九基因克隆与表达

1、 九.基因的克隆与表达 基因的克隆 基因的表达基因克隆（分子克隆molecular cloning）-通过体外重组技术,将一段目的DNA经切割、连接插入适当载体，并导入受体细胞，扩增形成大量子代分子的过程。基因克隆的技术路线基因克隆的技术路线 目的基因目的基因 载体载体体外重组体外重组重组子（杂合重组子（杂合DNA）转化转化受体细胞受体细胞筛选阳性克隆筛选阳性克隆大量扩增，获得子代大量扩增，获得子代DNA 基因克隆的基本程序一. 分离或合成外源基因1. 直接从染色体 DNA 中分离一些 DNA物理图谱已经确定，背景资料比较清楚的原核生物，可以采用直接分离法分离制备目的基因。从原核生物中提取纯化

2、DNA 之后，根据它的限制性核酸内切酶物理图谱进行基因定位，便能很方便地从该 DNA限制性核酸内切酶消化片段的电泳凝胶上回收目的基因。但是，对于真核生物 DNA 分子大，染色体数目多，采用直接法制备目的基因比较困难。. 从 mRNA 合成 cDNA 目的基因可以通过纯化的 mRNA 经逆转录合成获得。例如网织细胞合成的蛋白质，90%是血红蛋白( Hb) 的、链。用抗Hb的抗体与网织细胞中分离出来的多聚核糖体一起保温，使多聚核糖体沉淀出来，再从其中可分离到Hb的mRNA。纯化mRNA的在逆转录酶催化下可以得到Hb的cDNA 。3. 从基因文库(gene library)筛选 基因文库是指用重组D

3、NA技术将某种生物细胞的总 DNA 的所有片段随机地连接到载体上，然后转移到适当的宿主细胞中，通过细胞增殖构成各 DNA 片段的克隆，当制备的克隆数目多到可以把某种生物的全部遗传信息都包含在内的情况下，这一组克隆的总体就被称为该种生物的基因文库。因此，目的基因可以从基因文库中筛选获得。4. 从 cDNA 文库中筛选 上述用某种生物体总 DNA 建造的文库，由于包含了该生物体的全套基因，因此它实际上是该生物基因组(genome)文库, 即gDNA文库。同样可有染色体基因组文库、叶绿体基因组文库、噬菌体基因组文库等文库。 如果把某种生物细胞全部 mRNA 抽提出来，再通过逆转录产生总 cDNA，用

4、上述 gDNA 文库构建的方法，可以获得该种生物细胞的 cDNA 文库。由cDNA 文库也可以筛选出所需的目的基因。 cDNA 文库与gDNA文库不同，它只包含表达蛋白质或多肽的基因，不包括内含子和其它不表达 的 DNA 序列。5. 人工合成基因 一些简单的多肽（如生长抑制素，含14个氨基酸），可以在已知其一级结构的基础上，按这些氨基酸编码的核苷酸系列来合成基因。6. PCR扩增目的基因从文库中分离目的基因虽然有效，但都存在步骤多、费时、筛选工作量大等困难，而且更为重要的问题是往往不能获得完整的全长基因。PCR 技术可根据研究目的不同，既可选择以 DNA 为模板，通过扩增后得到含内含子和调控顺

5、序在内的完整基因；又可选择以 RNA 为起始材料，经逆转录成 cDNA，扩增后得到无内含子，无调控顺序，只有结构基因的核酸片段。通过 PCR 扩增可获得目的 DNA或其中某一特定顺序，用于亚克隆、酶切分析、建立 cDNA 文库或作为探针。PCR技术的诞生，使分子克隆中 DNA 操作变得更为快捷和准确。二. 目的基因与载体重组1. 粘性末端连接 同源互补粘性末端连接非同源互补粘性末端连接 (定向克隆）2. 平端连接EcoR 5-GAATTC-33-CTTAAG-55-G3-CTTAA5-GAATT3-CTTAA5-GAATTCC-33-CTTAAGG-5EcoR Hae 5-GGCC-33-CC

