基因个体化治疗

1、个体化药学服务与基因相关概念人类基因组计划人类基因组计划n1990年正式启动人类基因组测序计划年正式启动人类基因组测序计划, 2003年年完成。完成。 识别人类基因组的所有大约识别人类基因组的所有大约3万个万个DNA测定组成人类基因组测定组成人类基因组DNA的约的约30亿对核苷酸亿对核苷酸的序列的序列 个体化用药个体化用药主要潮流，大势所趋主要潮流，大势所趋 WHO：2000年提出，21世纪步入“3P”时代预防（preventive），预测（predictable)和个体化（personal） 美国FDA：2006全美3600万份用药记录中，880万份（24.3%）使用了说明书中有基因组生物标

2、记信息的药物。 FDA：2013.12，已经批准超过200个需要患者基因信息指导才能准确治疗的药物，涉及约40%的患者。 三甲评审标准要求：进行个体化给药方案的研究与监测We wouldnt think of buying shoes in a single size我们不会愿意买只有一个尺码的皮鞋So why should we be satisfied with one-size-fits-all medicine?那为什么我们就满足于千人一方呢？ 据世界卫生组织的最新统计，各国住院病人发生药品不良反应的比率在10%10%至20%20%，其中5%5%的患者会因为严重的药品不良反应而死亡。

3、目前全世界死亡的病人中，约有1/31/3的患者死于用药不当，药品不良反应致死占社会人口死因的第4 4位。 药物毒性或不良反应的发生往往是因为药物反应的个体差异所致；个体差异使药品的效果差异显著。个体化药学临床应用的意义个体化药学临床应用的意义降低医疗事故发生率缩短平均住院日提高医院收入为临床用药提供更精确的指导（精准剂量,减少不良反应，药物相互作用等）疗效好疗效好疗效不好或无疗效疗效不好或无疗效毒副反应毒副反应药物反应的个体差异药物反应的个体差异相同药物治疗的一组人群相同药物治疗的一组人群基因基因? 环境环境?药物不良药物不良反应反应药物效应 据世界卫生组织的最新统计，各国住院病人发生药品不良

4、反应的比率在10%10%至20%20%，其中5%5%的患者会因为严重的药品不良反应而死亡。 目前全世界死亡的病人中，约有1/31/3的患者死于用药不当，药品不良反应致死占社会人口死因的第4 4位。 药物毒性或不良反应的发生往往是因为药物反应的个体差异所致；个体差异使药品的效果差异显著。相关药物的剂量范围相关药物的剂量范围各类常用药物的有效率各类常用药物的有效率0%0%10%10%20%20%30%30%40%40%50%50% 60%60%70%70%80%80%90%90% 100%100%基因基因环境因素环境因素IIII糖尿病糖尿病乳腺癌乳腺癌男性心肌梗死男性心肌梗死原发性高血压病原发性高

5、血压病冠心病冠心病I I糖尿病糖尿病苯妥英苯妥英锂锂水扬酸水扬酸异戊巴比妥异戊巴比妥双香豆素双香豆素阿司匹林阿司匹林安替匹林安替匹林保泰松保泰松遗传和非遗传因素在药物代谢中的作用遗传和非遗传因素在药物代谢中的作用新的医学模式新的医学模式:个体化治疗（个体化治疗（Personalized Therapy）根据分子诊断提出治疗方案根据分子诊断提出治疗方案诊断诊断分子诊断分子诊断- -预测反应预测反应 治疗治疗理想反应理想反应药理学药理学 + 基因组学基因组学基因是载有特定生物遗传信息的基因是载有特定生物遗传信息的DNADNA分子片断，人类基因包括两大分子片断，人类基因包括两大区域区域:1.:1.编

6、码区编码区( (占占5%);2.5%);2.侧翼序列侧翼序列 DNADNA分子是由由腺嘌呤（腺嘌呤（A A） 、胞嘧啶、胞嘧啶(C(C）、鸟嘌呤（）、鸟嘌呤（G G）、胸腺嘧啶）、胸腺嘧啶（T T，DNADNA专有）和专有）和尿嘧啶（尿嘧啶（U U，RNARNA专有）碱基排列组成专有）碱基排列组成, ,每个人都存每个人都存在差异，将其称为多态性。在差异，将其称为多态性。 人类的基因发现几百万由单一的碱基变换而形成的位点既人类的基因发现几百万由单一的碱基变换而形成的位点既SNPSNP，它意，它意味着个人间最小的遗传差异。味着个人间最小的遗传差异。 A:腺嘌呤腺嘌呤T:T:胸嘧啶胸嘧啶G:G:鸟嘌

