蛋白质与酶工程及应用技术理论课教学大纲-邓辉

1、教 学 大 纲JIAOXUEDAGANG蛋白质与酶工程及应用技术皖西学院生物与制药工程学院现代生物学教研室 邓辉2011年7月编 写 说 明蛋白质与酶工程是将酶学理论与工程技术相结合，研究酶的研发改造、生产应用的一门新兴学科。在研究内容、手段和目的上与基因工程、蛋白质工程、细胞工程、发酵工程等孪生学科是相互交融的整体。其主要内容有酶学基础、酶的生产、酶的分离纯化、固定化酶及固定化细胞、酶的修饰、酶反应器、酶的非水相催化、模拟酶、抗体酶、核酶、酶的应用。通过本课程的学习，对蛋白质与酶工程有一个比较全面的了解和掌握，为今后从事生物化学或酶学、酶工程的教学与研究，乃至整个生命科学的研究打下基础，扩大

2、知识面，拓宽相关的科学研究领域进行必要的知识储备。掌握基本概念和基本理论，酶学和酶工程研究中重要的设计思想、方法和应用，酶与酶工程在医学、工农业、畜牧业中的应用等，未来在酶学与酶工程领域中的研究方向、进展和热点。适应今后酶工程将引起的发酵工业和化学合成工业的巨大变革。要求学生按照大纲，突出重点，把酶学的基础理论知识，酶工程的理论知识和广泛的应用基础结合起来进行学习。了解和掌握蛋白质与酶工程理论、研究方法与应用，有所发现，有所创造。本大纲共有八章内容，适用于生物工程、食品科学与工程、制药工程的本科学生，由现代生物学教研室邓辉编写，集体讨论待定。大纲编修时间：2011年7月课时分配表章节名称课时数

3、第1章绪论4第2章酶的分离工程8第3章固定化酶与固定化细胞5第4章化学酶工程5第5章酶的非水相催化4第6章生物酶工程6第7章酶反应器6第8章研究的方向、进展和热点1合计40第一章 绪论【教学目的与要求】通过本章的学习使学生了解和掌握蛋白质与酶工程的定义、特点及蛋白质与酶工程的应用。了解蛋白质与酶工程的发展史及发展前景。【教学重点与难点】蛋白质与酶工程、催化剂的定义、特点；生物反应过程的特点及组成部分；蛋白质与酶工程的应用。【教学方法】讲授与CAI课件、幻灯胶片等直观教学手段相结合。【教学时数】4学时【教学内容】第一节蛋白质与酶工程的定义和特点（一）定义酶工程从应用目的出发研究酶，在一定的生物反

4、应装置中利用酶的催化性质，将相应原料转化成有用的物质。是酶学和工程学相互渗透结合形成的一门新的技术科学，是酶学、微生物学的基本原理与化学工程有机结合而产生的边缘科学。蛋白质工程是以创造性能更适用的蛋白质分子为目的，以结构生物学与生物信息学为基础，以基因重组技术为主要手段，对天然蛋白质分子的设计和改造。分子酶学工程是酶工程在分子水平上的体现，既不同于酶工程，也不能简单地理解为蛋白质工程在酶学方面的应用。 技术支柱是化学工程、基因工程、蛋白质工程（包括分子进化）和酶工程重点:酶工程研究方法;热点;定义。（二）、蛋白质与酶工程的特点：1、生物技术的多学科性2、生物催化剂的特性生物催化剂的定义：是游离

5、或固定化的细胞或酶的总称。重点生物催化剂的种类：优点：具有能使反应物在常温、常压下反应；反应速率大催化作用专一缺点：1）易受热、受某些化学物质及杂菌的破坏而失活；2）稳定性差；3）温度、pH等参数对反应相当敏感；4）活细胞还存在着个体差异、遗传性变异等生物学特有的问题，对营养、微量元素、渗透压等也有一定的要求。第二节蛋白质与酶工程的发展简史第三节蛋白质与酶工程的应用（一）食品工业中的应用（二）在医药工业中的应用(三）在饲料、轻纺、化工、环保领域的应用(四）分析试剂（五）开发新能源导入新课：发放往届学生期末考试试卷，摸底知识基础，促发兴趣。承前启后：酶的特点【思考题】1.生物催化剂有何特点，与化

