发酵过程的代谢控制

1、发酵过程控制是发酵的重要部分发酵过程控制是发酵的重要部分控制难点：过程的不确定性和参数的非线性控制难点：过程的不确定性和参数的非线性第一节第一节 发酵过程工艺控制的目的、发酵过程工艺控制的目的、 研究的方法和层次研究的方法和层次一一 发酵过程的种类发酵过程的种类分批培养分批培养补料分批培养补料分批培养半连续培养半连续培养连续培养连续培养1 1、 分批发酵分批发酵简单的过程，培养基中接入菌种以后，没有物料简单的过程，培养基中接入菌种以后，没有物料的加入和取出，除了空气的通入和排气。整个过的加入和取出，除了空气的通入和排气。整个过程中菌的浓度、营养成分的浓度和产物浓度等参程中菌的浓度、营养成分的浓

2、度和产物浓度等参数都随时间变化。数都随时间变化。微生物生长分为：迟滞期、对数生微生物生长分为：迟滞期、对数生长期、稳定期和死亡期长期、稳定期和死亡期 在迟滞期，菌体没有分裂只有生长。在迟滞期，菌体没有分裂只有生长。当细胞内的与细胞分裂相关的物质浓当细胞内的与细胞分裂相关的物质浓度达到一定程度，细胞开始分裂，比度达到一定程度，细胞开始分裂，比生长速率几近常数。这个时期称为对生长速率几近常数。这个时期称为对数生长期数生长期随着细胞生长，培养液中的营养物随着细胞生长，培养液中的营养物减少，废物积累，导致细胞生长速减少，废物积累，导致细胞生长速率下降，进入减速期和稳定期。最率下降，进入减速期和稳定期。

3、最后当细胞死亡速率大于生成速率，后当细胞死亡速率大于生成速率，进入死亡期。进入死亡期。分批培养的优缺点：分批培养的优缺点：优点优点 操作简单，周期短，染菌机会少，操作简单，周期短，染菌机会少，生产过程和产品质量容易掌握生产过程和产品质量容易掌握缺点缺点 产率低，不适于测定动力学数据产率低，不适于测定动力学数据2 2、补料分批培养、补料分批培养 在分批培养过程中补入新鲜的料液，在分批培养过程中补入新鲜的料液，以克服营养不足而导致的发酵过早结以克服营养不足而导致的发酵过早结束的缺点。束的缺点。在此过程中只有料液的加入没有料液在此过程中只有料液的加入没有料液的取出，所以发酵结束时发酵液体积的取出，所

4、以发酵结束时发酵液体积比发酵开始时有所增加。比发酵开始时有所增加。补料分批培养的优缺点补料分批培养的优缺点优点优点 可以维持低的基质浓度，避免快可以维持低的基质浓度，避免快速利用碳源的阻遏效应；可以通过补料控速利用碳源的阻遏效应；可以通过补料控制达到最佳的生长和产物合成条件；制达到最佳的生长和产物合成条件；缺点缺点 没有物料取出，产物的积累最没有物料取出，产物的积累最终导致比生产速率的下降终导致比生产速率的下降; ;增加了染菌机增加了染菌机会会3 3、半连续培养、半连续培养在补料分批培养的基础上间歇放在补料分批培养的基础上间歇放掉部分发酵液（带放）称为半连掉部分发酵液（带放）称为半连续培养。续

5、培养。4 4、连续培养、连续培养发酵过程中一边补入新鲜料液一边放出发酵过程中一边补入新鲜料液一边放出等量的发酵液，使发酵罐内的体积维持等量的发酵液，使发酵罐内的体积维持恒定。恒定。达到稳态后，整个过程中菌的浓度，产达到稳态后，整个过程中菌的浓度，产物浓度，限制性基质浓度都是恒定的。物浓度，限制性基质浓度都是恒定的。连续培养的优缺点连续培养的优缺点优点优点 控制稀释速率可以使发酵过程最控制稀释速率可以使发酵过程最优化。发酵周期长，得到高的产量优化。发酵周期长，得到高的产量缺点缺点 菌种不稳定的话，长期连续培养会菌种不稳定的话，长期连续培养会引起菌种退化，降低产量。长时间补料染引起菌种退化，降低产

6、量。长时间补料染菌机会大大增加。菌机会大大增加。二二 发酵过程工艺控制的目的发酵过程工艺控制的目的有一个好的菌种以后要有一个配合菌有一个好的菌种以后要有一个配合菌种生长的最佳条件，使菌种的潜能发种生长的最佳条件，使菌种的潜能发挥出来挥出来目标是得到最大的比生产速率和最大目标是得到最大的比生产速率和最大的生产率的生产率发挥菌种的最大生产潜力考虑之点发挥菌种的最大生产潜力考虑之点菌种本身的代谢特点菌种本身的代谢特点 生长速率、呼生长速率、呼吸强度、营养要求（酶系统）、代谢速吸强度、营养要求（酶系统）、代谢速率率菌代谢与环境的相关性菌代谢与环境的相关性 温度、温度、pHpH、渗透压、离子强度、溶氧浓

7、度、剪切力渗透压、离子强度、溶氧浓度、剪切力等等微生物代谢是一个复杂的系统，它的微生物代谢是一个复杂的系统，它的代谢呈网络形式，比如糖代谢产生的代谢呈网络形式，比如糖代谢产生的中间物可能用作合成菌体的前体，可中间物可能用作合成菌体的前体，可能用作合成产物的前体，也可能合成能用作合成产物的前体，也可能合成副产物，而这些前体有可能流向不同副产物，而这些前体有可能流向不同的反应方向，环境条件的差异会引发的反应方向，环境条件的差异会引发代谢朝不同的方向进行。代谢朝不同的方向进行。三三 发酵过程研究的方法和层次发酵过程研究的方法和层次1、研究方法、研究方法单因子实验单因子实验：对实验中要考察的因子逐个：

8、对实验中要考察的因子逐个进行试验，寻找每个因子的最佳条件。一进行试验，寻找每个因子的最佳条件。一般用摇瓶做实验。般用摇瓶做实验。数理统计学方法数理统计学方法：运用统计学方法设计实验：运用统计学方法设计实验和分析实验结果，得到最佳的实验条件。如和分析实验结果，得到最佳的实验条件。如正交设计、均匀设计、响应面设计。正交设计、均匀设计、响应面设计。 同时进行多因子试验。用少量的实验，同时进行多因子试验。用少量的实验，经过数理分析得到单因子实验同样的结果，经过数理分析得到单因子实验同样的结果，甚至更准确，大大提高了实验效率甚至更准确，大大提高了实验效率。 2 2、研究的层次、研究的层次初级层次的研究初