6、GG-5CC-3GG-5酶切填平受体供体酶切BamH 5-GGATCC-33-CCTAGG-55-G3-CCTAG5-GGATC3-CCTAG5-GGATCCGA-33-CCTAGGCT-5BamH Taq (或Cla )CGA-3T-5CGA-3GCT-5酶切填平受体供体填平5-TCGA-33-AGCT-5酶切BamH 5-GGATCC-33-CCTAGG-55-G3-CCTAG5-GGATC3-CCTAG5-GGATCGATCT-33-CCTAGCTAGA-5Cla GATCT-3A-5GATCT-3CTAGA-5填平末端连接5-AGATCT-33-TCTAGA-5Bgl 填平末端3 3、

7、T-A克隆pMD18-T Vector是一种高效克隆PCR产物（TA Cloning）的专用载体。本载体由pUC18载体改建而成，在pUC18载体的多克隆位点处的Xba I和Sal I识别位点之间插入了EcoR V识别位点，用EcoR V进行酶切反应后，再在两侧的3端添加“T”而成。 PCR过程中，普通的Taq酶可在产物的3端多加一个A三. 重组基因导入细胞 在基因克隆技术中，将质粒 DNA 及其重组体导入细菌称为转化( transformation )；病毒及其重组体导入受体细胞称为转染( transfection )；噬菌体及其重组体导入受体细胞称转导( transduction )。1.

8、 氯化钙转化法2. 电击转化法 电击法不需要预先诱导细菌进入感受态，只依靠短暂的电击，促进 DNA 进入细胞。因其操作简单方便、转化率亦高，愈来愈为人们接受。3. 体外包装转染法 利用噬菌体颗粒能够将自身DNA 有效地注入到寄生菌细胞内的原理，将噬菌体头部及尾部蛋白与 DNA 重组体混合，组装成完整的噬菌体颗粒，再来感染大肠杆菌。研究发现每微克重组 DNA 直接转染细菌，可产生103-4个噬菌斑；如用体外包装的具感染力的噬菌体颗粒，每微克可产生106个噬菌斑，比不包装裸露的重组 DNA 效率增加100倍。4. 受体细胞的选择 受体细胞是重组基因增殖的场所。对受体细胞也应具有几个要求： 容易接纳

9、重组分子； 对载体的复制扩增无严格限制； 不存在特异的内切酶体系降解外源 DNA； 不对外源 DNA 进行修饰； 符合“重组 DNA 操作规则”安全标准。常用载体所用的宿主细胞载体 宿主细胞 培养基pBR322 LE392 HB101 JM107 JM109 LB/ 抗菌素pUC系列 JM103 LB/Ap噬菌体 LE392 LB + MgSO4 M13 JM103 JM107 JM109 LBCharon LE392 C600 LB + MgSO4EMBL3 LE392 LB + MgSO4 gt10 C600 hflA LB + MgSO4 pGEM JM105 JM109 LB/Ap g

10、t11 Y1090 BNN97 LB/Ap + MgSO4四. 重组体的筛选与鉴定1. 抗生素平板等筛选 利用载体的表型特征或遗传标记直接筛选。如：质粒、粘粒具有抗药性标记，它们转化宿主细胞后，都能在含有抗菌素 (Amp或Tet)的培养板上生长；而未转化的宿主细胞则不能生长。这样可从大量的细胞群体中筛选出转化子与非转化子。对于噬菌体来说，噬菌斑的形成就是他们自我选择的特征。对于重组子与非重组子的筛选则用:插入失活插入失活 插入表达 质粒 pTR262 携带有来自噬菌体 的 C基因，它是 Tetr 基因的负控制系统。在正常情况下，C基因表达产生阻遏物，使Tetr 基因不能表达，表现Tets 表型

