链探针单链探针- - - -+ +外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在大肠杆菌中的表达+ +- - - -* * 外源外源DNADNA如超过如超过10kb10kb，则重组质粒的转化率和，则重组质粒

12、的转化率和DNADNA得率都非常低得率都非常低四种常用载体的比较四种常用载体的比较第34页/共39页2.pUC系统美国加利福尼亚大学的科学家J. Messing和J. Vieria于1987年首先构建 来自pBR322质粒的复制起点 氨苄青霉素的抗性基因 大肠杆菌-半乳糖酶基因的启动子及其编码的-肽链基因（lacZ） 位于lacZ基因内的一段MCS区段第35页/共39页2.pUC系统X-gal X-gal 溴氯吲哚溴氯吲哚+ + -半乳糖苷半乳糖苷-蓝白斑筛选插入片段插入片段 无酶活性无酶活性 白斑白斑未插入片段未插入片段 有酶活性有酶活性 蓝斑蓝斑-半乳糖苷酶半乳糖苷酶第36页/共39页经 Taq DNA 聚合酶扩增后的 PCR 产物末端都带有单个 A 第37页/共3