9、级层次的研究：一般在摇瓶规模进行试验。主要考察目一般在摇瓶规模进行试验。主要考察目的菌株生长和代谢的一般条件，如培养的菌株生长和代谢的一般条件，如培养基的组成、最适温度、最适基的组成、最适温度、最适pHpH等要求。等要求。摇瓶研究的优点是工作量大，可以一次摇瓶研究的优点是工作量大，可以一次试验几十种甚至几百种条件，对于菌种试验几十种甚至几百种条件，对于菌种培养条件的优化有较高的效率。培养条件的优化有较高的效率。代谢及工程参数层次研究：代谢及工程参数层次研究：一般在小型反应器规模进行试验。在摇瓶一般在小型反应器规模进行试验。在摇瓶试验的基础上，考察溶氧、搅拌等摇瓶上试验的基础上，考察溶氧、搅拌等

10、摇瓶上无法考察的参数，以及在反应器中微生物无法考察的参数，以及在反应器中微生物对各种营养成分的利用速率、生长速率、对各种营养成分的利用速率、生长速率、产物合成速率及其它一些发酵过程参数的产物合成速率及其它一些发酵过程参数的变化，找出过程控制的最佳条件和方式。变化，找出过程控制的最佳条件和方式。生产规模放大生产规模放大在大型发酵罐规模进行试验。将小型发在大型发酵罐规模进行试验。将小型发酵罐的优化条件在大型反应器上得以实酵罐的优化条件在大型反应器上得以实现现, ,达到产业化的实现。达到产业化的实现。第二节第二节 发酵过程的中间分析发酵过程的中间分析发酵过程的中间分析是生产控制的眼睛。发酵过程的中间

11、分析是生产控制的眼睛。这些代谢参数又称为状态参数，因为它们反映这些代谢参数又称为状态参数，因为它们反映发酵过程中菌的生理代谢状况，如发酵过程中菌的生理代谢状况，如pHpH，溶氧，溶氧，尾气氧，尾气二氧化碳，粘度，菌浓度等尾气氧，尾气二氧化碳，粘度，菌浓度等代谢参数按性质分可分三类：代谢参数按性质分可分三类：物理参数：物理参数：温度、搅拌转速、空气压力、空气流温度、搅拌转速、空气压力、空气流量、溶解氧等量、溶解氧等化学参数：化学参数：基质浓度（包括糖、氮、磷）、基质浓度（包括糖、氮、磷）、pHpH、产物浓度、核酸量等产物浓度、核酸量等生物参数：生物参数：菌丝形态、菌浓度、菌体比生长速率、菌丝形态

12、、菌浓度、菌体比生长速率、呼吸强度、基质消耗速率、关键酶活力等呼吸强度、基质消耗速率、关键酶活力等从检测手段分可分为：直接参数、间接从检测手段分可分为：直接参数、间接参数参数直接参数：直接参数：通过仪器或其它分析手段可通过仪器或其它分析手段可以测得的参数，如温度、以测得的参数，如温度、pHpH、残糖等、残糖等间接参数：间接参数：将直接参数经过计算得到的将直接参数经过计算得到的参数，如摄氧率、参数，如摄氧率、KLaKLa等等直接参数又可分为在线检测参数和离线直接参数又可分为在线检测参数和离线检测参数检测参数在线检测参数在线检测参数指不经取样直接从发酵罐指不经取样直接从发酵罐上安装的仪表上得到的参

13、数，如温度、上安装的仪表上得到的参数，如温度、pHpH、搅拌转速；、搅拌转速；离线检测参数离线检测参数指取出样后测定得到的参指取出样后测定得到的参数，如残糖、数，如残糖、NHNH2 2-N-N、菌体浓度。、菌体浓度。一一 发酵过程主要分析的项目发酵过程主要分析的项目目前发酵过程主要分析项目如下目前发酵过程主要分析项目如下1 1、pHpH pH pH与微生物的生命活动密切相与微生物的生命活动密切相关关 酶催化活性酶催化活性 pHpH的变化又是微生物代谢状况的的变化又是微生物代谢状况的综合反映综合反映基质代谢、产物合成、基质代谢、产物合成、细胞状态、营养状况、供氧状况细胞状态、营养状况、供氧状况2

14、 2、排气氧、排气、排气氧、排气COCO2 2和呼吸熵和呼吸熵排气氧的浓度反映了菌生长的活性，通过计排气氧的浓度反映了菌生长的活性，通过计算可以求得摄氧率（算可以求得摄氧率（OUROUR）。）。排气二氧化碳反映了微生物代谢的情况。排气二氧化碳反映了微生物代谢的情况。RQRQ值随微生物菌种的不同，培养基成分的值随微生物菌种的不同，培养基成分的不同，生长阶段的不同而不同。测定不同，生长阶段的不同而不同。测定RQRQ值值一方面可以了解微生物代谢的状况，另一一方面可以了解微生物代谢的状况，另一方面也可以指导补料方面也可以指导补料CERCER表示单位体积发酵液单位时间内释放表示单位体积发酵液单位时间内释

15、放的二氧化碳的量的二氧化碳的量呼吸熵呼吸熵OURCERRQ 呼吸熵反映了氧的利用状况呼吸熵反映了氧的利用状况 一般在发酵中后期为保证产生次级代谢产物，一般在发酵中后期为保证产生次级代谢产物，有意使菌体处于半饥饿状态。有意使菌体处于半饥饿状态。后期的补料控制是关键。后期的补料控制是关键。3 3、糖含量、糖含量微生物生长和产物合成与糖代谢有密切关系。微生物生长和产物合成与糖代谢有密切关系。糖的消耗糖的消耗 反映产生菌的生长繁殖情况反映产生菌的生长繁殖情况 反映产物合成的活力反映产物合成的活力糖含量测定包括总糖和还原糖。糖含量测定包括总糖和还原糖。总糖总糖指发酵液中残留的各种糖的总量。指发酵液中残留

