尚静静大创总结报告ppt

1、低温胁迫下甜瓜幼苗叶片代谢产物含量变化的研究 项目编号：AH20141036405作者：尚静静 导师：刘童光老师目录 (一）项目背景及意义（二）项目材料及实验方法（三）项目实施过程 1.H2O2含量的测定及其变化 2.超氧阴离子自由基（O2.-）产生速率的测定及其变化 3.MDA含量的测定及其变化 4.可溶性糖含量的测定及其变化 5.可溶性蛋白质含量的测定（四） 项目讨论 1.H2O2含量的变化及O2.-产生速率与幼苗耐低温的关系 2.低温胁迫对甜瓜幼苗叶片MDA含量的影响及MDA与抗寒性的关系 3.低温胁迫下可溶性糖含量变化与抗寒性的关系 4.可溶性蛋白含量的变化与抗寒性的关系（五） 项目难

2、题（六） 项目小结（七） 项目研究成果（八） 项目经费使用情况（一）1.项目背景甜瓜（Cucumis melo L.）起源于热带非洲地区，属于葫芦科（Cucurbutaceae）甜瓜属（Cucumis）的一年生蔓性草本作物。甜瓜是世界十大水果之一，果实营养丰富，色香味俱佳，多食甜瓜，有利于人体心脏和脾脏以及肠道系统的活动，深受人们喜爱。我国是世界上最早栽培甜瓜的国家之一，也是世界上甜瓜栽培面积最大、产量最高的国家之一。同时，其在国际市场上属于高档果品，市场潜力很大。（一）2.项目意义甜瓜喜温耐热，植株生长温度以2530为宜，在我省夏季甜瓜有大量种植，甜瓜1445内均可生长，温度低于10时，会受

3、到不同程度的冷害。近年来，随着我国设施园艺的快速发展，甜瓜保护地栽培日渐成为栽培、生产的主要方式。我国冬春季节甜瓜生产中经常遭遇低温冷害，长期低温对甜瓜幼苗生长甚是不利，使得低温冷害在反季节生产中问题变得日益突出。目前，在长江中下游地区，甜瓜的育苗期提前，最早可提前到元月份，定植期则可提前到2月份，在这段时间里外界温度较低，若碰到连续的阴雨天气，设施栽培内则会出现长时间低温(15)，将严重影响甜瓜的幼苗生长，引起其产量和品质下降。本项目选择安徽地区甜瓜主栽品种“早甜一号”为试材，其进行低温处理，常温下的叶片作为对照，测定叶片蔗糖、果糖、葡萄糖、淀粉等代谢产物含量的变化，探究低温胁迫下甜瓜叶片代

4、谢产物含量变化的研究。冬春季节保护地栽培的低温环境严重影响甜瓜的品质、产量和经济效益，可见研究甜瓜的抗低温性对甜瓜反季节栽培和设施栽培的稳定发展，提高甜瓜的经济效益具有十分重要的意义。（二）项目材料及实验方法1. 供试材料 甜瓜品种选用“早甜一号”，种子由安徽省农科院园艺所蔬菜育种室提供。2. 试验方法 选取籽粒饱满、大小一致的种子温汤浸种，55杀菌15min，30浸种8h，30培养箱中催芽。种子露白后播于5cm5cm的塑料穴盘中。苗期常规管理。待幼苗长到3叶1心时，移入光强为100molm-2s-1的SPX-250B-G型光照培养箱（上海博讯设备厂）内，每天光照12h。试验设处理T（昼/夜5

5、/5）、对照CK(25/25)两个温度组合处理。处理需先在昼/夜温度15/10下预处理2d，再在5/5下处理8d。在低温处理第2d、4d、6d、8d，于9:0010:00选取大小均匀植株的第二、三片真叶为材料测定各项指标，每个处理重复3次。 摘取后迅速称量、分装并用液氮速冻，然后保存于-80超低温冰箱，所有取样结束后在实验室内进行各项指标的测定。（三）项目实施过程超氧阴离子自由基（O2.-）产生速率的测定H2O2含量的测定可溶性糖含量的测定MDA含量的测定可溶性蛋白质含量的测定1.1 H2O2含量的测定 参照Ferguson等1方法，利用丙酮抽取，Ti(IV)-PAR比色法测定。取1.5g保存

