微生物实验室建立、使用及培养基配制验收常见问题

1、汇报内容 一、什么是生物安全实验室 二、生物安全实验室与洁净实验室的区别 三、生物安全实验室的建立 四、生物安全实验室的管理与使用 五、培养基的验收、使用、保存注意事项 什么是生物安全实验室？ 是通过规范的实验室设计建造、实验设备的配置、个人防护装备的使用（硬件）、严格遵从标准化的操作程序和管理规程等（软件）：确保操作生物危险因子的工作人员不受实验对象的伤害；确保周围环境不受其污染；确保实验因子保持原有本性所采取综合措施的实验室。生物安全防护的基本原则(三要素) 安全设备、个体防护装置和措施 。 实验室的特殊设计和建设要求 。 严格的管理制度和标准化的操作程序和规程目标确保实验室工作人员不受实

2、验对象侵染， 确保周围环境不受其污染的目的。 洁净实验室与生物安全实验室的区别 洁净实验室只针对实验环境提出洁净要求，不提供对人员或环境的生物安全保护。(超净工作台不能替代生物安全柜)。 普通的微生物实验(不进行病原微生物分离与鉴定)只要求在洁净实验室进行。 进行病原微生物分离与鉴定必须在生物安全实验室中进行。洁净实验室与生物安全实验室的区别空气洁净等级空气洁净等级 含尘浓度含尘浓度 含菌浓度含菌浓度 尘粒粒径尘粒粒径(m) (m) 尘粒数尘粒数（个（个mm3 3 ） 沉降菌沉降菌(cm(cm碟碟0.5h0.5h） 浮游菌浮游菌( (个个mm3 3) ) 100100级级 0.5 0.5 3,

3、500 3,500 1 1 5 5 5 5 0 0 1000010000级级 0.5 0.5 350,000 350,000 3 3 1001005 5 2,000 2,000 100000100000级级 0.5 0.5 3,500,000 3,500,000 10105005005 5 20,000 20,000 大于大于100000100000( (相当于相当于300000300000级级) ) 0.5 0.5 10000000 10000000 5 5 61800 61800 生物安全实验室的主要技术指标级别级别洁净洁净度级度级别别最小换最小换气次数气次数( (次次/h)/h)与室外方

4、向上与室外方向上相邻相通房间相邻相通房间的最小负压差的最小负压差(Pa)(Pa)温度温度相对湿相对湿度度%噪声噪声dB(A)dB(A)最低照最低照度度lx lx一级一级_ _可开窗可开窗_ _1828182870706060200200二级二级_ _可开窗可开窗_ _18271827307030706060300300三级三级7 7或或8 81515或或1212-10-1015251525306030606060350350四级四级7 7或或8 81515或或1212-10-1018241824306030606060350350注：BSL-3主要实验室相对于大气的最小负压不应小于-30Pa，

5、BSL-4主要实验室相对于大气的最小负压不应小于-40Pa。本表中的噪声不包括生物安全柜、动物隔离器的噪声，如包括上述设备的噪声，则最大不应超过68dB(A)。 1、 符合BSL-2实验室建设要求。2、 实验室门口带锁并可自动关闭。实验室的门应有可视窗。3、 有足够的存储空间摆放物品以方便使用。在实验室工作区域处还有供长期使用的存储空间。4、 在实验室的工作区域处应有存放个人衣物的条件。6、 在实验室所有的建筑内配备高压蒸汽灭菌器，并按期检查和验证，以保证符合要求。7、 在实验室内配备生物安全柜。8、 设洗眼设施，必要时应有应急喷淋装置。9、 考虑机械通风，如使用窗户自然通风，有防虫纱窗。10

6、、有可靠的电力供应和应急照明。必要时，重要设备如培养箱、生物安全柜、冰箱等应设备用电源。11、实验室出口有在黑暗是可明确辨认的标识。生物安全二级实验室 一级生物安全防护实验室，简称BSL1或P1 二级生物安全防护实验室，简称BSL2或P2 三级生物安全防护实验室，简称BSL3或P3 四级生物安全防护实验室，简称BSL4或P4实验室生物安全防护分级：实验室生物安全防护分级： BSL BSL：Biosafety levelBiosafety level；P P：Protect.Protect.a)生物安全防护水平为一级的实验室适用于操作在通常情况下不会引起人类或者动物疾病的微生物；b)生物安全防护