16、的各种糖的总量。 还原糖还原糖指含有自由醛基的单糖，通常指的是葡指含有自由醛基的单糖，通常指的是葡萄糖。萄糖。4 4、氨基氮和氨氮、氨基氮和氨氮氨基氮氨基氮指有机氮中的氮（指有机氮中的氮（NHNH2 2-N-N），单位是），单位是 mg/100mlmg/100ml。如氨基酸中的氮，黄豆饼粉、花生饼粉中都有有机氮。如氨基酸中的氮，黄豆饼粉、花生饼粉中都有有机氮。氨氮氨氮指无机氨中的氮（指无机氨中的氮（NHNH3 3-N-N）。）。氮利用快慢可分析出菌体生长情况，含氮产物合氮利用快慢可分析出菌体生长情况，含氮产物合成情况。成情况。5 5、磷含量、磷含量微生物体内磷含量较高，培养基中以磷酸微生物体内

17、磷含量较高，培养基中以磷酸盐为主，发酵中用来计算磷含量的是磷酸盐为主，发酵中用来计算磷含量的是磷酸根。根。磷是核酸的组成部分，是高能化合物磷是核酸的组成部分，是高能化合物ATPATP的的组成部分，磷还能促进糖代谢。因此磷在组成部分，磷还能促进糖代谢。因此磷在培养基中具有非常重要的作用，如果磷缺培养基中具有非常重要的作用，如果磷缺乏就要采取补磷措施。乏就要采取补磷措施。6 6、菌浓度和菌形态、菌浓度和菌形态菌形态和菌浓度直接反映菌生长的情况。菌形态和菌浓度直接反映菌生长的情况。菌浓度的测定是衡量产生菌在整个培养过菌浓度的测定是衡量产生菌在整个培养过程中菌体量的变化，一般前期菌浓增长很程中菌体量的

18、变化，一般前期菌浓增长很快，中期菌浓基本恒定。补料会引起菌浓快，中期菌浓基本恒定。补料会引起菌浓的波动，这也是衡量补料量适合与否的一的波动，这也是衡量补料量适合与否的一个参数。个参数。7 7、产物浓度、产物浓度 在培养过程中，产生菌的合成能力和产在培养过程中，产生菌的合成能力和产物积累情况都要通过产物量的测定来了物积累情况都要通过产物量的测定来了解，产物浓度直接反映了生产的状况解，产物浓度直接反映了生产的状况, ,是发酵控制的重要参数。而且通过计算是发酵控制的重要参数。而且通过计算还可以得到生产速率和比生产速率，从还可以得到生产速率和比生产速率，从而分析发酵条件如补料、而分析发酵条件如补料、p

19、HpH对产物形成对产物形成的影响。的影响。第二节第二节 温度对发酵的影响和及其控制温度对发酵的影响和及其控制 微生物的生长和产物的合成都是在各种微生物的生长和产物的合成都是在各种酶酶催化下进行的，温度是保证酶活性的重要条件，催化下进行的，温度是保证酶活性的重要条件，因此在发酵系统中必须保证因此在发酵系统中必须保证稳定而合适的温度稳定而合适的温度环境环境。一、温度对生长的影响一、温度对生长的影响每种微生物对温度的要求可用每种微生物对温度的要求可用最适温度、最最适温度、最高温度、最低温度高温度、最低温度来表征。来表征。微生物受高温的伤害比低温的伤害大，即超微生物受高温的伤害比低温的伤害大，即超过最

20、高温度，微生物很快死亡；低于最低温过最高温度，微生物很快死亡；低于最低温度，微生物代谢受到很大抑制，并不马上死度，微生物代谢受到很大抑制，并不马上死亡。这就是菌种保藏的原理。亡。这就是菌种保藏的原理。二、温度对发酵的影响二、温度对发酵的影响1 1、温度影响反应速率、温度影响反应速率发酵过程的反应速率实际是酶反应速率，酶反应有一个最适温度。发酵过程的反应速率实际是酶反应速率，酶反应有一个最适温度。从阿累尼乌斯方程式可以看到从阿累尼乌斯方程式可以看到 dlnKdlnKr r/dt=E/RT/dt=E/RT2 2 积分得积分得 E活化能活化能Kr速率常数速率常数k=Aexp(- E/RT)2 2、温

21、度影响发酵方向、温度影响发酵方向四环素产生菌金色链霉菌同时产生金霉素和四环素，四环素产生菌金色链霉菌同时产生金霉素和四环素，当温度低于当温度低于30300 0C C时，这种菌合成金霉素能力较强；时，这种菌合成金霉素能力较强；温度提高，合成四环素的比例也提高，温度达到温度提高，合成四环素的比例也提高，温度达到35350 0C C时，金霉素的合成几乎停止，只产生四环素。时，金霉素的合成几乎停止，只产生四环素。(3) (3) 温度温度基质溶解度基质溶解度影响氧在发酵液中的溶解度影响氧在发酵液中的溶解度 温度 溶氧影响基质的吸收速率影响基质的吸收速率 如菌体对硫酸盐吸收在如菌体对硫酸盐吸收在2525时

22、最小时最小三、最适温度的选择三、最适温度的选择 所谓最适温度是指在该温度下最适于所谓最适温度是指在该温度下最适于菌的生长菌的生长或或产物的合成产物的合成。 对不同的对不同的菌种菌种、不同的、不同的培养条件培养条件、不同的、不同的酶反应酶反应以及不同的以及不同的生长阶段生长阶段，最适温度有所不同。，最适温度有所不同。1 1、根据菌种及生长阶段选择、根据菌种及生长阶段选择微生物种类不同，所具有的酶系及其性质不同，微生物种类不同，所具有的酶系及其性质不同，所要求的温度范围也不同。所要求的温度范围也不同。如黑曲霉生长温度为如黑曲霉生长温度为370 0C C，谷氨酸产生菌棒状杆菌的生长温度为谷氨酸产生菌