7、呤鸟嘌呤C:C:胞嘧啶胞嘧啶CGTTCTCTATTAACACGTTCTCTATTAACAGCAAGAGATAATTGTGCAAGAGATAATTGTCGTCGTG GCTCTATTAACACTCTATTAACAGCAGCAC CGAGATAATTGTGAGATAATTGT10q24.2Chromosome 10CYP2C9 genen9 Exonn55kbn490 AA10q24.2C CGGT TA ASNPCYP2C9*1Normal enzymatic activityG A G G A C C G T G T T C A AGluAspArgValGln53CYP2C9*2No enz

8、ymatic activityT430CT (Arg144Cys)Cys单核苷酸多态性单核苷酸多态性 （SNP）n导致人类遗传易感性的重要因素导致人类遗传易感性的重要因素n导致人类药物代谢和反应差异的重要因素导致人类药物代谢和反应差异的重要因素GT突变突变野生型野生型 突变型突变型18变态反应变态反应 药动学药动学 代谢代谢 吸收、分布、排泄吸收、分布、排泄药效学药效学靶向结合作用靶向结合作用免疫系统免疫系统毒副作用毒副作用治疗作用治疗作用药物耐受药物耐受药物代谢酶药物代谢酶药物转运蛋白药物转运蛋白 药物靶蛋白、受体药物靶蛋白、受体人类白血球抗原人类白血球抗原药物作用药物作用基因与药物作用的关

9、系原理基因与药物作用的关系原理基基因因 蛋白合成蛋白合成举例举例：抗癫痫药丙戊酸钠的相关代谢酶抗癫痫药丙戊酸钠的相关代谢酶CYP2C19其基因最主要的两个突变位点其基因最主要的两个突变位点 CYP2C19*2:第第5外显子外显子681位位 GA CYP2C19*3:第第4外显子外显子636位位 GA产生终止密码，过早终产生终止密码，过早终止蛋白合成，产生无活止蛋白合成，产生无活性性CYP2C19CYP2C19酶，降低对酶，降低对丙戊酸代谢，使其在体丙戊酸代谢，使其在体内蓄积，发生毒副反应内蓄积，发生毒副反应.C C A T T G A C.C C A T T G A C.G G T A A C

10、 T G.G G T A A C T G.C C A T T G A C.C C G T T G A C.G G T A A C T G.G G C A A C T G.C C G T T G A C.C C G T T G A C.G G C A A C T G.G G C A A C T G.A/A野生型纯野生型纯合子合子单核苷酸多态性形成三种基因型和表型单核苷酸多态性形成三种基因型和表型XXXA/a野生型杂合野生型杂合子子a/a突变纯合子突变纯合子高活性高活性中活性中活性低活性低活性GCCCGCCCA ACCTCCTC CGCCCGCCCG GCCTCCTC C甲病人甲病人乙病人乙病人W

11、ild typeMutationWild typeWild typeConcentrationMutationMutationConcentrationTimeTimeCYP450CYP450CYP450CYP450 相同的剂量不同的血浆浓度相同的剂量不同的血浆浓度吸收吸收 - - 慢慢 - - 快快受体受体 - - 缺失缺失 - - 丰富丰富代谢代谢 - - 慢速慢速 - - 中等中等 - - 快速快速 - - 超快速超快速排泄排泄 - - 缓慢缓慢 - - 正常正常药物体内过程药物体内过程) )吸收吸收药物代谢酶药物代谢酶药物转运药物转运分布分布药物转运药物转运代谢代谢药物代谢药物代谢酶酶

12、排泄排泄药物转运药物转运CYP 450CYP 450 主要存在于肝微粒体中, , 它的活性决定药物的代谢速率, ,与药物的清除率有着直接关系。CYP 450CYP 450酶系的基因主要有CYP1 ,CYP2 ,CYP3 CYP1 ,CYP2 ,CYP3 三家族, ,有以下几种重要的P450 P450 酶: CYP 1A2: CYP 1A2、CYP2A6CYP2A6、CYP2C9CYP2C9、CYP2C19CYP2C19、CYP2D6CYP2D6、CYP2E1CYP2E1、CYP3A4CYP3A4。根据根据CYP2D6CYP2D6基因型调整抗抑郁药剂量基因型调整抗抑郁药剂量38383939米帕明