7、水平为二级的实验室适用于操作能够引起人类或者动物疾病，但一般情况下对人、动物或者环境不构成严重危害，传播风险有限，实验室感染后很少引起严重疾病，并且具备有效治疗和预防措施的微生物；c)生物安全防护水平为三级的实验室适用于操作能够引起人类或者动物严重疾病，比较容易直接或者间接在人与人、动物与人、动物与动物间传播的微生物；d)生物安全防护水平为四级的实验室适用于操作能够引起人类或者动物非常严重疾病的微生物，以及我国尚未发现或者已经宣布消灭的微生物。 BSL-1 对健康成年人无已知治病作用的，如大肠杆菌等BSL-2 低致病性流感病毒、伪狂犬病病毒、致病性大肠杆菌、沙门氏菌等；BSL-3 猪瘟病毒、狂

8、犬病病毒、炭疽杆菌、艾滋病毒等BSL-4 炭疽杆菌、霍乱弧菌、埃博拉病毒、天花病毒等。塞拉利昂首都弗里敦中塞友好医院的中国移动实验室我国首个生物安全防护等级最高的实验室中国科学院武汉国家生物安全实验室（即武汉P4实验室） BSL1实验室：无须特殊选址，普通建筑物即可 BSL2实验室：在建筑物内考虑设置通风系统 BSL3实验室：在建筑物内自成隔离区 BSL4实验室：远离城区，独立建筑物，或在建筑 物中的独立隔离区生物安全实验室选址要求5 5 实验室设计原则及基本要求5.1 实验室选址、设计和建造应符合国家和地方环境保护和建设主管部门等的规定和要求。5.2 实验室的防火和安全通道设置应符合国家的消

9、防规定和要求，同时应考虑生物安全的特殊要求；必要时，应事先征询消防主管部门的建议。5.3 实验室的安全保卫应符合国家相关部门对该类设施的安全管理规定和要求。5.4 实验室的建筑材料和设备等应符合国家相关部门对该类产品生产、销售和使用的规定和要求。5.5 实验室的设计应保证对生物、化学、辐射和物理等危险源的防护水平控制在经过评估的可接受程度，为关联的办公区和邻近的公共空间提供安全的工作环境，及防止危害环境。5.6 实验室的走廊和通道应不妨碍人员和物品通过。5.7 应设计紧急撤离路线，紧急出口应有明显的标识。5.8 房间的门根据需要安装门锁，门锁应便于内部快速打开。5.9 需要时（如：正当操作危险

10、材料时），房间的入口处应有警示和进入限制。5.10应评估生物材料、样本、药品、化学品和机密资料等被误用、被偷盗和被不正当使用的风险，并采取相应的物理防范措施。5.11应有专门设计以确保存储、转运、收集、处理和处置危险物料的安全。5.12 实验室内温度、湿度、照度、噪声和洁净度等室内环境参数应符合工作要求和卫生等相关要求。5.13 实验室设计还应考虑节能、环保及舒适性要求，应符合职业卫生要求和人机工效学要求。5.14 实验室应有防止节肢动物和啮齿动物进入的措施。5.15 动物实验室的生物安全防护设施还应考虑对动物呼吸、排泄、毛发、抓咬、挣扎、逃逸、动物实验（如：染毒、医学检查、取样、解剖、检验等

11、）、动物饲养、动物尸体及排泄物的处置等过程产生的潜在生物危险的防护。5.16 应根据动物的种类、身体大小、生活习性、实验目的等选择具有适当防护水平的、适用于动物的饲养设施、实验设施、消毒灭菌设施和清洗设施等。5.17 不得循环使用动物实验室排出的空气。5.18 动物实验室的设计，如：空间、进出通道、解剖室、笼具等应考虑动物实验及动物福利的要求。5.19 适用时，动物实验室还应符合国家实验动物饲养设施标准的要求。整体布局l微生物实验室自成一区，与其他实验室分开，门口设有门禁，只有相关人员通过许可后才能进入。l实验室应明确区分辅助工作区和防护区，实验室工作区域外应有存放备用物品的条件。l防护区中直