11、。如果在 C基因的 Hind 或 Bcl 位插入外源 DNA 片段，将导致C基因失活，Tetr解阻遏而表达，这时即表现Tetr表型。由这样的重组 DNA 转化细胞，在Tet平板上可以生长，而未消化或自身成环的质粒转化细胞及未转化细胞是不能生长的。 -半乳糖苷酶显色反应 pUC 系列、pEGM 系列、M13 中引入了编码 LacZ 基因的肽顺序，其中含有多克隆酶切位点。当无外源基因片段插入时，质粒表达肽，它与宿主菌编码 N-末端-多肽缺陷的-半乳糖苷酶多肽发生基因互补，形成有活性的-半乳糖苷酶，在含有底物 X-gal 和诱导剂 IPTG 的存在下，菌落呈蓝色；如果LacZ 基因中插入外源基因，造

12、成插入失活，使之不能产生多肽，转化细胞失去了-互补，将无-半乳糖苷酶活性存在，因此在X-gal 平板上，阳性重组子为白色菌落。2. 限制性内切酶图谱鉴定3. 外源基因的序列分析 附:一、片断平移的克隆（也适用于多片断连接 简介：将用作载体的质粒A（制作大片断）酶切3L ，要切出小片断的质粒B酶切7L；琼脂糖回收胶电泳；切胶回收来自质粒A的大片段，和来自B的小片断，并回收到一管中；酚氯仿法回收DNA，酒精沉淀，干燥；加入8L水、1Lligase Buffer、1L ligase ，4过夜；次日转化涂板。 1.酶切 配置可酶切共10L质粒的酶切反应体系（双酶切）：（提示 在克隆设计时尽量使用好切的

13、内切酶，且注意这两个酶有比较兼容的Buffer，即在这种公用Buffer中，两酶的效力变化不大。酶切体系根据需要，可加入BSA。） 酶切体系A质粒酶切制作载体片断公用Buffer 3L酶 I 1L酶 II 1L质粒 3L双蒸水 22L合计 30LB质粒酶切制作插入片断公用Buffer 7L酶 I 2L酶 II 2L质粒 7L双蒸水 52L合计 70L混匀。37，酶切3小时。 （提示 关于酶量的问题。通常的内切酶效价在10U/L左右，3L内切酶相当于30U，足够切10L的质粒。因为通常小提质粒的浓度在200600ng/L，一般浓度达不到1g/L。根据1U酶切1g质粒的原则，这一酶量是足够的。）

14、2.1%琼脂糖回收胶回收（碎胶、酚氯仿抽提法 ) 1. 酶切产物加入10量的上样Buffer，混匀。使用1%的琼脂糖回收胶，电泳回收酶切产物。2. 用手术刀切下所需要的大片断（载体）和小片断（插入片断），收入一个1.5mL离心管中。 （提示 切胶前，需用分别含酒精、NaOH和双蒸水的纸巾擦拭凝胶接触的台面，以防污染。 手术刀要火焰消毒，而后切胶回收。）3. 12000rpm 1分钟，将凝胶甩到管底。 -20 冰冻20分钟。4. 取200L Tip 头两只，在酒精灯上稍烤化Tip头尖端，两Tip头尖相对来回相接触，在Tip头顶部制成直径3mm左右的平头，准备用于碎胶。 5. 从-20取出冻结的凝

15、胶，立即使用200L枪套上平头Tip头，捣碎凝胶。（提示 200L的枪足够粗壮，不要用100L的枪，小心折断！ 乘凝胶比较硬时就开始碎胶，轻而频率高地捣碎凝胶）6. 凝胶管中加入500L双蒸水，盖紧，振摇200下。7. 加入500L Tris饱和纯酚，盖紧，振摇200下。 12000rpm 4 离心15分钟。8. 在一新1.5mL 离心管中加入 500L 氯仿：异戊醇（24：1），将步骤7的上清加入本步骤离心管中。盖紧，振摇200下。 12000rpm 4 离心5分钟。 9. 在一新1.5mL 离心管中加入 900L 预冷 无水乙醇、20L 3M的醋酸钠。将步骤8的上清小心加入本步骤离心管中。