6、学催化剂比较有何优缺点？2.为何称蛋白质与酶工程是多学科性、综合性的科学技术？3.蛋白质与酶工程的研究内容与方法？4.蛋白质与酶工程主要应用在那些领域？5.蛋白质与酶工程的发展趋势。6. 蛋白质与酶工程的发展经历了哪几个阶段?各有何特点?【教学效果追记】追溯历史，重走科学发展历程。学习科学思维方法。课堂提问承先启后的问题，激发对本课程的兴趣，同时活跃课堂气氛。【预习】酶的发酵工程第二章 酶的分离工程【教学目的与要求】能根据待分离酶的性质、成本等确定分离工艺流程；掌握酶分离纯化的一般原则、方法及其原理；掌握酶纯度的检验方法。【教学重点与难点】亲和层析的原理、方法；SDS-PAGE原理、方法；膜分

7、离的种类、原理及应用。【教学方法】讲授与CAI课件、幻灯胶片等直观教学手段相结合。【教学时数】5学时【教学内容】第一节 酶分离纯化的一般原则一、酶分离纯化方法的选择:目前酶的分离纯化方法都是根据酶与杂蛋白的性质差异而建立的。在选择分离纯化方法时，要考虑以下几个方面：首先对待纯化的酶的理化性质有比较全面的了解；以酶活力和比活力为标准，判断所选择的方法是否得当；严格控制操作条件，防止酶的变性失活。二、建立一个可靠和快速的测活方法酶的活力单位（U，activity unit）酶单位，国际单位 IU ，Kat单位。Kat与IU的换算关系如下：1Kat=60106IU1IU=1Kat/60= 16.7n

8、Kat.酶的比活力specific activity：每mg蛋白质所含的酶活力单位数表示，对同一种酶来说，比活力愈大，表示酶的纯度愈高。比活力=活力U/mg蛋白=总活力U/总蛋白mg三、酶活力的测定方法分光光度法spectrophotometry酶偶联分析法enzyme coupling assay荧光法fluorometry同位素测定法isotope method电化学法electrochemical methodpH测定法第二节 细胞的破碎及酶的提取一生物材料的破碎（一）机械破碎法（二）物理破碎法1温度差破碎法2压力差破碎法3超声波法：（三）化学破碎法（四）酶促破碎法二酶液的提取1典型的提

9、取液的组成2提取液各组分的作用（1）离子强度调节剂与缓冲（2）温度调节剂（3）蛋白酶抑制剂（4）抗氧化剂（5）重金属螯合剂（6）增溶剂（去垢剂）3酶的提取方法大多数酶蛋白是属于球蛋白，因此，可用稀盐，稀碱或稀酸的水溶液进行抽提；抽提液的具体组成和抽提条件的选择取决于酶得 7溶解性 、稳定性以及有利于切断酶与其它物质的连结。（1）盐溶液提取（盐溶）（2）酸溶液提取（3）碱溶液提取（4）有机溶剂提取第三节 酶的纯化(一)调节溶解度（二）改变pH值（等电点沉淀法）（三）改变温度（四）有机溶剂沉淀法（五）复合沉淀法二根据酶分子大小、形状不同的分离方法（一）离心分离差速离心速率区带离心等密度梯度离心（二