12、接从事高风险操作的工作间为核心工作间，人员应通过缓冲间进入核心工作间。l实验室辅助工作区应至少包括监控室和清洁衣物更换间；防护区应至少包括缓冲间（可兼作脱防护服间）及核心工作间。实验室功能区域模块化设计非实验室区域非实验室区域实验室区域实验室区域办办公公室室信信息息室室档档案案资资料料室室样样品品室室卫卫生生与与清清洁洁室室实实验验室室实实验验辅辅助助室室洗涤、高压、制水室洗涤、高压、制水室实验准备室实验准备室试剂配制室试剂配制室实验材料储备室实验材料储备室培养观察室培养观察室淋浴、更衣室淋浴、更衣室药物、紧急冲淋装置药物、紧急冲淋装置温度控制室温度控制室菌种保管室菌种保管室微生物实验室平面布

13、局流向非实验室非实验室区域区域实验准备实验准备区域区域洁净实验室洁净实验室工作区域工作区域污染物处理污染物处理区域区域病原菌实验室病原菌实验室工作区域工作区域实验室受控区域实验室受控区域原则：原则：洁污流线分明、流程简捷、层次清析去污有洁污流线分明、流程简捷、层次清析去污有 效，能有效地切断感染途径，降低感染率。效，能有效地切断感染途径，降低感染率。 围护结构、装潢装饰u围护结构（包括墙体）应符合国家对该类建筑的抗震要求和防火要求。u天花板、地板、墙间的交角应易清洁和消毒灭菌。u实验室防护区内围护结构的所有缝隙和贯穿处的接缝都应可靠密封。u实验室防护区内围护结构的内表面应光滑、耐腐蚀、防水，以

14、易于清洁和消毒灭菌。u实验室防护区内的地面应防渗漏、完整、光洁、防滑、耐腐蚀、不起尘。u实验室及设备间的高度应满足设备的安装要求，应有维修和清洁空间。 u在通风空调系统正常运行状态下，采用烟雾测试等目视方法检查实验室防护区内围护结构的严密性时，所有缝隙应无可见泄漏实验室主题框架为彩钢板玻璃隔断，颜色为哑白色。隔断普通玻璃厚度为8MM,为防止沉积灰尘，窗料使用R25MM铝合金圆弧压线；所有二维连接处的内侧均使用R50MM铝合金内圆角，暴露在外的二维连接线的外侧则用R100MM铝合金外角连接；彩钢板的三维连接处使用三维接点过度，而彩钢板与墙角地面则用铝合金槽连接。吊顶材料亦为彩钢板。微生物检测室地

15、面为环氧树脂材料，具有无缝隙、耐腐蚀、平整、容易清洗的特征。地面地脚线用阴角铝材装饰，美观且严密性好。空调、通风和净化 为满足BLS-2实验室温湿度要求，宜配备机械空调通风系统，有特殊要求的可增设设计要求，如增设净化要求并按净化要求进行送回（排）风系统设计等。这方面，应重点处理好以下几个问题：1、可以采用带循环风的空调系统。如果涉及化学溶媒，感染性材料和动物实验，则应采用全排风系统。2、实验室内各种设备的位置应有利于气流由“清洁”空间向“污染”空间流动，最大限度减少室内回流与漏流（生物安全柜一般应置于室内气流最下游，即最远离送风口处）。*生物安全柜的排风不能代替室内排风。洁净室原理 新风新风新

16、风机新风机送风机送风机洁净室洁净室（+）更更2（+）更更1走廊走廊送风送风回风回风+高效过滤器高效过滤器一级过滤器一级过滤器二级过滤器二级过滤器+排排风风机机1、洁净度：无要求2、最小换气次数：可开窗通风3、与室外方向相邻相通房间的压差：无要求4、温度：18275、相对湿度：30706、噪声dB(A)：607、最低照度lx：300*上诉指标是建立BLS-2实验室的最低要求，建设者可根据实际需要适当提高相应指标，如洁净度、压差等。BSL-2 实验室对环境的要求洁净实验室技术参数1、新风量新风量：要满足洁净室最小新风量、满足洁要满足洁净室最小新风量、满足洁净室正压要求的最小新风量、满足每个人所需净