16、颠倒数次混匀。12000rpm 4 离心15分钟。（提示 吸取步骤8中的上清时，千万不要将有机相吸入，宁可放弃一些上清，否则影响后面的连接反应。 另外，本方法使用的醋酸钠量较小，但足够沉淀核酸，并且无需洗盐。）10. 弃上清，将离心管倒置于干净吸水纸巾上5分钟。室温下吹风干燥。（提示 可将试管至于超净台吹风干燥。如果管底有较多液体聚集，可盖好管盖后，轻弹管底数次，将液体分散挂在管壁上，再打开管盖吹风.） 3.连接 回收产物加入8L水、1Lligase Buffer，4过夜；次日转化涂板。 转化: 用一步法感受态细胞 1. 连接产物10L、5KCM溶液10L、双蒸水30L，（共50L）混匀，置冰

17、上。2. 从-70冰箱中取 1支感受态细胞，置冰上。融化后立即取50L，加入步骤1中的混合液中，轻轻吹打数次混匀（不可用力过大，不可涡旋）， 立即置冰上。3. 冰上放置20 分钟。4. 室温放置10分钟。5. 加入500L新鲜LB， 150转37 1小时。6. 6000转/分 5分钟离心收菌。留150L上清（其余上清丢弃），吹打数次，重悬菌体。7. 涂板。 37 孵箱过夜。 重组子的筛选同以前所讲重组子的筛选同以前所讲 小结：本方法采用简洁的步骤。最有特点的地方是片断回收后收到一个试管中，而不象一般的操作分别收到不同的试管中，回收后再电泳定量，并计算大小片断的比例，最后配置连接体系。 这种简洁

18、的步骤不仅提高效率、避免引入人为的误差（例如肉眼对DNA的定量的误差），还减少了DNA的损失，保证了更多的DNA（实际上是全部的DNA）进入下面的连接反应。所以本方法的第一个优点，是保证连接和转化中，有“足够量”的核酸。 连接和转化的核酸量得到保证，克隆成功就得到保证。 附二、附二、PCR产物的产物的TA克隆克隆 1. TA克隆构建原理：TA克隆系统由Invitrogen公司（San Diego，CA）发展而来的商业性试剂盒，它用于PCR产物的克隆和测序。其原理是利用Taq酶能够在PCR产物的3末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3T突出端的载体，在连接酶作用下，可以快速地、一步到位

19、地把PCR产物直接插入到质粒载体的多克隆位点（MCS）中。 连接反应 T载体 1l DNA 4l Ligation mix 5l 16 连接过夜转转 化化 吸取10l连接产物，用在20预冷的移液滴头转移至50l新鲜制备的BL21（DE3）感受态细胞中，轻摇混匀，置于冰/水混合物中30min，42热冲击90s，随后在冰浴中2min。继而吸取100l加入900l LB肉汤中，37振荡培养1h。于4、5000g离心3min后收集细菌。用150lLB液体培养基重悬细菌后均匀涂布于含2% X-gal和20 IPTG的氨苄平板上，37温箱中培养1416h。阳性克隆的筛选与鉴定 自氨苄平板上挑取白斑，接种于

20、LB液体培养基(含氨苄50g/ml)，37振荡培养13h，按碱裂解法小量提取质粒并用EcoRI、salI 进行双酶切鉴定。质粒载体的双酶切质粒载体的双酶切 ddH2O 6.0l 10H buffer 2.0l 含DNA的 T载体 10.0l EcoR 1.0l salI 1.0l 混匀后37水浴4h，酶切结束后将酶切产物于1%琼脂糖凝胶上电泳鉴定。 grpErecA(1200)gyrB 注意事项1.要获得目的基因的TA克隆，PCR产物的特异性要好。2.PCR产物在TA克隆前要通过纯化。3.在PCR产物回收、纯化过程中防止外来DNA污染。 附：附： 快速质粒鉴定方法快速质粒鉴定方法 protoc

