蛋白质浓度测定方法比较

1、基因组基因组DNA提取及鉴定提取及鉴定1、0.1g 细胞细胞 2ml epp，混匀。，混匀。2、700l bufferA，65，10m，中间混匀一次，中间混匀一次3、苯酚、苯酚350l，氯仿，氯仿350l，混匀，混匀3m，12000rpm，5m4、上清、上清500l 至至1.5ml epp，500l（等体积）氯仿，混匀（等体积）氯仿，混匀3m，12000rpm，10m5、上清、上清400l到到1.5ml epp，异丙醇，异丙醇400l（0.7-1），），12000rpm，2m，（掏出，（掏出DNA，毛细管），毛细管）6、沉淀用、沉淀用70%乙醇洗乙醇洗2次，每次次，每次3m7、自然凉干（、自然

2、凉干（10m），），30lTE，充分溶解，充分溶解8、琼脂糖凝胶电泳鉴定、琼脂糖凝胶电泳鉴定蛋白质浓度测定方法比较蛋白质浓度测定方法比较 一、一、 实验目的实验目的学习三种蛋白质浓度的测定方法，并比学习三种蛋白质浓度的测定方法，并比较优缺点。较优缺点。 二、二、 实验原理与步骤实验原理与步骤OHOH 磷钼酸、磷钨酸磷钼酸、磷钨酸Pr+CuSOPr+CuSO4 4 Pr-Cu Pr-Cu络合物（紫红色）络合物（紫红色）蓝色化合物蓝色化合物蛋白质测定的范围：蛋白质测定的范围：25250g/mL标准蛋白标准蛋白BSA 250g/mL测定波长：测定波长：660nm1、 Lowry法（法（Foling-

3、酚法）酚法）反应原理：反应原理： 测定步骤：测定步骤：标准蛋白标准蛋白BSA 250g/mL （1 1）依次向试管中加入试剂：）依次向试管中加入试剂：（2 2）A660A660Pr作图，求待测蛋白浓度作图，求待测蛋白浓度管号管号1 12 23 34 45 56 6待测待测1 1待测待测1 1，BSA(mL)BSA(mL)0 00.20.20.40.40.60.60.80.81.01.01.01.01.01.0D.W(mL)D.W(mL)1.01.00.80.80.60.60.40.40.20.20 00 00 0Pr(g/mL)Pr(g/mL)试剂甲（试剂甲（mLmL）5.0 5.0 室温反应

4、室温反应1010分钟（双缩脲反应）分钟（双缩脲反应）试剂乙（试剂乙（mLmL）0.5 0.5 立即振摇，立即振摇，3030水浴水浴2020分钟分钟A660A660原理：蛋白质分子中原理：蛋白质分子中Tyr, Try, PheTyr, Try, Phe的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有UVUV吸收的性质，吸收高峰在吸收的性质，吸收高峰在280nm280nm处。处。测定范围：测定范围：0.10.11mg/mLpr1mg/mLpr测定波长：测定波长：280nm280nm标准蛋白标准蛋白BSABSA： 1mg/mL1mg/mL测定步骤：测定步骤：（1 1）向各试管中依

5、次加入各种试剂：）向各试管中依次加入各种试剂：（2 2）以）以A280nm-PrA280nm-Pr作标准曲线，作标准曲线，求待测蛋白浓度求待测蛋白浓度管号管号1 12 23 34 45 56 6待测待测1 1待测待测1 1，BSABSA（mLmL）0 00.50.51.01.02.02.03.03.04.04.04.04.04.04.0D.W(mL)D.W(mL)4.04.03.53.53.03.02.02.01.01.00 00 00 0Pr(mg/mL)Pr(mg/mL)A280nmA280nm2、紫外线（、紫外线（UV）吸收法：）吸收法：3、考马斯亮蓝显色法（、考马斯亮蓝显色法（Brad

