liuxh实验一显微镜的构造原理及使ppt课件

1、刘小红刘小红350783409: 350783409生命科学学科院生命科学学科院 生物技术教研室生物技术教研室 实验一、显微镜的构造原理及运用方法实验一、显微镜的构造原理及运用方法 实验二、细胞凝集景象的察看实验二、细胞凝集景象的察看 实验三、细胞膜的浸透性实验三、细胞膜的浸透性 实验四、叶绿体的分别及荧光景象的察看实验四、叶绿体的分别及荧光景象的察看 实验五、线粒体的分别及察看实验五、线粒体的分别及察看 实验六、实验六、DNA的的Fulgen染色法染色法 实验七、植物细胞骨架的察看实验七、植物细胞骨架的察看 实验八、实验八、RNA的的Brachet反响反响 实验九、

2、植物的组织培育实验九、植物的组织培育一根本构造一根本构造二放大原理及光路图二放大原理及光路图三性能和质量三性能和质量四运用方法四运用方法五运用本卷须知五运用本卷须知1、机械部分1镜座2镜柱3镜臂4镜筒5转换器6载物台7调理器2、照明部分1反光镜2聚光器3光圈 3、光学部分1目镜5，10， 152物镜 低：10或 15；高：40或 45；油 ：100普通显微镜的构造表示图左：单目；右：双目1、 目镜； 2、镜筒；3、物镜转换器；4、物镜；5、通光孔；6、聚光器；7、光圈；8、反光镜；9、粗调理器；10；细调理器；11、镜臂；12、移片器；13、载物台；14、倾斜关节；15、镜柱；16、镜座；17

3、、 标本挪动器螺旋；18、灯室 细胞中期图片细胞中期图片左：低倍镜；右：高倍镜左：低倍镜；右：高倍镜1、分辨率、分辨率resolution) 指能分辨出的相邻两个点间最小间隔的才干。指能分辨出的相邻两个点间最小间隔的才干。r = 0.61 / (n sin) r：分辨力；：分辨力； ：照明光源的波长；：照明光源的波长； n：介质的折射率；：介质的折射率； ：样品对物镜孔径角的半角；：样品对物镜孔径角的半角； 0.61：恒定的参数。：恒定的参数。注：注：n sin的量称为物镜的数值孔径，缩写为的量称为物镜的数值孔径，缩写为NA；r越小，那么分辨率越高。要增大数值孔径，孔径角越小，那么分辨率越高。

4、要增大数值孔径，孔径角无法增大，只能增大介质的折高压率，这样就诞生无法增大，只能增大介质的折高压率，这样就诞生了水浸物镜和油浸物镜，目前最大了水浸物镜和油浸物镜，目前最大NA值可达值可达1.4。透镜的焦距透镜的焦距透镜的角孔径透镜的角孔径2、放大率、放大率magnification)指最终成像的大小与原物体大小的比值。指最终成像的大小与原物体大小的比值。总放大率总放大率 = 物镜放大倍数物镜放大倍数 目镜放大倍数目镜放大倍数空气介质：可达空气介质：可达1000倍倍油介质通常是香柏油：可达油介质通常是香柏油：可达1400倍倍分辨本领分辨本领光源光源透镜透镜是否需真空是否需真空光学显微镜光学显微镜

5、300 nm可见光可见光玻璃透镜玻璃透镜否否200 nm (油）油）可见光可见光玻璃透镜玻璃透镜否否100 nm紫外光紫外光石英透镜石英透镜否否电子显微镜电子显微镜0.1 nm电子束电子束电磁透镜电磁透镜是是电子显微镜和光学显微镜的根本区别电子显微镜和光学显微镜的根本区别1、用前的预备任务、用前的预备任务1取显微镜；取显微镜；2完好性检查完好性检查2、低倍镜的运用、低倍镜的运用1预备；预备；2对光；对光；3放标本片放标本片4调理焦距调理焦距3、高倍镜的运用、高倍镜的运用4、油镜的运用方法、油镜的运用方法5、运用练习、运用练习1 1、持镜时必需是右手握臂、左手托座的姿态，不可单手提取，以免零件零