21、ol：0.从平板上挑单菌落，越多越好（从平板上挑单菌落，越多越好（2030），），放于放于1.5ml离心管中，加离心管中，加1.2ml 左右的液体左右的液体LB培养基，摇培养基，摇35h. 200rpm1.用用1.5ml离心管收集一定量离心管收集一定量(1ml,留留0.2ml)含含有重组质粒的菌液，有重组质粒的菌液，10000rpm, 30sec,弃上弃上 清，清，留管底沉淀（应留有一定量留管底沉淀（应留有一定量(0.2)的菌液放于的菌液放于4度中，以备摇菌）度中，以备摇菌）2.加入加入3050ul TE ,重悬菌液，混合均匀重悬菌液，混合均匀3.加入加入25ul 酚酚:氯仿氯仿:异戊醇（异戊

22、醇（25:24:1),混合均混合均匀匀 4.加入加入5ul 上样缓冲液（上样缓冲液（6X or10X),混合均混合均匀匀,12000rpm, 10min,取蓝色上清液（约取蓝色上清液（约2030ul)直接进行电泳，直接进行电泳，结果会显示条带结果会显示条带a:最上边，几万最上边，几万bp的条带是基因组的条带是基因组DNAb:其次，下边是你所要的重组质粒，约几千其次，下边是你所要的重组质粒，约几千bpc:再下边可能会出现再下边可能会出现RNA的三条带，总共就这的三条带，总共就这几条带几条带通过经验，来判断一下看看哪个应该是连上了，通过经验，来判断一下看看哪个应该是连上了，哪个没连上，最后把连上的

23、那个挑出来，然后哪个没连上，最后把连上的那个挑出来，然后用放在用放在 4度中的对应的那个菌，摇菌，第二天度中的对应的那个菌，摇菌，第二天再提质粒可以了。再提质粒可以了。快速质粒鉴定快速质粒鉴定基因的表达基因的表达 Gene Expression一表达系统：一表达系统： 基因工程中用来获得有功能的异源蛋白基因工程中用来获得有功能的异源蛋白质的体系，包括克隆载体，表达载体及质的体系，包括克隆载体，表达载体及受体细胞。受体细胞。 据受体细胞的不同可分为：据受体细胞的不同可分为：1原核表达系统：原核表达系统： 将外源基因引入原核细胞，并使其在原将外源基因引入原核细胞，并使其在原核细胞中以发酵形式快速高

24、效地表达、核细胞中以发酵形式快速高效地表达、合成基因产物的体系。合成基因产物的体系。2真核表达系统：使外源基因在真核细真核表达系统：使外源基因在真核细胞中表达的体系。胞中表达的体系。二原核生物基因结构二原核生物基因结构1.一般不含内含子（一般不含内含子（intron），没有转），没有转录及翻译后加工系统录及翻译后加工系统 2.原核生物中功能相关的基因串联在一原核生物中功能相关的基因串联在一起，形成操纵子。起，形成操纵子。操纵子（操纵子（operon）：是一组功能上相）：是一组功能上相关，受同一调控区控制的基因组成的关，受同一调控区控制的基因组成的一个遗传单位一个遗传单位 原核生物基因表达的基本

25、单位（即一原核生物基因表达的基本单位（即一个转录单位）。个转录单位）。共同协调作用，完成某一多肽的表达共同协调作用，完成某一多肽的表达调控。调控。包括：调控区包括：调控区(调节基因，启动基因，调节基因，启动基因， 操作基因操作基因)、 结构基因结构基因3、原核生物中参与转录的基因结、原核生物中参与转录的基因结构：构：启动子启动子终止子终止子 启动子启动子(promoter, P)是指能被是指能被RNA聚合聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。序列。 一般长一般长40-60bp，富含，富含A-T碱基对碱基对 具有保守序列具有保守序列 终止子（终止子（te