13、多虑平马普替林曲米帕明地昔帕明去甲替林氯米帕明帕罗西丁文拉法辛阿米替林米安色林PMIMEMUM182182132132174174808030 012812881813838174174129129929281811321321791794141818112512598981191191521529292118118138138747475759393115115135135949411611613213270708484110110130130646411511593936060148148170170525238383838% 平均剂量关于CYP2D6的表型判断举例：关于举例：关于CYP2

14、D6的表型判断，的表型判断，CYP2D6属于细胞色素属于细胞色素P450酶酶常见药物代谢酶基因型及表型判断常见药物代谢酶基因型及表型判断1 1受体基因突变药物计量调整受体基因突变药物计量调整26 美托洛尔，美托洛尔， 根据根据CYP2D6基因调整剂量基因调整剂量高血脂药物及硝酸甘油高血脂药物及硝酸甘油雌激素与儿童智商相关基因雌激素与儿童智商相关基因【英国每日邮报网站英国每日邮报网站3 3月月2323日报道】科学家发现了一种会增加儿童智商低下风险的基日报道】科学家发现了一种会增加儿童智商低下风险的基因。这个发现意味着，在新生儿出生后不久对其进行一项基因检测，可能会有助于发现因。这个发现意味着，在

15、新生儿出生后不久对其进行一项基因检测，可能会有助于发现存在上述问题的婴儿，甚至为应对这一问题确定治疗方案做好准备。存在上述问题的婴儿，甚至为应对这一问题确定治疗方案做好准备。 科学家认识到，如果科学家认识到，如果7 7岁以下儿童在体内出现一种常见基因变异体的同时，甲状腺岁以下儿童在体内出现一种常见基因变异体的同时，甲状腺激素水平也出现下降，那么他们的智商变得异常低下的可能性将为其他儿童的激素水平也出现下降，那么他们的智商变得异常低下的可能性将为其他儿童的4 4倍。倍。 每年约有每年约有4%4%的新生儿带有这种基因，而且体内的甲状腺激素水平较低。的新生儿带有这种基因，而且体内的甲状腺激素水平较低

16、。 给这些儿童服用含有甲状腺激素的药片，或许可以帮助其大脑正常发育并达到正常给这些儿童服用含有甲状腺激素的药片，或许可以帮助其大脑正常发育并达到正常水平的智商。每年将会有水平的智商。每年将会有3 3万名儿童因此受益。万名儿童因此受益。 这项新研究的关注重点是与细胞内甲状腺激素的产生有关的这项新研究的关注重点是与细胞内甲状腺激素的产生有关的型脱碘酶。型脱碘酶。 研究人员此前已将这种酶的基因突变与包括糖尿病和高血压在内的其他健康问题联研究人员此前已将这种酶的基因突变与包括糖尿病和高血压在内的其他健康问题联系在一起。系在一起。 在上述新研究中，加的夫大学和布里斯托尔大学的科学家对在上述新研究中，加的

17、夫大学和布里斯托尔大学的科学家对31233123名名7 7岁以下儿童的基因岁以下儿童的基因数据进行了分析。这些儿童也接受了智商测试。数据进行了分析。这些儿童也接受了智商测试。 体内甲状腺激素水平较低且存在体内甲状腺激素水平较低且存在型脱碘酶变异体的那些儿童，智商低于型脱碘酶变异体的那些儿童，智商低于8585的可能的可能性是其他儿童的性是其他儿童的4 4倍。而仅存在甲状腺激素水平较低问题的儿童不会面临更多智商低下倍。而仅存在甲状腺激素水平较低问题的儿童不会面临更多智商低下的风险。的风险。 加的夫大学的皮特加的夫大学的皮特泰勒博士说：泰勒博士说：“如果其他研究证实了我们的科研成果，那么，如果其他研

18、究证实了我们的科研成果，那么，除了常规的新生儿甲状腺激素筛查外，同时进行针对这种基因变异体的测试，将有助于除了常规的新生儿甲状腺激素筛查外，同时进行针对这种基因变异体的测试，将有助于识别出今后最有可能变得智商低下的那些儿童。识别出今后最有可能变得智商低下的那些儿童。” 相关研究结果是在于利物浦召开的英国内分泌协会大会上发布的。相关研究结果是在于利物浦召开的英国内分泌协会大会上发布的。 儿童儿童DIO2DIO2基因突变导致智商低下的研究基因突变导致智商低下的研究在上述新研究中，加的夫大学和布里斯托尔大学的科学家对在上述新研究中，加的夫大学和布里斯托尔大学的科学家对31233123名名7 7岁以下