17、室正压要求的最小新风量、满足每个人所需最小新风量之和。最小新风量之和。 保证供给洁净室内每人每小保证供给洁净室内每人每小时的新鲜空气量不小于时的新鲜空气量不小于40m40m3 3。2 2、压差：洁净区与非洁净区之间的压差，应不、压差：洁净区与非洁净区之间的压差，应不小于小于5Pa5Pa，洁净区与室外的压差，应，洁净区与室外的压差，应不小不小10Pa10Pa。洁净实验室技术参数3 3、配电：有自备电源或不间断电源供电，持续、配电：有自备电源或不间断电源供电，持续保证洁净实验室正常供电。保证洁净实验室正常供电。4、空气净化级别表空气净化级别表等级等级静态空气洁净度静态空气洁净度浮游菌浮游菌落菌量落

18、菌量自净自净换气换气数数级别级别0.5m的微粒数的微粒数/m3（菌落数（菌落数/m3）(菌落数菌落数/0.05 ,30min)10035005110003500075210000350000150321-26排水含菌污水应经高温高压消毒或化学消毒后排放至市政污水排放公用系统。电气设置1、应设专用配电箱。2、电源宜设置漏电检测报警装置。3、应有可靠的接电系统，其接地电阻不宜大于1。4、实验室入口应有实验室工作状态的文字式灯光讯号显示。5、应设紧急发光疏散指示标志。消防建筑物耐火等级不低于二级。排水、电气和消防特殊要求及安全设备1、在生物安全实验室的入口，应明确标示出操作所接触的病原体的名称、危害

19、等级、预防措施负责人姓名、紧急联络方式等，同时应标示出国际通用生物危险符号，生物危险符号的颜色应为黑色，背景色为黄色。2、实验室门口带锁并可自动关闭，并应有可视窗。3、送、排风管道应隐蔽安装，管道咬口缝均应用胶密封，并应有安全的现场更换条件。4、实验室应有防止节肢动物和啮齿动物进入的措施。实验室安全设施设备实验室安全设施设备实验室安全设施设备实验室安全设施设备实验室安全设施设备实验室安全设施设备实验室安全设施设备实验室安全设施设备实验室安全设施设备实验室安全设施设备实验室安全设施设备实验室安全设施设备 定义定义【隔离隔离】: :生物安全柜生物安全柜防止操作过程中含有危害性或未知生物气溶胶散逸的

20、空气净化安全装置。生物安全柜是最重要的安全设备，形成最主要的防护屏障。超净工作台不可替代生物安全柜使用！注意乳胶手套的使用实验室安全设施设备实验室安全设施设备38实验室安全设施设备实验室安全设施设备实验室安全设施设备实验室安全设施设备实验室安全设施设备实验室安全设施设备BSL2：实验室设施(二级屏障) u 应设洗手池，宜设置在靠近实验室的出口处。u 在实验室门口处应设存衣或挂衣装置，可将个人服装与实验室工作服分开放置。u 如果有可开启的窗户，应安装可防蚊虫的纱窗。u 避免不必要的反光和强光。u 若操作刺激或腐蚀性物质，应在30m 内设洗眼装置，必要时应设紧急喷淋装置。u 应设应急照明装置。u

21、供水和排水管道系统应不渗漏，下水应有防回流设计。u 应配备适用的通讯设备。u 应配备适当的消毒灭菌设备。u 实验室主入口的门、放置生物安全柜实验间的门应可自动关闭；实验室主入口的门应有进入控制措施。门锁及门的开启方向应不妨碍室内人员逃生。u 应在实验室工作区配备洗眼装置。u 应在实验室或其所在的建筑内配备高压蒸汽灭菌器或其他适当的消毒灭菌设备。u 应在操作病原微生物样本的实验间内配备生物安全柜。u 应按产品的设计要求安装和使用生物安全柜。如果生物安全柜的排风在室内循环，室内应具备通风换气的条件；如果使用需要管道排风的生物安全柜，应通过独立于建筑物其他公共通风系统的管道排出。微生物实验室常用仪器