23、棒状杆菌的生长温度为30320 0C C，青霉菌生长温度为青霉菌生长温度为300 0C C。 根据菌种根据菌种在发酵在发酵前期前期由于菌量少，发酵目的是要尽快达到大量由于菌量少，发酵目的是要尽快达到大量的菌体，取稍高的温度，促使菌的呼吸与代谢，使菌的菌体，取稍高的温度，促使菌的呼吸与代谢，使菌生长迅速；生长迅速；在在中期中期菌量已达到合成产物的最适量，发酵需要延长菌量已达到合成产物的最适量，发酵需要延长中期，从而提高产量，因此中期温度要稍低一些，可中期，从而提高产量，因此中期温度要稍低一些，可以推迟衰老。以推迟衰老。l根据生长阶段选择根据生长阶段选择发酵发酵后期后期，产物合成能力降低，延长发酵

24、周期没有必，产物合成能力降低，延长发酵周期没有必要，就又提高温度，刺激产物合成到放罐。要，就又提高温度，刺激产物合成到放罐。如四环素生长阶段如四环素生长阶段2828，合成期，合成期2626后期再升温；后期再升温；黑曲霉生长黑曲霉生长3737 ，产糖化酶，产糖化酶32323434 。但也有的菌种产物形成比生长温度高。如谷氨酸产但也有的菌种产物形成比生长温度高。如谷氨酸产生菌生长生菌生长30303232，产酸，产酸34343737。2 2、根据培养条件选择、根据培养条件选择温度选择还要根据培养条件综合考虑，灵活选择。温度选择还要根据培养条件综合考虑，灵活选择。通气条件差通气条件差时可适当降低温度，

25、使菌呼吸速率降低时可适当降低温度，使菌呼吸速率降低些，溶氧浓度也可髙些。些，溶氧浓度也可髙些。培养基稀薄培养基稀薄时，温度也该低些。因为温度高营养利时，温度也该低些。因为温度高营养利用快，会使菌过早自溶。用快，会使菌过早自溶。3 3、根据菌生长情况、根据菌生长情况菌生长快，维持在较高温度时间要短些；菌生长快，维持在较高温度时间要短些；菌生长慢，维持较高温度时间可长些。菌生长慢，维持较高温度时间可长些。培养条件适宜，如营养丰富，通气能满足，那培养条件适宜，如营养丰富，通气能满足，那么前期温度可髙些，以利于菌的生长。么前期温度可髙些，以利于菌的生长。四、发酵过程引起温度变化的因素四、发酵过程引起温

26、度变化的因素（一）发酵热（一）发酵热Q Q发酵发酵发酵热是引起发酵过程温度变化的原因。发酵热是引起发酵过程温度变化的原因。所谓发酵热就是发酵过程中释放出来的净热量。所谓发酵热就是发酵过程中释放出来的净热量。发酵热引起发酵液的温度上升。发酵热引起发酵液的温度上升。发酵热大，温度上升快，发酵热小，温度上升慢。发酵热大，温度上升快，发酵热小，温度上升慢。1 1、生物热生物热Q Q生物生物在发酵过程中，菌体不断利用培养基中的营养物在发酵过程中，菌体不断利用培养基中的营养物质，将其分解氧化而产生的能量，其中一部分用质，将其分解氧化而产生的能量，其中一部分用于合成高能化合物（如于合成高能化合物（如ATPA

27、TP）提供细胞合成和代谢）提供细胞合成和代谢产物合成需要的能量，其余一部分以热的形式散产物合成需要的能量，其余一部分以热的形式散发出来，这散发出来的热就叫生物热。发出来，这散发出来的热就叫生物热。l生物热与发酵类型有关生物热与发酵类型有关微生物进行有氧呼吸产生的热比厌氧发酵微生物进行有氧呼吸产生的热比厌氧发酵产生的热多产生的热多一摩尔葡萄糖彻底氧化成一摩尔葡萄糖彻底氧化成COCO2 2和水和水l 培养过程中生物热的产生具有培养过程中生物热的产生具有强烈的时间性强烈的时间性。生物热的大小与呼吸作用强弱有关生物热的大小与呼吸作用强弱有关。在培养初期，产生热量较少。在培养初期，产生热量较少。菌体在对

28、数生长期时，菌体繁殖迅速，呼吸作用激烈，菌体在对数生长期时，菌体繁殖迅速，呼吸作用激烈，菌体也较多，所以产生的热量多，必须注意控制温度。菌体也较多，所以产生的热量多，必须注意控制温度。培养后期，菌体已基本上停止繁殖，主要靠菌体内培养后期，菌体已基本上停止繁殖，主要靠菌体内的酶系进行代谢作用，产生热量不多。的酶系进行代谢作用，产生热量不多。2 2、搅拌热、搅拌热Q Q搅拌搅拌电机功率电机功率P= cos3EIEE额定电压额定电压 II额定电流额定电流coscos功率因素，功率因素，1 1千瓦时千瓦时8608604186.84186.8焦耳焦耳搅拌热与搅拌轴功率有关，可用下式计算：搅拌热与搅拌轴功

29、率有关，可用下式计算： Q Q搅拌搅拌P P8608604186.84186.8（焦耳（焦耳/ /小时）小时） PP搅拌轴功率搅拌轴功率 4186.84186.8机械能转变为热能的热功当量机械能转变为热能的热功当量3、蒸发热Q蒸发 通气时，引起发酵液的水分蒸发，水分蒸发所需的通气时，引起发酵液的水分蒸发，水分蒸发所需的热量叫蒸发热。此外，排气也会带走部分热量叫显热量叫蒸发热。此外，排气也会带走部分热量叫显热热Q Q显热显热，显热很小，一般可以忽略不计。，显热很小，一般可以忽略不计。4、辐射热Q辐射发酵罐内温度与环境温度不同，发酵液中有部分发酵罐内温度与环境温度不同，发酵液中有部分热通过罐体向外

30、辐射。辐射热的大小取决于罐温热通过罐体向外辐射。辐射热的大小取决于罐温与环境的温差。与环境的温差。Q Q发酵发酵Q Q生物生物Q Q搅拌搅拌Q Q蒸发蒸发Q Q辐射辐射（二）发酵热的测定（二）发酵热的测定有二种发酵热测定的方法。有二种发酵热测定的方法。一种是用冷却水进出口温度差一种是用冷却水进出口温度差计算发酵热。计算发酵热。在工厂里，可以通过测量冷却水进出口的水在工厂里，可以通过测量冷却水进出口的水温，再从水表上得知每小时冷却水流量来计算发酵热。温，再从水表上得知每小时冷却水流量来计算发酵热。Q Q发酵发酵GCGCm m(T(T出出T T进进) ) C Cm m水的比热水的比热, G, G冷

