高速逆流色谱原理及应用讲课教案

1、高速逆流色谱技术及应用领域高速逆流色谱技术及应用领域 晋晓峰晋晓峰 研发部副主研发部副主管管上海同田上海同田生物生物(shngw)(shngw)技术有限公司技术有限公司第一页，共31页。报告报告(bogo)内容内容 1 1 高速逆流色谱原理高速逆流色谱原理2 2 高速逆流色谱优点高速逆流色谱优点(yudin)(yudin)3 3 高速逆流色谱应用高速逆流色谱应用第二页，共31页。一、高速逆流色谱一、高速逆流色谱(s p)(s p)原原理理 第三页，共31页。液液分配色谱利用一种特殊的流体动力学现象使互不混溶的两相溶剂(固定(gdng)相和流动相)在螺旋管中高效地接触、混合、分配和传递其中固定(

2、gdng)相以一种相对均匀的方式分布在一根聚四氟乙烯管绕成的螺旋管中流动相以一定的速度通过固定(gdng)相，并按照被分离物质分配系数的不同依次洗脱而获得分离特殊特殊(tsh)(tsh)的流体动力学？的流体动力学？第四页，共31页。固定相的保留固定相的保留利用螺旋管的方向性和同步行星式运动产利用螺旋管的方向性和同步行星式运动产生的二维生的二维 离心力场形成的单向性流体动力学平衡离心力场形成的单向性流体动力学平衡（HDESHDES）从而实现从而实现(shxin)(shxin)流动相高速移动时固流动相高速移动时固定相的保留定相的保留第五页，共31页。混合区：在靠近混合区：在靠近(kojn)(koj

3、n)离心轴心大约离心轴心大约有四分之一的区域，两相有四分之一的区域，两相的激烈混合的激烈混合静置区：两相溶剂分成两静置区：两相溶剂分成两层，重相在外部，轻相在层，重相在外部，轻相在内部内部 以以10001000转转/ /分的速率进行旋转，在分的速率进行旋转，在二维力场的作用下分离管柱内混合二维力场的作用下分离管柱内混合和传递的频率可达到和传递的频率可达到1717次次/S/S，从而，从而(cng r)(cng r)实现高效的分离实现高效的分离第六页，共31页。K Cs/Cm CsCm第七页，共31页。HSCCC的工作的工作(gngzu)流流程程第八页，共31页。二、高速逆流色谱二、高速逆流色谱(

4、s p)(s p)优优点点 第九页，共31页。不用固态载体的高效液不用固态载体的高效液- -液分配色谱技术液分配色谱技术不存在样品的不可逆吸附，理论回收率不存在样品的不可逆吸附，理论回收率100%100%样品负载能力强，制备量大，重现性好样品负载能力强，制备量大，重现性好操作成本低，无制备柱消耗，后续投入较低操作成本低，无制备柱消耗，后续投入较低可采用广泛的溶剂体系和多样性的操作条件可采用广泛的溶剂体系和多样性的操作条件操作简单操作简单(jindn)(jindn)，无需太多样品前处理，无需太多样品前处理 第十页，共31页。三、高速三、高速( (o s)o s)逆流色谱逆流色谱应用应用 第十一页

5、，共31页。高速逆流色谱高速逆流色谱(s p)技术的应用技术的应用领域领域1 高速逆流色谱在中药现代化中的应用高速逆流色谱在中药现代化中的应用2 高速逆流色谱在抗生素分离纯化中的应用高速逆流色谱在抗生素分离纯化中的应用3 高速逆流色谱在异构体分离纯化中的应用高速逆流色谱在异构体分离纯化中的应用4 高速逆流色谱在食品行业中的应用高速逆流色谱在食品行业中的应用5 高速逆流色谱在化学合成中的应用高速逆流色谱在化学合成中的应用6 高速逆流色谱在生物高速逆流色谱在生物(shngw)领域中的应用领域中的应用7 高速逆流色谱在发酵产物分离纯化中的应用高速逆流色谱在发酵产物分离纯化中的应用第十二页，共31页。

6、成药质量控制成药质量控制 指纹图谱指纹图谱指导原药材种植指导原药材种植/GAP基地建设基地建设单体化合物单体化合物用于制药中间体的质用于制药中间体的质量控制量控制第十三页，共31页。实例实例1 1 大黄大黄(dihung)(dihung)有效成分有效成分的分离的分离HSCCC条件：条件：固定固定(gdng)相：乙醚相：乙醚流动相：流动相：1%NaH2PO4-1%NaOH 梯度洗脱梯度洗脱(500min内内,由由100:0-0:100) 流速流速: 2.0 ml min-1转速：转速：800 rpm样品量：样品量：120 mg 粗提物粗提物固定固定(gdng)相保留：相保留：40%机型：机型：T