19、儿童的基因岁以下儿童的基因数据进行了分析。这些儿童也接受了智商测试。数据进行了分析。这些儿童也接受了智商测试。 体内甲状腺激素水平较低且存在体内甲状腺激素水平较低且存在型脱碘酶变异体的那些儿童，智商低于型脱碘酶变异体的那些儿童，智商低于8585的可能的可能性是其他儿童的性是其他儿童的4 4倍。而仅存在甲状腺激素水平较低问题的儿童不会面临更多智商低下倍。而仅存在甲状腺激素水平较低问题的儿童不会面临更多智商低下的风险。的风险。 加的夫大学的皮特加的夫大学的皮特泰勒博士说：泰勒博士说：“如果其他研究证实了我们的科研成果，那么，如果其他研究证实了我们的科研成果，那么，除了常规的新生儿甲状腺激素筛查外，

20、同时进行针对这种基因变异体的测试，将有助于除了常规的新生儿甲状腺激素筛查外，同时进行针对这种基因变异体的测试，将有助于识别出今后最有可能变得智商低下的那些儿童。识别出今后最有可能变得智商低下的那些儿童。” 相关研究结果是在于利物浦召开的英国内分泌协会大会上发布的。相关研究结果是在于利物浦召开的英国内分泌协会大会上发布的。 儿童儿童DIO2DIO2基因突变导致智商低下的研究基因突变导致智商低下的研究本世纪，肿瘤的药物治疗取得了巨大成就。但肿瘤细胞的多药耐药性和肿瘤药物治疗的个体差异常造成肿瘤化疗的失败，且引起严重的毒副反应。个体药物治疗的药效和毒性的差异在很大程度上受到遗传因素如药物代谢酶、药物

21、转运蛋白和药物作用靶点等药物相关基因的遗传多态性的影响。所以抗恶性肿瘤药临床有效率为30-80 %30-80 %肿瘤个体化治疗与肿瘤个体化治疗与基因检测基因检测 根据病人的遗传特征, ,选择最有效的疾病治疗方法，更好地控制疾病的进展甚至预防疾病的发生，实现最佳的医学治疗效果。 在合适的时间(Right Time)(Right Time)给合适的病人(Right Patient)(Right Patient)施行合适的治疗(Right (Right Treatment),Treatment),达到肿瘤个体化治疗肿瘤个体化治疗与肿瘤个体化治疗与基因检测基因检测 肿瘤个体化治疗包括靶向治疗和化疗两部

22、分: : 靶向治疗: :通过实时定量、基因测序、FISHFISH等技术检测肿瘤患者基因拷贝及基因突变信息，根据检测结果进行靶向治疗。 个体化化疗：通过实时定量、基因分型、mRNAmRNA定量等技术，检测患者肿瘤标本或血液标本的mRNAmRNA表达、DNADNA的SNPSNP分型，确定患者对化疗药物的敏感性和毒性反应并确定化疗剂量。肿瘤个体化治疗与肿瘤个体化治疗与基因检测基因检测肿瘤细胞基因表达与化疗肿瘤细胞基因表达与化疗药物药物突变基因与化疗突变基因与化疗药物药物肿瘤化疗疗效及毒副作用基因检测肿瘤化疗疗效及毒副作用基因检测原 位 杂 交 技 术 2014-03-19原 位 杂 交 技 术原位杂

23、交技术的历史发展二原位杂交技术的原理及分类三原位杂交技术的一般过程四原位杂交技术的应用一、原位杂交技术的历史发展 原位杂交技术原位杂交技术(In situ hybridization(In situ hybridization，ISH)ISH)是分子生物学是分子生物学、组组织化学及细胞学相结合而产生的一门新兴技术，始于织化学及细胞学相结合而产生的一门新兴技术，始于2020世纪世纪6060年代。年代。19691969年美国耶鲁大学的年美国耶鲁大学的GallGall等首先用爪蟾核糖体基因等首先用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，将该基因进行定位，与此同探针与其卵母细胞杂交，将该基因进行定位，与此

24、同时时 BuongiornoNardelliBuongiornoNardelli和和AmaldiAmaldi等等(1970)(1970)相继利用同位素标记相继利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位，从而创造了原位杂交核酸探针进行了细胞或组织的基因定位，从而创造了原位杂交技术。自此以后，由于分子生物学技术的迅猛发展，特别是技术。自此以后，由于分子生物学技术的迅猛发展，特别是2020世纪世纪7070年代末到年代末到8080年代初，分子克隆、质粒和噬菌体年代初，分子克隆、质粒和噬菌体DNADNA的构的构建成功，为原位杂交技术的发展奠定了深厚的技术基础。建成功，为原位杂交技术的发展奠定了深厚