6、于-80超低温冰箱的甜瓜叶片，剪碎后加入3ml预冷丙酮匀浆，4离心（10000r10min），取1ml上清液，加3ml萃取剂（CCl4:CHCl3=3:1,体积比）混匀，再加5ml蒸馏水混匀，离心（4000r/min,1min），上层水相为H2O2待测液。各取1ml待测液，一份为空白，加入终浓度为3Uml-1的过氧化氢酶（CAT），30保温10min；另一份待测液，加入等体积高温灭活的CAT酶液。两组分别加1ml0.2molL-1、pH7.8的磷酸缓冲液，再加1ml0.2molL-1的Ti(IV)-PAR显色剂，45水浴保温20min，静置1小时至室温，测508nm的吸光值，根据A508值计算

7、H2O2。1.2 H2O2含量的变化 H2O2不是自由基，但由于它具有强氧化性，也是可以造成氧毒害的活性氧之一。低温胁迫会造成植物的氧化损伤，引发 H2O2的过量产生，如果细胞中积累的过量H2O2不能够被及时清除，则会造成毒害作用，加重胁迫造成的损伤。结果表明，随着低温胁迫的时间的延长，过氧化氢的含量先增加后减少，如图1所示。2.1 超氧阴离子自由基（O2.-）产生速率的测定 参照植物生理生化实验原理和技术2，称取0.2g甜瓜叶片置于预冷的研钵中，加入1.6ml 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4、12000r下离心20min，上清液即为提取液。

8、采用羟胺氧化法3首先量取0.5ml提取液置于试管中，分别加入0.5ml PBS（0.05M，pH7.8）、1ml 1mM盐酸羟胺溶液后摇匀；置于25保温1h后，依次先加入1ml 17mM对氨基苯磺酸、1ml 7mM -萘胺，混合后快速摇匀；再次置于25显色20min进行测定；以水作为对照进行调零，取粉红色水相液在530nm波长处测定吸光值。2.2 O2.-产生速率的变化 启动膜脂过氧化或膜脂脱脂作用6是O2.-伤害植物的机理之一,从而使膜结构被破坏。刚开始叶片是不是经过低温锻炼，O2.-产生的速率都会增加。但是处理组比对照O2.-产生速率低，随着时间延长甜瓜幼苗叶片在4d是达到峰值，之后O2.

9、-产生速率开始下降，处理组甜瓜幼苗叶片8d测得的O2.-产生速率比2d时减低12.24,如图2所示。3.1 MDA含量的测定 取0.5g保存于-80超低温冰箱的叶片，加入pH7.5的50mmol/L磷酸缓冲液10ml，于冰浴中研磨提取，按李柏林和梅慧生4的方法测定MDA的含量。3.2 MDA含量的变化 MDA是植物膜脂过氧化作用的最终产物，是膜系统受害的重要指标之一7。从图3可以看出，无论是不是经过低温锻炼，甜瓜幼苗叶片MDA含量都随时间的延长而增加，且经低温胁迫的MDA含量高于对照，在处理2d时，MDA含量高于对照36.87,在处理8d时，MDA含量高于对照77.23，如图3所示。4.1 可

10、溶性糖含量的测定 称取2g低温处理的甜瓜叶片，用10mL乙醇（分次加入）研碎，转入离心管，于80下浸提1h，4000r离心，收集上清液；再分两次用5mL80%乙醇将沉淀悬浮，80下浸提10min，并离心，取上清液合并，定容至25mL，混匀后取10mL用蒸发皿于烘箱中蒸干（分次加入），残渣用1mL超纯水溶解，并用0.22m滤膜进行过滤。利用高效液相色谱法来测定蔗糖、葡萄糖、果糖的含量。4.2 可溶性糖含量的变化表1 低温胁迫下甜瓜幼苗叶片可溶性糖含量的变化 由表1可以看出处理T（昼/夜5/5）的可溶性糖含量大与对照CK(25/25)的可溶性糖含量，同时蔗糖的含量最多，可溶性糖的含量随着时间的延长