31、却水流量冷却水流量另一种是另一种是根据罐温上升速率来计算根据罐温上升速率来计算。五、温度的控制五、温度的控制 一般不需加热，因一般不需加热，因释放了大量的发酵热，释放了大量的发酵热，需要冷却的情况多。需要冷却的情况多。 用夹套或蛇形管，通用夹套或蛇形管，通冷却水。冷却水。第三节第三节 发酵过程的发酵过程的pHpH控制控制 pHpH是微生物代谢的综合反映是微生物代谢的综合反映，又影响代谢的进，又影响代谢的进行，所以是十分重要的参数。行，所以是十分重要的参数。发酵过程中发酵过程中pHpH是不断变化的是不断变化的，通过观察，通过观察pHpH变变化规律可以了解发酵的正常与否。化规律可以了解发酵的正常与

32、否。一、发酵过程一、发酵过程pHpH变化的原因变化的原因 1 1、基质代谢、基质代谢 （1）糖代谢）糖代谢 特别是快速利用的糖，分解成小分子酸、特别是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使醇，使pH下降。糖缺乏，下降。糖缺乏，pH上升，是补料的标志之一上升，是补料的标志之一.（2）氮代谢）氮代谢 当氨基酸中的当氨基酸中的-NH2被利用后被利用后pH会下降；会下降；尿素被分解成尿素被分解成NH3，pH上升，上升，NH3利用后利用后pH下降，当碳下降，当碳源不足时氮源当碳源利用源不足时氮源当碳源利用pH上升。上升。（3）生理酸碱性物质利用后）生理酸碱性物质利用后pH会上升或下降会上升或下降2 2、产

33、物形成、产物形成 某些产物本身呈酸性或碱性，使发酵液某些产物本身呈酸性或碱性，使发酵液pHpH变化。变化。如有机酸类产生使如有机酸类产生使pHpH下降，红霉素、洁霉素、下降，红霉素、洁霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱性，使螺旋霉素等抗生素呈碱性，使pHpH上升。上升。 3 3、菌体自溶菌体自溶pH上升，发酵后期，上升，发酵后期，pH上升。上升。 二、二、pH对发酵的影响对发酵的影响 例例 pH对林可霉素发酵的影响对林可霉素发酵的影响 林可霉素发酵开始，葡萄糖转化为有机酸类中间产物，发林可霉素发酵开始，葡萄糖转化为有机酸类中间产物，发酵液酵液pH下降，待有机酸被生产菌利用，下降，待有机酸被生产菌利用，

34、pH上升。若不及上升。若不及时补糖、时补糖、(NH4)2SO4或酸，发酵液或酸，发酵液pH可迅速升到可迅速升到8.0以上，以上，阻碍或抑制某些酶系，使林可霉素增长缓慢，甚至停止。阻碍或抑制某些酶系，使林可霉素增长缓慢，甚至停止。对照罐发酵对照罐发酵66小时小时pH达达7.93，以后维持在，以后维持在8.0以上至以上至115小小时，菌丝浓度降低，时，菌丝浓度降低，NH2-N升高，发酵不再继续。升高，发酵不再继续。发酵发酵15小时左右，小时左右，pH值可以从消后的值可以从消后的6.5左右下降到左右下降到5.3，调节这一段的调节这一段的pH值至值至7.0左右，以后自控左右，以后自控pH，可提高发酵，

35、可提高发酵单位。单位。 1、实例、实例pH7.0t不调不调pH调调pH效价效价pH2 2、pHpH对发酵的影响对发酵的影响 （1 1）pHpH影响酶的活性。当影响酶的活性。当pHpH值抑制菌体值抑制菌体某些酶的活性时使菌的新陈代谢受阻某些酶的活性时使菌的新陈代谢受阻（2 2）pHpH值影响微生物细胞膜所带电荷的改变，值影响微生物细胞膜所带电荷的改变，从而改变细胞膜的透性，影响微生物对营养从而改变细胞膜的透性，影响微生物对营养物质的吸收及代谢物的排泄。物质的吸收及代谢物的排泄。（3 3）pHpH值影响培养基某些成分和中间代谢值影响培养基某些成分和中间代谢物的解离，影响微生物对这些物质的利用物的解

36、离，影响微生物对这些物质的利用 。（4）pH影响代谢方向影响代谢方向 pHpH不同，往往引起菌体代谢过程不同，使代谢产物不同，往往引起菌体代谢过程不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。的质量和比例发生改变。例如黑曲霉在例如黑曲霉在pH23pH23时发酵产生柠檬酸，在时发酵产生柠檬酸，在pHpH近中近中性时，则产生草酸。性时，则产生草酸。3 3、pHpH在微生物培养的不同阶段有不同的影响在微生物培养的不同阶段有不同的影响 生长合成pHpH对菌体生长影响比产物合成影响小对菌体生长影响比产物合成影响小XpH四环素四环素三、三、pHpH的控制的控制 1 1、调节好基础料的、调节好基础料的pHpH。基础

37、料中若含有玉米浆，。基础料中若含有玉米浆，pHpH呈酸性，必须调节呈酸性，必须调节pHpH。若要控制消后。若要控制消后pHpH在在6.06.0，消前消前pHpH往往要调到往往要调到6.56.8.6.56.8.2 2、在基础料中加入维持、在基础料中加入维持pHpH的物质，如的物质，如CaCOCaCO3 3 ，或具有缓冲能力的试剂，如磷酸缓冲液等。具有缓冲能力的试剂，如磷酸缓冲液等。3 3、通过补料调节、通过补料调节pHpH 在发酵过程中根据糖氮消耗需要进行补料。在补料在发酵过程中根据糖氮消耗需要进行补料。在补料与调与调pHpH没有矛盾时采用补料调没有矛盾时采用补料调pHpH如（如（1 1）调节补