22、1、超净工作台2、培养箱/低温培养箱3、天平4、微生物均质器5、菌落计数器6、高压灭菌锅7、移液器8、微波炉/电炉9、低温冰箱10、生物安全柜11、摇床12、纯水装置13、生物显微镜14、冷冻干燥机15、恒温干燥箱16、恒温水浴锅17、离心机18、浊度计19、低温冰箱20、离心机GB 27405-2008实验室质量控制规范附录C 设备的校准、维护、和性能验证 微生物实验室常用耗材1、酒精灯2、试管架3、量筒4、烧杯5、玻璃试管6、灭菌吸管7、剪刀8、镊子9、脱脂棉10、纱布11、无菌均质袋12、接种环13、过滤器14、冻存管15、离心管16、培养皿17、等等无菌室的管理无菌室在使用前和使用后应

23、进行有效的消毒。无菌室的消毒效果应至少每两周验证一次。应制定清洁、消毒、灭菌、使用和应急处理程序。应建立环境监测结果，并归档保存。不符合规定时应立即停止使用。微生物实验室消毒处理方法 无菌室紫外线消毒在室温2025时，220V30W紫外灯垂直1.0m处的253.7nm紫外线辐射强度应70W/cm2，低于此值时应更换。适当数量的紫外灯，确保平均每立方米应不少于1.5W。紫外线消毒时，无菌室内应保持清洁干燥。在无人条件下，可采取紫外线消毒，作用时间应30min，室内湿度20或40、相对湿度60%时，应适当延长照射时间。用紫外线消毒物品表面时，应使照射表面受到紫外线的直接照射，且应达到足够的照射剂量

24、。人员在关闭紫外灯后至少30min方可入内操作。按照ISO18953的规定，评价紫外线的消毒与杀菌效果。 无菌室臭氧消毒封闭无菌室内，无人条件下，采用20mg/m3浓度的臭氧，作用时间应30min。消毒后臭氧浓度0.2mg/m3时方可入内操作。按照GB/T18202的规定，检测室内臭氧浓度。无菌室空气灭菌效果验证方法(沉降法)在消毒处理后与开展检验活动之前期间采样。取样位点的选择应基于人员流量情况和做试验的频率。一般情况下，无菌室面积30m2时，从所设定的一条对角线上选取3点，即中心1点，两端各距墙1m处各取1点；无菌室面积 30m2时，选取东、西、南、北、中5点，其中东点、西点、南点、北点均

25、距墙1m。无菌室(30m2)无菌室(30m2)无菌室( 30m2)采样点设置图 在所选位点，将平板计数琼脂平板(90mm)或置于距地面80cm，开盖暴露15min，然后，置36 1的恒温培养箱培养48h 1h。如果检测某目标霉菌或细菌，则可用选择性琼脂平板(如XLT-4、PALCAM等) 。确定平板上的菌落数，如大于所设定的风险值，应分析原因，并采取适当措施。 培养基与试剂的消毒与灭菌培养基通常应采用高压温热灭菌法，121灭菌15min，特殊培养基按使用者的特殊要求进行灭菌(如含糖培养基，115 灭菌20min)。部分培养基(如嗜盐琼脂培养基、胆硫乳培养基等)，只能煮沸灭菌。对热敏感的培养基或

26、添加物质，应采用膜过滤的方法过滤除菌。即用型培养基不需灭菌，应参见相关国际标准或供应商使用说明书，直接使用。 器具与设备的消毒灭菌 温热灭菌：采用高压灭菌器， 121灭菌20min，适用于玻璃器皿、移液器吸头、塑料瓶等。按照GB15981的规定，评价高压灭菌器的杀菌效果。干燥灭菌：采用干燥箱灭菌，160，灭菌2h，适用于玻璃器皿和不锈钢器具等。 液体消毒剂消毒：使用适当浓度自配或商业液体消毒剂对工作台面、器具或设备表面进行消毒。可按照GB15981的规定，评价自配或商业液体消毒剂的消毒效果。可按照ISO18953的规定，监测工作台面、器具或设备表面的消毒效果。实验室废弃物的处理对于培养物及其污