10、）凝胶过滤：（三）过滤与膜分离（一）离子交换层析三根据酶分子电荷性质的方法（二）电泳（三）等电点聚焦电泳利用两性电解质在直流电场中形成一个连续的pH梯度，样品中各种蛋白质在各自的等电点在相应的pH区段聚集而达到分离的目的。四根据专一性结合的方法（一）亲和层析的核心是亲和吸附剂，它是由固相载体和能与目的酶专一可逆结合的配体共价结合而成的。将亲和吸附剂填充层析柱，让酶液流过层析柱，则目的酶就能迅速而选择性地吸附在亲和吸附剂上，用适当的溶液进行洗涤，除去一些非专一性的杂蛋白后，再用浓度高的或亲和力更强的配体溶液进行亲和洗脱目的酶便可被洗脱出来。（二）吸附层析（三）共价层析五萃取分离:利用两物质在两相

11、中溶解度不同而使其分离的技术。双水相系统萃取法双水相亲和萃取超临界萃取六酶的结晶结晶：溶质以晶体形式从溶液中析出的过程。结晶既是酶是否纯净的标志（只有同类分子才能形成晶体），也是一种酶和杂蛋白分离的方法。1盐析结晶法采用一些中性盐如硫酸铵等，慢慢增加盐浓度至浑浊为止，然后静置，进行结晶。2、有机溶剂结晶法在含有少量无机盐和适宜pH条件下，在冰浴中缓慢加入有机溶剂（如乙醇，丙酮等），并不断搅拌，到出现微浑浊时静置数小时。3、透析平衡结晶法:把浓缩酶液装入透析袋，用一定浓度的盐溶液或有机溶剂或一定pH的缓冲溶液进行透析。酶液达到过饱和态而析出晶体.4、等电点结晶法:通过缓慢改变酶液的pH值，使之逐

12、步达到酶的等电点，而使酶析出结晶。5温度差法结晶6金属离子复合结晶法第四节 酶纯度的检验一超速离心法二电泳(一)PAGE的优点（二）聚丙烯酰胺凝胶的聚合SDS-PAGE三免疫技术（一）免疫扩散（二）免疫电泳四恒溶度法一浓缩：通过加热或减压方法使溶液中部分溶剂（在60OC以下）汽化蒸发。二干燥：1、真空干燥一边抽真空，一边加热，去除水分（或其它溶剂）2、冷冻干燥酶液冻结成固态，低温抽真空使冰升华而使酶干燥。3、喷雾干燥酶液直径为几十微米的雾滴，分散于热气流中，水分蒸发，酶成粉状。4、气流干燥常压力利用热空气流（温度不能太高）直接与固态状酶接触，蒸发水分。5、吸附干燥密闭容器中用各种干燥剂（无水氯

13、化钙、硅胶等）吸附水分或其它溶剂。【作业题】1.根据酶生物合成的模式及产酶动力学，设计发酵工艺条件，提出提高产酶量的措施，请举例说明。2.说明为什么酶的分离纯化每步均要检测总蛋白、总活力、比活力、纯化倍数、回收率，总个流程中他们变化趋势如何？他们能代表纯化的目标（纯度、数量、速度、收率）吗？为什么？3.比较吸附层析、疏水层析、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析 在原理、操作(装柱、过柱）及应用方面的异同点。4.比较说明用于酶层析分离的层析介质应该具有的共性和个性：它们是吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析、亲和层析。5. 用于表明酶纯度的是哪种电泳？用于制备的是哪种电泳？原理？6.等密度梯

14、度离心、层析聚焦与等电聚焦电泳有何异同？7.离子交换纤维素 为什么较离子交换树脂更常用于酶等大分子物质的分离？【教学效果追记】引入实例，创造问题意境，从而激发学生的兴趣。讲解KISS原则，使学生了解实际生产过程与科研的原则区别。在老师的引导下，培养学生对所学知识的综合分析能力、理解能力。【预习】酶与细胞固定化第三章 固定化酶与固定化细胞【教学目的与要求】掌握酶与细胞固定化的原理、方法与应用。能自行设计并完成这部分的试验。【教学重点与难点】微囊制备方法。复合固定化方法的设计。为什么固定化后酶稳定性提高、活性下降。为什么固定化酶属于修饰酶。【教学方法】理论与实验相结合。【教学时数】5学时【教学内容