38、糖速率，调节空气流量来调节）调节补糖速率，调节空气流量来调节pHpH(2)(2)当当NHNH2 2-N-N低，低，pHpH低时补氨水；低时补氨水；当当NHNH2 2-N-N低，低，pHpH高时补高时补(NH(NH4 4) )2 2SOSO4 44 4、当补料与调、当补料与调pHpH发生矛盾时，加酸碱调发生矛盾时，加酸碱调pHpH pHpH控制是一项非常细致的工作，不仅控制是一项非常细致的工作，不仅考虑最佳考虑最佳pHpH值，而且要根据生长阶段值，而且要根据生长阶段考察对考察对pHpH的要求。在的要求。在pHpH控制中还要采控制中还要采用合适的调节方法。用合适的调节方法。总结总结小小 结结发酵过

39、程发酵过程pH会发生变化会发生变化变化原因变化原因基质代谢基质代谢 产物形成产物形成 菌体自溶菌体自溶对发酵的影响对发酵的影响pHpHpH影响酶的活性影响酶的活性pHpH值影响微生物细胞膜所带电荷的值影响微生物细胞膜所带电荷的改变改变pHpH值影响培养基某些成分和中间代值影响培养基某些成分和中间代谢物的解离谢物的解离pHpH影响代谢方向影响代谢方向 pH在微生物培养的不同阶段有不同的影响在微生物培养的不同阶段有不同的影响 pHpH的的控控制制方方式式基础培养基调节基础培养基调节pH在基础料中加入维持在基础料中加入维持pH的物质的物质通过补料调节通过补料调节pH 当补料与调当补料与调pH发生矛盾

40、时，加酸碱发生矛盾时，加酸碱调调pH 发酵的不同阶段采取不同的发酵的不同阶段采取不同的pH值值选择合适的选择合适的pH调节剂调节剂思考题思考题7.12 发酵过程中发酵过程中pH会不会发生变化为什么？会不会发生变化为什么？7.13 pH对发酵的影响表现在哪些方面？对发酵的影响表现在哪些方面？7.14 为了确定发酵的最佳为了确定发酵的最佳pH,我们该如何实验？我们该如何实验？7.15 发酵过程的发酵过程的pH控制可以采取哪些措施？控制可以采取哪些措施？第四节 氧的供需及对发酵的影响主要内容一、细胞对氧的需求一、细胞对氧的需求( (为什么要供氧？为什么要控制为什么要供氧？为什么要控制溶氧？）溶氧？）

41、二、发酵过程中氧的传递（如何实现供氧？如何控制二、发酵过程中氧的传递（如何实现供氧？如何控制溶氧？）溶氧？）三、影响氧传递的因素三、影响氧传递的因素四、摄氧率、溶解氧、四、摄氧率、溶解氧、K KL La a的测定的测定五、溶解氧对发酵的影响及控制五、溶解氧对发酵的影响及控制一、细胞对氧的需求（一）氧在微生物发酵中的作用（一）氧在微生物发酵中的作用（二）溶解氧浓度对菌体生长和产物形成的影响（二）溶解氧浓度对菌体生长和产物形成的影响（三）影响耗氧的因素（三）影响耗氧的因素（三）溶解氧控制的意义（三）溶解氧控制的意义（一）氧在微生物发酵中的作用（对于好气性微生物而言）（对于好气性微生物而言）呼吸作用

42、呼吸作用 直接参与一些生物合成反应直接参与一些生物合成反应 COOHCHOHCHCHO3232只考虑呼吸作用，则只考虑呼吸作用，则C C6 6H H1212O O6 6HH2 2O+COO+CO2 2 能量能量上式可知，上式可知，180g180g葡萄糖完全氧化需要葡萄糖完全氧化需要190g190g氧氧. .在常压下（在常压下（2525），氧的溶解度仅为），氧的溶解度仅为6.4mg /L 6.4mg /L 的溶解的溶解度小度小70007000倍。只能保证氧化倍。只能保证氧化8.3mg8.3mg葡萄糖，仅相当于葡萄糖，仅相当于常用培养基葡萄糖浓度的常用培养基葡萄糖浓度的11。在对数生长期即使发酵液

43、中的溶氧能达到在对数生长期即使发酵液中的溶氧能达到100空气饱和度，若此时中止供氧，发酵液中溶氧空气饱和度，若此时中止供氧，发酵液中溶氧可在几秒（分）钟之内便耗竭，使溶氧成为限可在几秒（分）钟之内便耗竭，使溶氧成为限制因素。制因素。 微生物需氧量的表示方式微生物需氧量的表示方式(1)(1)呼吸强度（比耗氧速率）呼吸强度（比耗氧速率） QO2 ：单位质量干菌体在单位质量干菌体在单位时间内消耗氧的量。单位：单位时间内消耗氧的量。单位：m mmolO2/（kg干菌体干菌体h）。(2) 摄氧率摄氧率（耗氧速率）：单位体积培养液在单位时（耗氧速率）：单位体积培养液在单位时间内消耗氧的量。间内消耗氧的量。

44、 =QO2x x细胞浓度，细胞浓度，kg(干重干重)/m3)(32hmmmolOl呼吸强度表示微生物的绝对吸氧量，但当培养呼吸强度表示微生物的绝对吸氧量，但当培养液中有固体成分存在时，测定困难。用耗氧速率液中有固体成分存在时，测定困难。用耗氧速率(摄氧率摄氧率)表示表示.QO2与溶氧浓度与溶氧浓度CL关系关系QO2CCr: 临界溶氧浓度临界溶氧浓度, 指不影响呼吸所允许的最低溶氧浓度指不影响呼吸所允许的最低溶氧浓度。在临界氧浓度以下，微生物的呼吸速率随溶解氧浓度降低在临界氧浓度以下，微生物的呼吸速率随溶解氧浓度降低而显著下降。好氧微生物临界氧浓度大约是饱和浓度的而显著下降。好氧微生物临界氧浓度

45、大约是饱和浓度的1-25。CCrCL(1) 当当CLCcr时时， QO2 (QO2)m(2) 当当CL1.1.问题：一般微生物的临界溶氧浓度很小，是不是发酵问题：一般微生物的临界溶氧浓度很小，是不是发酵过程中氧很容易满足过程中氧很容易满足?例：以微生物的摄氧率例：以微生物的摄氧率0.052 mmol O2L-1S-1 计，计，在在28氧氧在发酵液中的在发酵液中的100的空气饱和浓度只有的空气饱和浓度只有0.25 mmol.L-1左右左右 0.25/0.052=4.8秒秒注意：由于产物的形成和菌体最适的生长条件，常注意：由于产物的形成和菌体最适的生长条件，常常不一样常不一样 头孢菌素头孢菌素 卷