6、ford法）法） 实验原理：实验原理：PrCBBG-250-PrPrCBBG-250-Pr复合物复合物 AA595595 标准蛋白标准蛋白BSABSA： 250g/mL250g/mL 操作步骤：操作步骤：（1 1）依次向各试管中加入各种试剂：）依次向各试管中加入各种试剂：（2 2）以）以A595nm-PrA595nm-Pr作标准曲线，作标准曲线，求待测蛋白浓度求待测蛋白浓度管号管号1 12 23 34 45 56 6待测待测1 1待测待测1 1，BSABSA（mLmL）0 00.20.20.40.40.60.60.80.81.01.01.01.01.01.0D.W(mL)D.W(mL)1.01

7、.00.80.80.60.60.40.40.20.20 00 00 0Pr(g/mL)Pr(g/mL)CBBG-250CBBG-250（mLmL）5.05.0A595nmA595nm 蔗糖酶蔗糖酶km值的测定值的测定 一、实验目的：一、实验目的：掌握掌握sucrose酶的酶的km测定的实验方法。测定的实验方法。二、实验原理：二、实验原理： 蔗糖酶是一种水解酶，催化反应：蔗糖蔗糖酶是一种水解酶，催化反应：蔗糖+水水G+F 每水解每水解1molS，生成，生成2mol还原糖，因此可用比色皿测定还原还原糖，因此可用比色皿测定还原糖量，即可知底物的水解速度。还原糖可还原糖量，即可知底物的水解速度。还原糖

8、可还原3，5-二硝基水杨二硝基水杨酸（酸（DNS）生成红棕色的氨基化合物，即）生成红棕色的氨基化合物，即3-氨基氨基-5-硝基水杨酸。硝基水杨酸。三、实验步骤三、实验步骤 管号管号蔗糖蔗糖（ml）H2O（ml）123456780.50.7511.522.5344.54.2543.532.521每管加酶液每管加酶液0.5 ml37准确作用准确作用5 minNaOH 0.5 ml每管取每管取0.5mlDNS 0.5ml沸水浴沸水浴3min冷却冷却DW 4mlA520取取8只试管，按下表分别加入如下试剂：只试管，按下表分别加入如下试剂： 以以1/A5201/S作图，求作图，求Km四、四、Km测定的意

9、义测定的意义:1、酶的特征性常数，进行酶学研究必须测定的一个参数；、酶的特征性常数，进行酶学研究必须测定的一个参数；2、代谢研究（特别是分支代谢途径的调节），、代谢研究（特别是分支代谢途径的调节），Km代表代表E争争夺夺S的能力，对反应速度（代谢）的计算非常重要。的能力，对反应速度（代谢）的计算非常重要。五、注意事项：五、注意事项：1、底物浓度应选择在、底物浓度应选择在Km值附近；值附近；2、反应时间应尽可能短，以保证反应初速度；、反应时间应尽可能短，以保证反应初速度；3、酶活力不能太高，否则不易控制；、酶活力不能太高，否则不易控制；4、加样应为一个人操作，保证各管间隔一致。、加样应为一个人操

10、作，保证各管间隔一致。 DNS-aa的聚酰胺薄膜层析的聚酰胺薄膜层析 一、实验原理：一、实验原理：荧光试剂二甲氨基萘磺酰氨（荧光试剂二甲氨基萘磺酰氨（DNS-Cl）,能与氨基酸的能与氨基酸的N末末端结合生成荧光物质端结合生成荧光物质DNS-aa，DNS-Cl也可与多肽或蛋白也可与多肽或蛋白质的游离氨基结合，生成质的游离氨基结合，生成DNA-Pr或或DNS-肽，经酸水解后肽，经酸水解后释放出释放出DNS-aa，各种，各种DNS-aa在聚酰胺薄膜的分配系数不在聚酰胺薄膜的分配系数不一样，一样，DNS-aa在在360或或280nm紫外光下发黄色荧光。紫外光下发黄色荧光。二、实验步骤：二、实验步骤：1、取聚酰胺薄膜、取聚酰胺薄膜1张（一人一张），铅笔做上样点标记张（一人一张），铅笔做上样点标记2、上样，毛细管上样直径、上样，毛细管上样直径2mm，多次上样，多次上样3、展层（通风橱内）、展层（通风橱内）4、检测，用吹风机吹干，紫外光检测