27、染的物品(如培养基、测试条、生物鉴定管、血清学鉴定用玻片、用过的移液器吸头、细菌培养皿、注射器等)，应使用适当浓度的自配或商业液体消毒剂对其处理一定时间，或121高压灭菌至少20min，或其他有效处理措施。将处理物倒入特殊标志的垃圾袋内，直接送到指定地点。部分消毒剂的特性消毒剂抗活性被灭活毒性真菌细菌分枝杆菌孢子亲脂病毒 非亲脂病毒蛋白质天然物质合成物质硬水去垢剂皮肤眼睛肺G+G_次氯酸盐+C+乙醇-+-+V+-+甲醛+a+-+戊二醛+b+NA+NA+碘载体+A+-注：+，良好；+，一般；+，轻微；-。零；V，取决于病毒；C，阳离子；A，阴离子；NA，不适用。参考文献 GB 27405-200

28、8实验室质量控制规范 食品微生物检测 GB 50364-2011 生物安全实验室建筑技术规范 GB 19489-2004生物安全通用要求 GB 15981 消毒与灭菌效果的评价方法与标准 管理要求1、组织 2、质量体系 3、文件控制 4、检测和校准的分包 5、服务和供应品的采购 6、对客户的服务 7、投诉 8、不符合监测工作的控制 9、纠正措施 10、预防措施 11、记录的控制 12、内部审核 13、管理评审 技术要求1、人员 2、设施与环境条件 3、方法的确认 4、设备 5、测量溯源性 6、抽样 7、测试和校准物品的处置 8、检测和校准结果质量的保证 9、结果报告GB 27405-2008实

29、验室质量控制规范 食品微生物检测GB 19489-2004生物安全通用要求CANS-CL09 检测和校准实验室认可准则在微生物领域的应用说明61 人员 关键检测人员应至少具有微生物或相关专业专科以上的学历，或者具有10年以上微生物检测工作经历。62人员 实验室使用人员时，应考虑有颜色视觉障碍的人员不能执行某些涉及到辨色的试验。63组织实验室技术管理者中应至少包括一名微生物技术负责人专业背景：密切相关的本科以上学历检测经验：3年以上微生物检测的工作经历负责指导、培训检验人员常规微生物实验64服务和供应品的采购 对实验室自制的培养基即实验室制备各别成分培养基，实验室应有培养基质量控制程序 包括培养

30、基的性能测试、实验室内部的配制规范，以监控基础材料的质量，确保不同时期制备的培养基性能的一致性和符合检测的要求。对于关键培养基和试剂，要求进行技术性验收，可参考ISO/TS 11133 或SN/T1538培养基制备指南。当有足够数据证明其可信性时，验收的技术性指标可减少。培养基的质量保证微生物要求 ： 微生物污染测试 （ 适用于即用型培养基 ） 生长特性1 、 生长率2 、 选择性3 、 特异性注 ：参照GB 4789.28 2013录D E培养基的质量保证Miles-Misra法(定量方法)改进的平板划线法(半定量方法)平板接种观察法(定性方法)上述均为固体培养基测试方法,液体培养基定量和半

31、定量测试方法也要通过固体培养基菌落计数技术才能得到结果。培养基的质量保证对不含指示剂或选择剂的培养基 ， 只需采用一株阳性菌株进行测试 ； 对含有指示剂或选择剂的培养基或试剂 ， 应使用能证明其指示作用或选择作用的菌株进行试验 ； 复合培养基 （ 如需要加入 添加成分 的培养基 ） 需要以下四种菌株进行验证 ： 具有典型反应特性的生长良好的强阳性菌株 ； 弱阳性菌株 （ 对培养基中选择剂等试剂敏感性强的菌株 ）； 不具有该特性的阴性菌株； 部分或完全受抑制的菌株培养基的质量保证培养基的质量保证-非选择性培养基培养基的质量保证-非选择性培养基培养基的质量保证培养基的质量保证-非选择性培养基大肠埃希氏菌大肠埃希氏菌ATCC 25922 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌ATCC 6538ATCC 6538 枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌ATCC 6633ATCC 6633 培养基的质量保证-选择性固体计数和分离培养基培养基的质量保证培养基的质量保证-选择性固体计数和分离培养基副溶血性弧菌副溶血性弧菌ATCC 17802ATCC 17802 大肠埃希氏菌大肠埃希氏菌ATCC 25922