26、rminatorterminator，T T）: :位于基因位于基因33端端, ,给予给予RNARNA聚合酶转录终止信号的聚合酶转录终止信号的DNADNA序序列列 三外源基因在原核表达系统中表达三外源基因在原核表达系统中表达的必要条件的必要条件：删除内含子和删除内含子和5非编码区非编码区外源基因置于强启动子控制下外源基因置于强启动子控制下维持正确开放阅读框架（维持正确开放阅读框架（ORF）1.mRNA稳定且可有效转译，形成的蛋稳定且可有效转译，形成的蛋白质不被降解白质不被降解 四影响外源基因在原核细胞中表四影响外源基因在原核细胞中表达效率的因素达效率的因素：1、启动子：建立表达载体时，选择强、

27、启动子：建立表达载体时，选择强启动子。启动子。 2、基因剂量、基因剂量3、核糖体结合位点、核糖体结合位点五原核表达载体：五原核表达载体： 适用于在原核细胞适用于在原核细胞中表达外源基因的载体。中表达外源基因的载体。主要元件：强启动子主要元件：强启动子 SD顺序（顺序（转译起始密码子转译起始密码子AUG上游上游3-11 bp长约长约3-9bp，mRNA与与16s核糖体亚基间的识别与结合序列核糖体亚基间的识别与结合序列 ） 筛选标志筛选标志 其它调控基因其它调控基因 六提高表达水平的手段六提高表达水平的手段1、选择合适载体，提高翻译水平、选择合适载体，提高翻译水平 强启动子强启动子-提高转录水平、

28、避免产提高转录水平、避免产物降解等物降解等2、选择合适宿主、选择合适宿主 Lac 启动子启动子-LacI菌菌PL/PR - CI857 溶源菌溶源菌 3、诱导表达、诱导表达 温度诱导温度诱导IPTG的化学诱导的化学诱导4、提高表达蛋白的稳定性，防止被宿、提高表达蛋白的稳定性，防止被宿主降解主降解七表达产物的检测：七表达产物的检测： 1、特异性鉴定：、特异性鉴定：荧光抗体法荧光抗体法免疫沉淀法免疫沉淀法免疫印迹法免疫印迹法ELISA2、生物学活性鉴定、生物学活性鉴定 八、原核表达系统的缺点八、原核表达系统的缺点1、没有转录后加工系统，不能识别、没有转录后加工系统，不能识别、剪除内含子剪除内含子

29、2、缺乏翻译后加工系统，不能对翻译、缺乏翻译后加工系统，不能对翻译的蛋白质进一步修饰加工的蛋白质进一步修饰加工 真核表达系统的必要性及优势真核表达系统的必要性及优势1. 具转录后加工系统具转录后加工系统2. 具翻译后修饰系统具翻译后修饰系统3. 可实现真正的分泌表达可实现真正的分泌表达4.基因治疗基因治疗真核基因结构及表达调控特点真核基因结构及表达调控特点 （一）真核基因组的复杂性（一）真核基因组的复杂性 真核基因组庞大，具大量非编码序列真核基因组庞大，具大量非编码序列 -mRNA丰度不同丰度不同 结构复杂：染色质、核膜、线粒体结构复杂：染色质、核膜、线粒体-表达调控多样表达调控多样 不连续性

30、：内含子、外显子不连续性：内含子、外显子 没有操纵子结构没有操纵子结构 (二）真核表达系统二）真核表达系统组成：真核表达载体组成：真核表达载体 受体细胞受体细胞 基因转移方式基因转移方式据受体细胞及表达载体的不同分为据受体细胞及表达载体的不同分为3种：种： 酵母表达系统酵母表达系统 哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统 昆虫细胞表达系统昆虫细胞表达系统（三）转化（三）转化1、原生质体法：去除厚壁、原生质体法：去除厚壁2、电穿孔法：效率较高、电穿孔法：效率较高（四）外源基因的表达（四）外源基因的表达1、胞内表达、胞内表达2、分泌表达、分泌表达（五）缺点（五）缺点不能实现全部的翻译后修饰功能不