11、表现出先减少后增加的趋势。5.1 可溶性蛋白质含量的测定采用马斯亮蓝比色法5，并以牛血清蛋白制作标准曲线。称取0.2g甜瓜叶片置于预冷的研钵中，加入1.6ml 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4、12000r下离心20min，上清液即为酶粗提液。吸取20l提取液，加入0.05M、pH7.8磷酸缓冲液80l，即稀释成0.1ml提取液；再加入2.9ml考马斯亮蓝G-250溶液，反应2min后在595nm下比色，测定吸光度，并通过标准曲线查得蛋白质含量（以100l缓冲液加2.9ml考马斯亮蓝G-250为对照调零）。按公式1计算样品可溶性蛋白质含量。可溶

12、性蛋白质含量（mg/g）=(CVT)/(WVS1000) 公式1式中：C为标准曲线查得的蛋白质含量（g）；VT为提取液总体积（稀释后的体积ml）；VS为测定时所用提取液体积（ml，20l）；W为样品鲜重（g）。5.2可溶性蛋白含量的变化 如图4，处理组甜瓜幼苗叶片可溶性蛋白含量随着时间的延长而增加，而且处理组可溶性蛋白的含量比对照组含量高。在处理2d、8d时甜瓜幼苗叶片可溶性蛋白含量分别是对照组的1.5倍、1.9倍，说明低温胁迫下可溶性蛋白的含量比正常条件下增长的快。（四）小结与讨论 1.H2O2含量的变化及O2.-产生速率与幼苗耐低温的关系 SOD（超氧化物歧化酶）、POD（过氧化物酶）、C

13、AT（过氧化氢酶）是植物体内活性氧清除剂。SOD是植物酶促防御系统的重要保护酶，它的活性大小与植物的抗寒性密切相关，因为它能防御或减轻活性氧或其他过氧化物自由基对细胞膜系统的伤害，保护正常代谢。已经有不少研究证明，作为植物低温胁迫下的膜保护酶POD，在植物遭受低温逆境中，迅速清除或减轻低温对植物的伤害，而提高抗寒能力。POD酶高植物在保护酶系统中主要起酶促降解过氧化氢的作用，从而使在低温胁迫的过程中产生的有害物质对细胞的迫害，表现出一定的抗逆性。CAT主要存在于过氧化体中，是胁迫条件下针对H2O2的过量产生起调节作用的物质，作为H2O2的重要清洁剂，在维持H2O2的动态平衡中起了重要作用。SO

14、D、POD、CAT相互协调配合，清除过剩的自由基，使植物体内的自由基维持在正常的动态平衡水平，来提高植物的抗逆性8。本试验在对H2O2的含量和O2.-的产生速率测定的同时，也对SOD、POD、CAT的活性进行了检测。结果表明，而随着低温胁迫时间的延长，H2O2的含量和O2.-的产生速率先增加后减少，SOD、POD、CAT的活性也是先增加后降低。SOD、POD、CAT的活性增加的可能原因是低温(5)处理初期，甜瓜幼苗O2.-的产生速率和H2O2含量增加，诱导了SOD、POD等保护酶活性的提高，从而推测O2.-的产生速率和H2O2含量增加可以提高低温胁迫下甜瓜幼苗叶片SOD、POD、CAT的活性，