25、的技术基础。 二、原位杂交技术的原理及分类 概念： 原位杂交技术(In situ hybridization，ISH)是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织，细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段。原理：利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸(即 探针)与组织、细胞或染色体上待测 DNA或 RNA互补配对，结合成专一 的核酸杂交分子，经一定的检测手段 将待测核酸在组织、细胞或染色体上 的位置显示出来。原位杂交法分类1、 基因组原位杂交技术基因组原位杂交技术基因组原位杂交基因组原位杂交(GISH)(GISH)技术是技术是202

26、0世纪世纪8080年代末发展起来的一种原位杂交技术。它主要是利年代末发展起来的一种原位杂交技术。它主要是利用物种之间用物种之间DNADNA同源性的差异，用另一物种的基因组同源性的差异，用另一物种的基因组DNADNA以适当的浓度作封阻，在靶染色体以适当的浓度作封阻，在靶染色体上进行原位杂交。上进行原位杂交。 2 2、荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术荧光原位杂交荧光原位杂交(FISH)(FISH)技术是在已有的放射性技术是在已有的放射性 原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放 射性射性DNADNA分子原位杂交技术。它利用荧光标记分子原位杂交技术。它利用荧光标记

27、 的核酸片段为探针，与染色体上或的核酸片段为探针，与染色体上或DNADNA显微切显微切 片上的特异片上的特异性性杂交，通过荧光检测系杂交，通过荧光检测系 统统( (荧光显微镜荧光显微镜) )检测信号检测信号DNADNA序列在染色体或序列在染色体或 DNADNA显微切片上的目的显微切片上的目的DNADNA序列，进而确定其杂序列，进而确定其杂 交位点。交位点。3 、多彩色荧光原位杂交技术多彩色荧光原位杂交技术多彩色荧光原位杂交(mFISH)是在荧 光原位杂交技术的基础上发展起来的 一种新技术，它用几种不同颜色的荧 光素单独或混合标记的探针进行原位 杂交，能同时检测多个靶位，各靶位 在荧光显微镜下和

28、照片上的颜色不同， 呈现多种色彩。4、原位原位PCRPCR原位PCR技术是常规的原位杂交技术与PCR技术的有机结合，即通过PCR技术对靶核酸序列在染色体上或组织细胞内进行原位扩增使其拷贝数增加，然后通过原位杂交技术进行检测，从而对靶核酸序列进行定性、定位和定量分析。原位杂交法分类三、原位杂交技术的一般过程以经过标记的已知核酸分子为探针以细胞内与探针序列互补的特异核酸分子为靶分子在一定条件下使探针与靶核酸分子在原位发生杂交再对其探测探针探针标记标记靶核酸靶核酸分子分子杂交杂交检测检测一）、探针 是含有互补顺序的外源性被标记的DNA或RNA片段，是在原位杂交中用于检测细胞内特定DNA或RNA顺序定

29、位的特殊试剂，探针的碱基序列是已知的，只能与特定的核酸分子结合上1、cDNA2、RNA 3、寡核苷酸 1、cDNA (complementary DNA)互补于mRNA的DNA分子（长度为数百-数千碱基对） 克隆于质粒中，可以无限繁殖，取之不尽 较稳定，不易被降解 标记方法可靠易行优点优点： 杂交效率比DNA探针高 在检测mRNA时所形成的RNA-mRNA杂交体 比DNA-mRNA杂交体稳定 可以同时得到同义RNA链和反义RNA链 缺点： 2、RNA RNA是单链分子（探针长度50-300碱基对） 这类探针是根据靶分子而设计序列 在DNA合成仪上用化学方法合成 优点：形成杂交体快速 （序列短链

30、，杂交时易于穿透） 缺点：特异性较低（短链和简单） 短链探针 (长度10-50个核苷酸) 3、寡核苷酸 二）、探针标记1、标记物 （1）放射性标记物 （2）非放射性标记物2、标记方法 （1）DNA探针标记 （2）RNA探针标记 （3）寡核苷酸探针标记 1、标记物高度灵敏性；高度灵敏性；标记物与核酸探针结合，应绝对不能影响核酸探针与标记物与核酸探针结合，应绝对不能影响核酸探针与模板的结合能力及结合的特异性；模板的结合能力及结合的特异性；当用酶促方法进行标记时，应对酶促活性（当用酶促方法进行标记时，应对酶促活性（KmKm值）无值）无多大影响，以保证标记反应的效率和标记产物的比活性多大影响，以保证标