46、须霉素卷须霉素生长生长 5% (相对于饱和浓度）相对于饱和浓度） 13%产物产物 13% 8%（三）影响耗氧的因素（三）影响耗氧的因素r= QO2 .Xr r微生物摄氧率微生物摄氧率 mmol(O2)/Lhmmol(O2)/LhQ QO2O2呼吸强度呼吸强度 mmol(Ommol(O2 2)/g ()/g (干菌体干菌体) h) hX X 菌体量菌体量 g (g (干菌体干菌体) /L) /L培养过程中细胞耗氧的一般规律培养初期：培养初期： QO2逐渐增高逐渐增高，x较小较小。在对数生长初期：达到在对数生长初期：达到(QO2 )m，但此时但此时x较低较低， 并不高并不高。在对数生长后期：达到在

47、对数生长后期：达到m, D. 对数生长期末对数生长期末：S, QO2 而而(QO2 , x), 虽然虽然x=xm,但但 QO2占主导地位，占主导地位，所以所以 E. 培养后期培养后期：S0，QO2 , 影响微生物耗氧的因素微生物本身遗传特征的影响，如微生物本身遗传特征的影响，如 k0，QO2培养基的成分和浓度培养基的成分和浓度碳源种类碳源种类 耗氧速率：油脂或烃类耗氧速率：油脂或烃类葡萄糖葡萄糖 蔗糖蔗糖 乳糖乳糖 培养基浓度培养基浓度 浓度大浓度大, , QO2 ; 浓度小浓度小, , QO2菌龄的影响菌龄的影响: :一般幼龄菌一般幼龄菌QO2大大, ,晚龄菌晚龄菌QO2小小4. 影响微生物

48、耗氧的因素（续）影响微生物耗氧的因素（续） 发酵条件的影响发酵条件的影响 pHpH值值 通过酶活来影响耗氧特征通过酶活来影响耗氧特征; ; 温度温度 通过酶活及溶氧来影响耗氧特征：通过酶活及溶氧来影响耗氧特征：T , DO2 代谢类型代谢类型( (发酵类型发酵类型) )的影响的影响 若产物通过若产物通过TCA循环获取循环获取, ,则则QO2高高, ,耗氧量大耗氧量大 若产物通过若产物通过EMP途径获取途径获取, ,则则QO2低低, ,耗氧量小耗氧量小溶解氧浓度对细胞生长和产物合成的影响可能是溶解氧浓度对细胞生长和产物合成的影响可能是不同的，所以须了解长菌阶段和代谢产物形成阶不同的，所以须了解长

49、菌阶段和代谢产物形成阶段的最适需氧量。段的最适需氧量。 氧传递速率已成为许多好气性发酵产量的限制因氧传递速率已成为许多好气性发酵产量的限制因素。素。目前目前, ,在发酵工业上氧的利用率很低，因此提高传在发酵工业上氧的利用率很低，因此提高传氧效率氧效率, ,就能大大降低空气消耗量就能大大降低空气消耗量, ,从而降低设备从而降低设备费和动力消耗费和动力消耗, ,且减少泡沫形成和染菌的机会且减少泡沫形成和染菌的机会, , 大大大提高设备利用率。大提高设备利用率。（四）溶解氧控制的意义（四）溶解氧控制的意义二、氧在液体中的传递1. 氧传递的阻力微生物发酵过程中，氧需克服从气态液体菌体多方面的阻力，才能

50、参与各种生化反应2. 氧得传递 传递推动力 根据双膜理论，传递过程的总推动力是气相与细胞内的氧分压之差 OTRKLa（C*- CL ）OTR 单位体积培养液的氧传递速率（kmol/m3 h）C* 与气相中氧平衡的饱和溶氧浓度（kmol/m3 ）CL溶液主流中的氧浓度（kmol/m3 ）KL 以氧浓度差为总推动力的总传质系数（kmol/（m2 hkmol/m3）a比表面积（单位体积液体中所含有的气液接触面积m2 /m3） 液相体积氧传递系数因a很难测定，把KLa当成以一项，称为液相体积氧传递系数(以浓度差为推动力的体积溶氧系数)，1/h由气液传递速率方程由气液传递速率方程)(*LLCCaKOTR

51、 2. kLa的影响因素的影响因素（一）影响氧传递的因素（一）影响氧传递的因素1. 影响推动力影响推动力C*-CL的因素的因素 影响比表面积影响比表面积a的因素的因素影响液膜传递系数影响液膜传递系数kL的因素的因素 可知，影响氧传递速率的因素（即影响供氧的因素）有：可知，影响氧传递速率的因素（即影响供氧的因素）有： 提高饱和氧浓度考虑适当降温（T ，Cw* ，推动力）降低基质浓度考虑提高氧分压(提高罐压、富氧通气） 降低发酵液中的CL考虑减少通气量或降低搅拌速度，降低KLa调节调节KlaKla是最常用的方法，是最常用的方法，klakla反映了设备的供氧能力。反映了设备的供氧能力。 45升升 1

52、吨吨 10吨吨搅拌速度搅拌速度 250 rpm 120 120供氧速率供氧速率 7.6 10.7 20.1不同的设备供氧能力不一样不同的设备供氧能力不一样发酵常用的设备为：摇瓶发酵常用的设备为：摇瓶 发酵罐发酵罐（一）影响摇瓶（一）影响摇瓶k kL La a的因素的因素1) 摇瓶机的种类和装液量摇瓶机的种类和装液量摇瓶机摇瓶机往复，频率往复，频率80-120分分/次，振幅次，振幅8cm旋转，偏心距旋转，偏心距25、12,转述转述250rpm装液量，一般取装液量，一般取1/101/10左右左右( (好氧发酵）：好氧发酵）： 250ml 15-25 ml250ml 15-25 ml 500ml 3

53、0 ml 500ml 30 ml 750ml 80 ml 750ml 80 ml例：例： 500 ml 摇瓶中生产蛋白酶，考察装液量对酶活的影响摇瓶中生产蛋白酶，考察装液量对酶活的影响 装液量装液量 30 ml 60ml 90ml 120ml 酶活力酶活力 713 734 253 92（二）影响发酵罐中（二）影响发酵罐中kLa的因素的因素(二）影响KLa的因素 发酵罐的形状，结构（几何参数）发酵罐的形状，结构（几何参数） 搅拌器，空气分布器（几何参数）搅拌器，空气分布器（几何参数） 通气：表观线速度通气：表观线速度Vs 操作条件操作条件 搅拌：转速搅拌：转速N，搅拌功率搅拌功率Pg 发酵液体积