15、说明低温胁迫初期H2O2含量的增加可以提高甜瓜幼苗的抗寒性。4d后H2O2的含量和O2.-的产生速率下降的可能原因是低温胁迫下细胞结构遭到破坏、呼吸速率减慢导致。2.低温胁迫对甜瓜幼苗叶片MDA含量的影响及MDA与抗寒性的关系 MDA是膜脂过氧化分解的产物，MDA的积累能对膜和细胞造成进一步的伤害，通常用其作为膜脂过氧化指标来表示细胞膜脂过氧化程度和植物对逆境条件反应的强弱9。从试验结果可以看出，随着低温胁迫时间的延长，MDA含量明显增加，是因为活性氧产生过剩，而导致膜脂氧化作用加强，说明低温对甜瓜叶片的细胞膜造成了破坏。我们从图中看到处理组低温锻炼后，随时间的延长MDA含量虽在逐渐增加，但是

16、MDA含量增加的幅度小于对照MDA含量增加的幅度，说明甜瓜幼苗对低温的敏感性降低，这意味着甜瓜的抗寒性增强。3.低温胁迫下可溶性糖含量变化与抗寒性的关系 可溶性糖是细胞内的保护物质，它能降低冰点，来提高原生质保护能力，它保护蛋白质胶体避免遇冷变性凝固10。由表1可知，处理组的可溶性糖含量比对照组含量大，并且可溶性糖含量表现出先减少后增加的现象，说明低温胁迫给甜瓜幼苗生长造成影响，可能因质量代谢活动，糖的合成和向其他器官转移平衡被打破，当糖含量减少到一定程度时，植物会调整其自身的代谢迅速提高糖含量，来适应逆境环境。已有研究表明，低温诱导淀粉水解酶活性，加速淀粉水解，增加可溶性糖的含量，提高细胞液

17、浓度，从而提高抗寒性11。简令成12认为，在低温胁迫的初期，植物可能依赖其细胞内可溶性糖含量的增加来抵御低温伤害。因此，可以利用适当的低温对幼苗处理使可溶性糖含量增加，提高渗透调节能力，来提高甜瓜的抗寒性。此外，徐跃进13的研究成果表明，随着温度的降低，西葫芦的可溶性糖含量也比一般的品种高。由于甜瓜和西葫芦都属于葫芦科，他们的生理生化是相似的，因此在甜瓜早季节种植以及温室大棚种植时，品种的选择对甜瓜抗寒性也是很重要的。4.可溶性蛋白含量的变化与抗寒性的关系 已有研究表明，低温胁迫引起植物细胞蛋白质的变化，主要表现在可溶性蛋白和酶类的变化及产生抗寒性蛋白，而可溶性蛋白具有较强的亲水性，它能明显增

18、强细胞的持水力，可溶性蛋白的增加可以束缚更多的水分，减少低温胁迫下原生质因结冰而受到伤害致死的机会，从而提高植物提抗寒性。本试验结果为低温胁迫下甜瓜幼苗叶片可溶性蛋白含量增加，表明低温诱导新蛋白的产生，这可能是机体对低温环境适应的表现，而新蛋白的产生可有利于甜瓜的抗寒性。（五） 项目难题 本试验只是对甜瓜叶片的几种主要代谢产物进行测定，在测定淀粉含量是由于多次滴定碘液测定都没有出新沉淀，而放弃淀粉含量测定实验。甜瓜对低温逆境的适应过程极为复杂，需要多项生理生化过程的统一和协调，诸多的生理生化过程之间的相互关联程度以及更深层次的作用机理需要继续研究。（六）项目小结 综上所述，低温胁迫初期H2O2含量的增加，可以刺激保护酶活性增强，来减少低温对甜瓜的伤害。因此，用适当浓度的H2O2溶液喷施甜瓜叶片，可以提高甜瓜的抗寒性。低温胁迫会使MDA含量增加，使细胞膜结构遭到破坏，但随着胁迫时间的延长，MDA含量增加的幅度减慢说明，甜瓜叶片开始适应低温环境。可溶性糖是冷害和冻害条件下细胞的保护物质，其含量与多数植物抗寒性成正比，可溶性蛋白含量的增加可以增强细胞的渗透调节功