31、能实现全部的翻译后修饰功能 附重组表达质粒构建与基因表达步骤: 一.基因重组表达质粒的构建 同前面介绍的重组质粒的构建与筛选 二.重组质粒在受体菌中的诱导表达 挑取单个BL21（DE3）的pETE2（SW）转化菌，接种10ml含30g/ml卡那霉素的LB培养基中，37振摇培养至OD600达到0.61.0，4冰箱过夜。次日用LB洗涤培养物，然后按1/100量接种新鲜的含30g/ml卡那霉素的LB培养基，37 振摇培养至OD600达到0.61.0，加入IPTG至终浓度为为0.4mmol/L，继续 培养3.5h，4 5000rpm离心诱导细菌培养物10min，收集菌体，加入1/5原培养体积的冰预冷的

32、50mmol/L Tris HCl，2mmol/L EDTA（pH8.0），洗涤菌体一次，离心收集菌体重悬于1/10原培养体积的冰预冷的10mmol/L Tris HCl（pH8.0）中，置4备用。 三三.表达产物的检测表达产物的检测 取取10l洗涤后的诱导菌悬液，按文献的方法洗涤后的诱导菌悬液，按文献的方法于于12%的分离胶上进行的分离胶上进行SDS-PAGE凝胶电泳。凝胶电泳。用双波长非点扫描仪对用双波长非点扫描仪对SDS-PAGE凝胶电泳凝胶电泳的蛋白带进行扫描。将的蛋白带进行扫描。将SDS-PAGE凝胶电泳凝胶电泳的各蛋白带转移至硝酸纤维素膜上，然后按的各蛋白带转移至硝酸纤维素膜上，然

33、后按文献的方法用相应的高免阳性血清进行鉴定。文献的方法用相应的高免阳性血清进行鉴定。 四四.不同诱导条件对不同诱导条件对E2基因表达的影响基因表达的影响 挑取挑取pETE2（SW）重组菌单菌落，接种）重组菌单菌落，接种5ml含含30g/ml Kna+（卡那霉素）的液体（卡那霉素）的液体LB培养基，培养基，37振摇培养至振摇培养至OD600约约0.6，然后按然后按1 1000接种分别接种接种分别接种15管分别含管分别含30g/ml卡那霉素抗性的卡那霉素抗性的LB培养基，培养基，37振振摇培养。分别在不同的温度（摇培养。分别在不同的温度（30、25和和20）和不同）和不同IPTG浓度（浓度（0.0

34、5mmol/L、0.1mmol/L、0.2mmol/L、 0.4mmol/L和和1mmol/L）进行诱导表达。）进行诱导表达。3.5h后，后，4 5000rpm离心离心15min收集菌收集菌体。体。1/10体积的体积的50mmol/L Tris HCl（ pH8.0），），2mmol/L EDTA缓冲液重缓冲液重悬后，超声破菌，悬后，超声破菌，4 12000rpm离心离心10min，分别收集上清和沉淀，沉淀用，分别收集上清和沉淀，沉淀用尿素溶解。取尿素溶解。取15l进行进行SDS-PAGE分析分析 结果 一一.基因重组表达质粒的构建基因重组表达质粒的构建 构建的构建的E2基因重组表达质粒基因重

35、组表达质粒pETE2（SW）经）经BamH和和Xho双酶切的电泳结果见图双酶切的电泳结果见图 2 。切。切出了大小约出了大小约5300bp和和1000bp左右的两个条带，左右的两个条带，与预计的结果一致。与预计的结果一致。 图图2 重组质粒重组质粒pETE2(SW)酶切鉴酶切鉴定结果定结果 1 DNA EcoRI+HindIII 2 pETE2(SW)质粒质粒 3 BamHI酶切酶切 4 BamHI+XhoI酶切酶切 5 XhoI酶切酶切 1 2 3 4 5 二二.E2蛋白的表达及表达产物的检测蛋白的表达及表达产物的检测 pETE2（SW）重组质粒转化）重组质粒转化BL21（DE3）宿主）宿主菌，加入菌，加入IPTG诱导表达。诱导表达。pETE2（SW）诱导菌）诱导菌的的SDS-PAGE电泳结果（见图电泳结果（见图3）显示，与未插）显示，与未插入外源基因