6、落或碰撞到、持镜时必需是右手握臂、左手托座的姿态，不可单手提取，以免零件零落或碰撞到其它地方。其它地方。 2 2、轻拿轻放，不可把显微镜放置在实验台的边缘，应放在距边缘、轻拿轻放，不可把显微镜放置在实验台的边缘，应放在距边缘10cm10cm处，以免碰翻落处，以免碰翻落地。地。3 3、察看有液体的暂时标本时要加盖片，以免液体污染镜头和显微镜。、察看有液体的暂时标本时要加盖片，以免液体污染镜头和显微镜。4 4、粗、细调理钮要配合运用，不能过度调理，调时侧面凝视镜筒下降，以免压坏标本、粗、细调理钮要配合运用，不能过度调理，调时侧面凝视镜筒下降，以免压坏标本和镜头。和镜头。5 5、坚持显微镜的清洁，光

7、学和照明部分只能用擦镜纸擦拭，切忌口吹手抹或用布擦，、坚持显微镜的清洁，光学和照明部分只能用擦镜纸擦拭，切忌口吹手抹或用布擦，机械部分用布擦拭。机械部分用布擦拭。6 6、水滴、酒精或其它药品切勿接触镜头和镜台，假设沾污应立刻用擦镜纸擦净。、水滴、酒精或其它药品切勿接触镜头和镜台，假设沾污应立刻用擦镜纸擦净。7 7、放置玻片标本时要对准通光孔中央，且不能反放玻片，防止压坏玻片或碰坏物镜。、放置玻片标本时要对准通光孔中央，且不能反放玻片，防止压坏玻片或碰坏物镜。8 8、要养成两眼同时睁开察看的习惯，以左眼察看视野，右眼用以绘图。、要养成两眼同时睁开察看的习惯，以左眼察看视野，右眼用以绘图。9 9、

8、不要随意取下目镜，以防止尘土落入物镜，也不要恣意装配各种零件，以防损坏。、不要随意取下目镜，以防止尘土落入物镜，也不要恣意装配各种零件，以防损坏。1010、运用终了后，必需复原才干放回镜箱内，其步骤是：取下标本片，转动旋转器使、运用终了后，必需复原才干放回镜箱内，其步骤是：取下标本片，转动旋转器使镜头分开通光孔，下降镜台，平放反光镜，下降集光器镜头分开通光孔，下降镜台，平放反光镜，下降集光器( (但不要接触反光镜但不要接触反光镜) )、封锁、封锁光圈，推片器回位，盖上绸布和外罩，放回实验台柜内。最后填写运用登记表。光圈，推片器回位，盖上绸布和外罩，放回实验台柜内。最后填写运用登记表。( (注：

9、反光镜通常应垂直放，但有时因集光器没提至应有高度，镜台下降时会碰坏注：反光镜通常应垂直放，但有时因集光器没提至应有高度，镜台下降时会碰坏光圈，所以这里改为平放光圈，所以这里改为平放) ) 根据光学上的丁道尔Tyndoll景象，微尘细粒在强光直射经过的情况下，不能为人眼所见，这是由于光线过强及绕射景象等要素，因此看不到微尘的笼统。假设把光线斜射它们，那么由于光的反射或衍射的结果，微尘细粒似乎增大了体积，而为人眼可见。 据此原理，使光不直接经过样品而是斜射到样品上，即可在暗视野下察看细微粒子。2、构造及光路、构造及光路 光源的中央光束被阻挠，不能由下而上地经过标本进入物镜。从而光线改动途径，倾斜地

10、照在标本上，标本遇光发生反射、衍射或散射，散射和衍射光线进入物镜内，因此整个视野是黑暗的。在暗视野中，察看到的是被检物体的衍射光和散射光的图像，并非物体的本身，所以只能看见物体的存在、运动及外部形状，不能分辨其内部构造。3、运用及运用本卷须知、运用及运用本卷须知 能察看到能察看到0.20.004 m的亚微颗粒，的亚微颗粒，适宜察看活细胞内的细胞核、线粒体、液适宜察看活细胞内的细胞核、线粒体、液体介质中的细菌和霉菌等。体介质中的细菌和霉菌等。 暗场镜检要求载玻片和盖玻片必需无疵暗场镜检要求载玻片和盖玻片必需无疵痕而无尘土，物镜前透镜也必需清洁无尘。痕而无尘土，物镜前透镜也必需清洁无尘。 载玻片与