7、BE-300A：rhein（大黄酸）（大黄酸）19 mg: cinnamic acid（苯乙烯酸）（苯乙烯酸）19 mg: emodin（大黄素）（大黄素）18 mg: aloe-emodin（芦荟大黄素）（芦荟大黄素）14 mg: chrysophanol （大黄酚）（大黄酚）10 mg: physcion（大黄素甲醚）（大黄素甲醚）6 mg纯度均在纯度均在98以上以上Journal of Chromatography A,2004,Volume 1052, Issues 1-2, Pages 217-221HSCCCHSCCC在分离中药在分离中药(zhngyo)(zhngyo)单体中的应用

8、（蒽单体中的应用（蒽醌类）醌类）第十四页，共31页。实例实例(shl)2 (shl)2 蛇床子有效成分的分蛇床子有效成分的分离离HSCCC条件：条件：溶剂系统溶剂系统: 石油醚石油醚-乙酸乙酯乙酸乙酯-甲醇甲醇-水水流动相：梯度洗脱流动相：梯度洗脱0-150 min:5:5:5:5下相下相150-250 min:5:5:6:4下相下相250 min后后: 5:5:6.5:3.5下相下相流速流速: 2.0 ml min-1转速转速(zhun s)：800 rpm样品量：样品量：150 mg 粗提物粗提物机型：机型：TBE-300A固定相保留：固定相保留： 60%：花椒毒素：花椒毒素 95.0 7

9、.6 mg: 异茴芹素异茴芹素 99.6 7.6 mg: 佛手苷内酯佛手苷内酯 99.7 9.7 mg: 欧前胡素欧前胡素 100 60.5 mg: 蛇床子素蛇床子素 100 50.6 mg:未知化合物未知化合物 98.1 10.2 mgJournal of Chromatography A, 2004, Volume 1055, Issues 1-2, 71-76 HSCCCHSCCC在分离中药在分离中药(zhngyo)(zhngyo)单体中的应用单体中的应用（香豆素类）（香豆素类）第十五页，共31页。Journal of Chromatography A,1102(2006)44-50实例

10、实例3 3 白花白花(bihu)(bihu)败酱异戊烯基黄酮的分离败酱异戊烯基黄酮的分离溶剂系统溶剂系统:正己烷正己烷-乙酸乙酯甲醇乙酸乙酯甲醇-水水 (5:6:6:6)流动流动(lidng)相：下相相：下相流速流速: 1.0-2.0 ml min-1转速：转速：850 rpm样品量：样品量：400 mg 粗提物粗提物固定相保留：固定相保留： 65%分离温度分离温度: 25C机型：机型：TBE-300A: orotinin （牡荆苷）（牡荆苷）99.2 38.2 mg: orotinin-5-methyl ether 98.5 19.8 mg: licoagroachalcone B 97.6

11、 21.5 mgHSCCCHSCCC在分离中药单体在分离中药单体(dn t)(dn t)中的应用中的应用( (黄酮类黄酮类) )第十六页，共31页。实例实例(shl)4 (shl)4 吴茱萸生物碱的分离吴茱萸生物碱的分离溶剂系统溶剂系统:正己烷正己烷-乙酸乙酯乙酸乙酯-甲醇甲醇-水水 (5:5:7:5)流速流速: 2.0 ml/min转速：转速：900 rpm样品量：样品量：180 mg 粗提物粗提物固定固定(gdng)相保留：相保留：50%机型：机型：TBE-300A:吴茱萸碱吴茱萸碱 98.7 28 mg:吴茱萸次碱吴茱萸次碱 98.4 19 mg:吴茱萸新碱吴茱萸新碱 96.9 21 m

12、g: 1-methy-2-(6Z,9Z)-6,9-pentadecadienyl-4-(1H)-quinolone. 98.0 16 mg: 1-methyl-2-dodecyl-4-(1H)-quinolone 97.2 12 mg J. Chromatogr. A, 2005, vol 1074/1-2 pp. 139-144HSCCCHSCCC在分离中药单体在分离中药单体(dn t)(dn t)中的应用（生物中的应用（生物碱类）碱类）第十七页，共31页。芦荟芦荟(l (l hu)hu)苷苷B B芦荟芦荟(l (l hu)hu)苷苷A A芦荟芦荟(l hu)未知物未知物芦荟提取物芦荟提取物

13、HSCCC分离图谱分离图谱第十八页，共31页。丹参提取物的丹参提取物的HSCCC分离分离(fnl)图谱图谱丹酚酸丹酚酸 B B第十九页，共31页。沙棘沙棘(sh j)提取物的提取物的HSCCC图谱图谱异鼠李素异鼠李素山奈酚山奈酚槲皮素槲皮素第二十页，共31页。高车高车( (o o ch)ch)前素前素未知物未知物泽兰泽兰(z (z ln)ln)黄黄酮酮荔枝荔枝(lzh)草提取物的草提取物的HSCCC图图谱谱第二十一页，共31页。小结：小结： HSCCC在中药中各类单体的制备均有应用在中药中各类单体的制备均有应用(yngyng)，经，经过简单的前处理（提取、萃取或大孔树脂柱）过简单的前处理（提取