54、发酵液体积V，液柱高度液柱高度HL 发酵液的性质发酵液的性质：如影响发酵液性质的表面活性剂、离如影响发酵液性质的表面活性剂、离子强度、菌体量子强度、菌体量设备参数设备参数实际上：实际上：对于转速的调节有时是有限度的对于转速的调节有时是有限度的通风的增加也是有限的通风的增加也是有限的蒸发量大蒸发量大中间挥发性代谢产物带走中间挥发性代谢产物带走3、小型发酵罐和大型发酵罐调节、小型发酵罐和大型发酵罐调节kla的特点的特点q 小型发酵罐，转速可调小型发酵罐，转速可调q 大型发酵罐，转速往往不可调大型发酵罐，转速往往不可调 大型反应器的合理设计大型反应器的合理设计 对现有设备一定要注意工艺配套对现有设备

55、一定要注意工艺配套5、影响、影响Kla的其它因素的其它因素设备结构：如空气分布器（设备结构：如空气分布器（液体的粘度液体的粘度三、溶解氧、摄氧率和KLa值的测定（一）（一）溶解氧溶解氧C CL L的测定原理与方法的测定原理与方法化学法化学法极谱法极谱法复膜氧电极法复膜氧电极法化学法化学法原理：在样品中加入硫酸锰和碱性原理：在样品中加入硫酸锰和碱性KI溶液，溶液，生成氢氧化锰生成氢氧化锰沉淀，与溶解氧反应生成硫酸锰，沉淀，与溶解氧反应生成硫酸锰，再在反应液中加入再在反应液中加入H2SO4, 释放出游离的碘，释放出游离的碘，然后用标准然后用标准Na2S2O3液滴定液滴定。 MnSO4+2NaOH

56、Mn(OH)2十十Na2SO4 2Mn(OH)2+O2MnO(OH)2 MnO(OH)2+Mn(OH)2MnMnO3+2H2O MnMnO3+3H2SO4+2KI2MnSO4+I2+3H2O+H2SO4 I2+2Na2S2O32NaI十十Na2S4O6 （1） 化学法（续）化学法（续）优点：测定较准确，且能得到氧的浓度值。优点：测定较准确，且能得到氧的浓度值。缺点：当样品中存在氧化还原性物质，测定结果会有缺点：当样品中存在氧化还原性物质，测定结果会有偏差；当样品带有颜色时，会影响测定终点的判断，偏差；当样品带有颜色时，会影响测定终点的判断，故不适合测定发酵液的溶解氧浓度。故不适合测定发酵液的溶

57、解氧浓度。（2）极谱法 原理：给浸在待测液体中的贵金属阴极和参考原理：给浸在待测液体中的贵金属阴极和参考电极（阳极）加上直流电压，当电解电压固定在电极（阳极）加上直流电压，当电解电压固定在0.8V左右时，与阴极接触的液体中的溶解氧发生左右时，与阴极接触的液体中的溶解氧发生如下氧化还原反应而被消耗，如下氧化还原反应而被消耗， 酸性时酸性时 O2+2H+2e H2O2 中性或碱性时中性或碱性时 O22H2O +2e H2O22OH 原理：原理： 阴极表面与液体的主体之间存在氧的浓度差，阴极表面与液体的主体之间存在氧的浓度差，于是液体主体的溶解氧就会扩散到阴极的表面参加电于是液体主体的溶解氧就会扩散

58、到阴极的表面参加电极反应，使电路中维持一定的电流极反应，使电路中维持一定的电流。当氧的扩散过程当氧的扩散过程达到稳定状态时，溶解氧浓度与测得的扩散电流成正达到稳定状态时，溶解氧浓度与测得的扩散电流成正比。比。氧浓度与扩散电流的关系氧浓度与扩散电流的关系 ADFLiCCLCL2ADFLiCLL2（2）极谱法极谱法阴极表面极易被污染，影响重现性，所以一般采阴极表面极易被污染，影响重现性，所以一般采用滴汞电板作为阴极（工作电极），阳极（参比用滴汞电板作为阴极（工作电极），阳极（参比电极）则可用甘汞电极。电极）则可用甘汞电极。如果样品中含有其它的氧化还原性物质会影响电如果样品中含有其它的氧化还原性物质

59、会影响电极反应，从而影响到该法的准确性，使测定结果极反应，从而影响到该法的准确性，使测定结果有误差。有误差。（3）复膜氧电极复膜氧电极法法复膜氧电极类型：极谱型；原电池型复膜氧电极类型：极谱型；原电池型原理原理：复膜氧电极测得的实际为氧从液相主体到阴极：复膜氧电极测得的实际为氧从液相主体到阴极的扩的扩 散速率。当扩散过程达到稳定状态时，散速率。当扩散过程达到稳定状态时，单位面积氧的扩散速率为：单位面积氧的扩散速率为： no2=kL(PL-P1)=km(P1-P2)=ke(P2-Pc)=K(PL-Pc) 根据根据Faraday定律，原电池型氧电极的稳定电流为定律，原电池型氧电极的稳定电流为： i

60、=4FAno2= 4FAK(PL-Pc)=KPL 溶氧电极测定的实际是氧从液相主体到溶氧电极测定的实际是氧从液相主体到阴极的扩散速率。阴极的扩散速率。复膜氧电极示意图复膜氧电极示意图 （a）极谱型）极谱型 （b）原电池型）原电池型复膜氧电极内外氧电压的分布复膜氧电极内外氧电压的分布c（二）摄氧率的测定原理与方法 瓦氏呼吸仪法瓦氏呼吸仪法物料衡算法物料衡算法氧电极法氧电极法 KLa的测定原理与方法的测定原理与方法亚硫酸盐氧化法亚硫酸盐氧化法取样极谱法取样极谱法物料衡算法物料衡算法动态法动态法排气法排气法复膜电极法复膜电极法（五）溶解氧对发酵的影响及其控制（五）溶解氧对发酵的影响及其控制1. 引起