11、盖玻片的厚度应符合规范，载载玻片与盖玻片的厚度应符合规范，载玻片太厚，那么聚光聚的焦点落在载玻片玻片太厚，那么聚光聚的焦点落在载玻片内，而达不到被检物体的平面上，盖玻片内，而达不到被检物体的平面上，盖玻片太厚，在运用油镜头的情况下，由于物镜太厚，在运用油镜头的情况下，由于物镜的任务间隔很短，甚至无法调焦，而看不的任务间隔很短，甚至无法调焦，而看不到或看不清被检物体。到或看不清被检物体。 由于细胞不同部位的折射率不同，当光经过细由于细胞不同部位的折射率不同，当光经过细胞的不同部位时有不同程度的滞后，这样就产生了胞的不同部位时有不同程度的滞后，这样就产生了相位差。相位差。 另外一束光经过物体同一部

12、位后构成两束光，另外一束光经过物体同一部位后构成两束光，一束直行构成直射光，另一束斜行或绕行构成衍射一束直行构成直射光，另一束斜行或绕行构成衍射光，衍射光的相位相对落后。当二者相遇时又发生光，衍射光的相位相对落后。当二者相遇时又发生干涉，合光振幅取决于两者的相位。干涉，合光振幅取决于两者的相位。 相差显微镜就是利用光的衍射和干涉特性使相相差显微镜就是利用光的衍射和干涉特性使相位差变成振幅差，表现为明与暗的对比，使肉眼得位差变成振幅差，表现为明与暗的对比，使肉眼得以察看到无色透明物体中的细节。以察看到无色透明物体中的细节。光学原理光路图光路图 能将直射光视野中的背景光与经物能将直射光视野中的背景

13、光与经物体衍射的光分开；能将大约一半的波长从相位体衍射的光分开；能将大约一半的波长从相位中除去，使之不能发生相互作用，从而引起强中除去，使之不能发生相互作用，从而引起强度的变化。加上利用了光的衍射和干涉特性使度的变化。加上利用了光的衍射和干涉特性使相位差变成振幅差，表现为明与暗的对比，所相位差变成振幅差，表现为明与暗的对比，所以能察看无色、透明、活细胞中的构造。以能察看无色、透明、活细胞中的构造。1 1、原理、原理 人眼不可见的一定波长的紫外线人眼不可见的一定波长的紫外线作光源照射被检物体，激发标本内的荧作光源照射被检物体，激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，光物质发射出各种不同颜

14、色的荧光后，再经显微镜成像系统放大来进展镜检。再经显微镜成像系统放大来进展镜检。 荧光显微术是生物，医学中的重荧光显微术是生物，医学中的重要研讨手段，如对生物组织、生理、病要研讨手段，如对生物组织、生理、病理、微生物、医药、食品、化学等诸方理、微生物、医药、食品、化学等诸方面的鉴定等。面的鉴定等。2、根本构造、根本构造 由普通光学显微镜加上一些由普通光学显微镜加上一些附件如荧光光源、激发滤片、附件如荧光光源、激发滤片、阻断滤片等的根底上组成的。阻断滤片等的根底上组成的。 每种物质被激发光照射后，每种物质被激发光照射后，在极短时间内发射出较照射波长在极短时间内发射出较照射波长更长的可见荧光。更长

15、的可见荧光。 荧光具有专注荧光具有专注性，普通比激发光弱，为能察看性，普通比激发光弱，为能察看到专注的荧光，在物镜后面需加到专注的荧光，在物镜后面需加阻断或压制滤光片。它的作阻断或压制滤光片。它的作用有二：一是吸收和阻挠激发光用有二：一是吸收和阻挠激发光进入目镜、以免干扰荧光和损伤进入目镜、以免干扰荧光和损伤眼睛；二是选择并让特异的荧光眼睛；二是选择并让特异的荧光透过，表现出专注的荧光颜色。透过，表现出专注的荧光颜色。293 3、特点、特点1 1光源为紫外线，光源为紫外线，波长较短；波长较短；2 2分辨力高于普分辨力高于普通显微镜；通显微镜；3 3有两个特殊的有两个特殊的滤光片；滤光片；4 4