14、、萃取或大孔树脂柱）后后直接上样，一次分离就能得到高纯度和高得率直接上样，一次分离就能得到高纯度和高得率的的单体，已成为天然产物分离纯化中有效的不可单体，已成为天然产物分离纯化中有效的不可替替代的分离方法。代的分离方法。第二十二页，共31页。HSCCCHSCCC在中药指纹在中药指纹(zhwn)(zhwn)图谱中图谱中的应用的应用 中药指纹图系指中药经适当处理后，采用一定的分析手段（光谱和色谱）得中药指纹图系指中药经适当处理后，采用一定的分析手段（光谱和色谱）得到的能够标示该中药特性的共有峰的图谱到的能够标示该中药特性的共有峰的图谱 中药成分复杂，指纹图谱是中药质量控制的有效方法中药成分复杂，指

15、纹图谱是中药质量控制的有效方法 20002000年年8 8月国家药品监督管理局规定中药注射剂必须建立药材和制剂的指纹月国家药品监督管理局规定中药注射剂必须建立药材和制剂的指纹图谱标准，美国图谱标准，美国FDAFDA及欧共体药审委也要求采用指纹图谱技术及欧共体药审委也要求采用指纹图谱技术 色谱法是指纹图谱的首选，传统的色谱指纹图谱方法存在缺陷（比如色谱法是指纹图谱的首选，传统的色谱指纹图谱方法存在缺陷（比如HPLCHPLC法法前处理要求严格，会有死吸附或样品的变性，对有些样品不能准确反应其特前处理要求严格，会有死吸附或样品的变性，对有些样品不能准确反应其特征）征） 高速逆流色谱法是中药指纹图谱发

16、展的一个高速逆流色谱法是中药指纹图谱发展的一个(y (y )新方向新方向第二十三页，共31页。02040608010012014001234567891011121314Time (h)Absorbance (OD280nm)0102030400100200mAU (280nm)Time (min) 01020304004080120160mAU (280nm)Time (min) 0102030400100200mAU (280nm)Time (min) B1B2B305010015020025001234567891011121314Time (h)Absorbance (OD280nm)

17、02040608010001234567891011121314Time (h)Absorbance (OD280nm)A1A2A3HSCCCHSCCC图谱图谱(tp) HPLC(tp) HPLC图谱图谱(tp)(tp)不同不同(b tn)产地丹参提取物产地丹参提取物实例实例(shl(shl)第二十四页，共31页。溶剂体系溶剂体系(tx)：石油醚：石油醚-丙酮丙酮-水水（3:3:2,v/v）样品：样品：250mg 环孢菌素粗品环孢菌素粗品检测条件：检测条件：ELSD环孢菌素环孢菌素 A98.6%，90.2%(收率收率(shu l)环孢菌素环孢菌素 C99.3，85.0%(收率收率(shu l)

18、环孢菌素环孢菌素 B98.7，88.5%(收率收率(shu l)环孢菌素环孢菌素 D98.5，86.3%(收率收率(shu l)实例实例(shl)1 (shl)1 环孢菌素粗品环孢菌素粗品 HSCCC在抗生素分离纯化中的应用在抗生素分离纯化中的应用第二十五页，共31页。溶剂体系溶剂体系(tx)：正己烷：正己烷-乙酸乙酯乙酸乙酯-甲醇甲醇-0.5氨水氨水（3:7:5:6,V/V），），检测器：检测器：ELSD；进样量：；进样量：300mg红霉素红霉素A和和C含量含量(hnling)均在均在98以上以上实例实例(shl)2 (shl)2 红霉素红霉素HSCCC在抗生素分离纯化中的应用在抗生素分离纯

19、化中的应用第二十六页，共31页。 实例实例1 1 藤黄藤黄(tn(tn hun hun) )酸异构体的分离酸异构体的分离溶剂系统溶剂系统:正己烷正己烷-甲醇甲醇-水水 (5:4:1)流动相：下相流动相：下相流速流速: 2.0 ml min-1转速：转速：900 rpm样品量：样品量：50 mg固定相保留：固定相保留： 50%分离分离(fnl)温度温度: 25CA. gambolic acid 97.2% B. epigambolic acid 97.5%闭合回路闭合回路(hul)系系统统Journal of Chromatography A, 2006, Volume 1127, 298-301 HSCCCHSCCC在异构体分离纯化中的应用在异构体分离纯化中的应用第二十七页，共31页。实例实例1 1 利用利用HSCCCHSCCC分离分离(fnl)(fnl)标准蛋白质混合物标准蛋白质混合物123溶剂体系：溶剂体系：PEG1000-PEG1000-磷酸盐体系磷酸盐体系- -水水14-16-70(%,