31、记反应的效率和标记产物的比活性；高度特异性；高度特异性；较高的化学稳定性，保存时间长，标记及检测方法简较高的化学稳定性，保存时间长，标记及检测方法简单；单；对环境无污染，对人体无损伤；对环境无污染，对人体无损伤；价格低廉等。价格低廉等。标记物分类放射性标记物：同位素 5 5S S、3333P P、3232P P 和和 3 3H H等等非放射性标记物：荧光素荧光素 生物素生物素 地高辛地高辛 溴脱氧尿嘧啶等溴脱氧尿嘧啶等某种单核苷酸某种单核苷酸 在单核苷酸分子中导入某个原子、在单核苷酸分子中导入某个原子、 功能基团或侧链分子作为标记物，功能基团或侧链分子作为标记物， 对碱基配对不造成影响对碱基配

32、对不造成影响 35S-UTP 35S-dATP 35S-dCTP 32P-UTP32P-dATP等等等等四甲基罗达明-UTP 生物素-UTP (Bio-UTP) 地高辛-dUTP (Dig-dUTP) 溴脱氧尿嘧啶本身为标记分子2、标记方法（1）DNADNA探针标记探针标记 切口移位法切口移位法 随机引物法随机引物法（2）RNARNA探针标记探针标记在体外转录技术中与探针制备同时完成在体外转录技术中与探针制备同时完成（3）寡核苷酸探针标记寡核苷酸探针标记末端转移法末端转移法切口平移法随机引物法 三）、靶核酸分子或靶序列）：或靶序列）： 指所要探测的核酸分子或核苷酸序列指所要探测的核酸分子或核苷

33、酸序列 （DNA 或或RNA）可以是中期染色体上的或是间期细可以是中期染色体上的或是间期细 胞核内的，也可以是线粒体胞核内的，也可以是线粒体DNA或或 病毒病毒DNA可以是编码细胞合成的任何蛋白质分子可以是编码细胞合成的任何蛋白质分子 的的mRNA，也可以是核糖体，也可以是核糖体rRNA 线粒体或病毒线粒体或病毒RNA 四）、杂交1、杂交体 hybrids DNA-DNA杂交双链分子杂交双链分子2、杂交条件（1 1）杂交液）杂交液 （2 2）探针浓度（）探针浓度（3 3）温度（）温度（4 4）pH pH （5 5）时间）时间（1 1）、杂交液）、杂交液 钠盐（杂交效率钠盐（杂交效率 非特异反应

34、非特异反应） 甲酰胺（使杂交所需温度降低甲酰胺（使杂交所需温度降低裂解红细胞裂解红细胞） 硫酸葡聚糖（提高探针浓度）硫酸葡聚糖（提高探针浓度） 牛血清白蛋白和载体牛血清白蛋白和载体DNADNA等等 （阻断探针与组织非特异结合，（阻断探针与组织非特异结合， 背景）背景）杂交条件（2）、探针浓度探针浓度影响杂交反应的速度 放射性标记探针0.5g/ml 非放射性为2g/ml 最适宜的探针浓度要经实验摸索得到确定（1 1）杂交液）杂交液 （2 2）探针浓度（）探针浓度（3 3）温度（）温度（4 4）pH pH （5 5）时间）时间杂交条件（3）、温度杂交时温度一般低于相应杂交体的杂交时温度一般低于相应

35、杂交体的TmTm值值2525TmTm值：是核酸的融解温度，是一半双链分子解链时的温度）值：是核酸的融解温度，是一半双链分子解链时的温度） 当杂交液含当杂交液含50%50%甲酰胺、盐浓度甲酰胺、盐浓度0.75mol/L0.75mol/L左右时左右时 杂交温度：杂交温度： 对对DNADNA探针是探针是4242 对对RNARNA探针是探针是50-5550-55 对寡核苷酸探针是对寡核苷酸探针是37371）杂交液）杂交液 （2）探针浓度（）探针浓度（3）温度（）温度（4）pH （5）时间）时间杂交条件（4 4）、）、PHPHpH在在5-9范围内，杂交体形成不受影响范围内，杂交体形成不受影响 常用缓冲液常用缓冲液pH为为6.5-7.5（5 5）、时间）、时间一般探针浓度下，杂交反应在一般探针浓度下，杂交反应在4