16、照明方式通常照明方式通常为落射式。为落射式。4、分类、分类 据其光路来分有据其光路来分有两种：两种：1透射式荧光显透射式荧光显微镜微镜2落射式荧光显落射式荧光显微镜微镜Fluorescence image of epithelial cell, DNA in blue and Microtubules in green 1翻开灯源，超高压汞灯要预热几分钟才翻开灯源，超高压汞灯要预热几分钟才干到达最亮点。干到达最亮点。 2透射式荧光显微镜需在灯源与聚光器之透射式荧光显微镜需在灯源与聚光器之间装上所要求的激发滤片，在物镜的后面间装上所要求的激发滤片，在物镜的后面装上相应的阻断滤片。落射式荧光显微镜

17、装上相应的阻断滤片。落射式荧光显微镜需在光路的插槽中插入所要求的激发滤片需在光路的插槽中插入所要求的激发滤片双色束分别器阻断滤片的插块。双色束分别器阻断滤片的插块。 3用低倍镜察看，根据不同型号荧光显微镜的调用低倍镜察看，根据不同型号荧光显微镜的调理安装，调整光源中心，使其位于整个照明光斑的理安装，调整光源中心，使其位于整个照明光斑的中央。中央。 4放置标本片，调焦后即可察看。放置标本片，调焦后即可察看。 运用中应留意：运用中应留意：未装滤光片不要用眼直接察看，以免引起眼的损伤；未装滤光片不要用眼直接察看，以免引起眼的损伤；用油镜察看标本时，必需用无荧光的特殊油镜；高用油镜察看标本时，必需用无

18、荧光的特殊油镜；高压汞灯封锁后不能立刻重新翻开，需经压汞灯封锁后不能立刻重新翻开，需经5分钟后才分钟后才干再启动，否那么会不稳定，影响汞灯寿命。干再启动，否那么会不稳定，影响汞灯寿命。 组成和普通显微镜一样，只不过物镜与组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于察看培育的活细胞。载物台之上，用于察看培育的活细胞。 集光器和载物台间的任务间隔提高集光器和载物台间的任务间隔提高后，可放置培育、培育瓶等容器，直接后，可放置培育、培育瓶等容器，直接对培育的细胞进展照明和察看。对培育的细胞进展照明和察看。38五激光共聚焦

19、扫描显微境五激光共聚焦扫描显微境(Laser confocal scanning microscope, LCSM)种类种类波长波长氩氟激光（紫外光）193氪氟激光（紫外光）248氙氯激光（紫外光）308氮激光（紫外光）337氩激光（蓝光）488氩激光（绿光）514氦氖激光（绿光）543氦氖激光（红光）633激光种类及波长激光种类及波长40 用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。 能显示细胞样品的立体构造。能显示细胞样品的立体构造。 分辨力是普通光学显微镜的分辨力是普通光学显微镜的3 3倍。倍。 用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，构成用途类似荧光显

20、微镜，但能扫描不同层次，构成立体图像。立体图像。优 点41LCSM Image of a Xenopus Melanophore 爪蟾黑色素细胞爪蟾黑色素细胞 microtubule cytoskeleton (green) and the nucleus (blue)一透射电子显微镜一透射电子显微镜二扫描电子显微镜二扫描电子显微镜三扫描透射电子显微镜三扫描透射电子显微镜 电子显微镜与光学显微镜的成像原理根本一样，所电子显微镜与光学显微镜的成像原理根本一样，所不同的是前者用电子束作光源，用电磁场作透镜；不同的是前者用电子束作光源，用电磁场作透镜；而后者以可见光或紫外线为光源。而后者以可见光或紫

21、外线为光源。 另外，由于电子束的穿透力很弱，因此用于电镜的另外，由于电子束的穿透力很弱，因此用于电镜的标本须制成厚度约标本须制成厚度约50nm左右的超薄切片。左右的超薄切片。 电子显微镜的放大倍数最高可达近百万倍、由电子电子显微镜的放大倍数最高可达近百万倍、由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等统、电源系统等5部分构成。部分构成。特点特点45不同光线的波长不同光线的波长47一透射电子显微镜一透射电子显微镜transmission electron microscope, TEMtransmission electron microscope, TEM48 以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束的波长短，以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束的波长短，并且波长与加速电压并且波长与加速电压( (通常通常50120KV)50120KV)的平方根成反比。的平方根成反比。 由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等录系统、电源系统等5 5部分构成。部分构成。 分辨力分辨力0.2nm0.2nm，放大倍数可达百万倍。，放大倍数可达百万倍。 用于察看超微构造用于察看超微构