15、】第一节 酶的固定化一定义二固定化酶的优缺点：优点：1. 易于将酶与底物及产物分离，因而产物相对容易提纯；2. 酶能够重复利用，使用效率提高，成本低；3. 大多数情况下可以提高酶的稳定性；4. 可以增加产物的收率，提高产物质量；5. 有利于实现管道化、连续化以及自动化操作，易于与各种分离手段联用。缺点6. 但由于固定化酶是通过反应而被结合在载体上，固定化过程中酶的活力难免有一定损失；7. 而底物则要求是水溶性的，这样才能够接触酶而发生反应；8. 也不适宜于需要辅助因子的反应。三固定化酶的制备原则四酶的固定化方法（一）非共价结合法(吸附法)通常有物理吸附、离子吸附及螯合或金属结合法。吸附法是通过

16、载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法。常用的载体如淀粉、谷蛋白等有机类载体，活性炭、多孔玻璃、硅胶等无机类载体，大孔型的合成树脂，陶瓷以及纤维素衍生物类。阴、阳离子交换剂. 离子交换剂的吸附容量一般大于物理吸附剂。(二）化学结合法: 交联法和肽键键合法氨基：赖氨酸的氨基和多肽链的末端氨基；羧基：天冬氨酸的羧基，谷氨酸的羧基和末端羧基；酚基：酪氨酸的酚环；巯基：半胱氨酸、蛋氨酸的巯基；羟基：丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的羟基；咪唑基：组氨酸的咪唑基；吲哚基：色氨酸的吲哚基。交联法是利用双功能或多功能试剂在酶分子间、酶分子与惰性蛋白间或酶分子与载体间进行交联反应，把酶蛋白分子彼此交

17、叉连接起来，形成网络结构的固定化酶。（三）包埋法：将酶分子包埋在高聚物网格内的方法。包埋法是将游离酶包埋于格子或微胶囊内，格子的结构可以防止酶渗出到周围的培养基中，而底物分子仍能渗入格子内与酶接触。包埋类型可有：网格型、微囊型及脂质体液膜型。微囊制备方法：（1）界面沉淀法是一种简单的物理微囊化法，它是利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度较低而形成的皮膜将酶包埋。（2）界面聚合法是用化学手段制备微囊的方法。所得的微囊外观好，但不稳定，有些酶还会因在包埋过程中发生化学反应而失活。（3）表面活性剂乳化液膜包埋法是在水溶液中添加表面活性剂使之乳化形成液膜达到包埋目的的一种方法。（四）各种固定化方

18、法的比较方 法优 点缺 点吸附法制作条件温和、简便、成本低、载体再生、可反复使用结合力弱，对pH、离子强度、温度等因素敏感，酶易脱落，酶的装载容量较小共价法载体与偶联方法可选择性大；酶的结合力强，非常稳定偶联条件激烈，易引起酶失活；成本高，某些偶联试剂有一定毒性交联法可用的交联试剂多，技术简易，酶的结合力强，稳定性高交联条件激烈，机械性能差包埋法包埋材料、包埋方法可选余地大，固定化酶的使用面广，包埋条件温和仅可用于低分子量的底物，不适用于柱系统，常有扩散限制问题酶的固定化与载体的选择注意事项：1.必须注意维持酶的催化活性和专一性2.酶与载体结合牢固3.载体的机械强度4.固定化酶要有最小的空间位

19、阻5.载体稳定，不可与底物、产物发生反应6.固定化酶要廉价五固定化酶的性质改变1.对底物的特异性。尤其注意立体结构对催化底物特异性的影响。2. 酶反应最适PH值的改变。酶固定化后，酶蛋白质的电子状态会发生改变，载体表面的电位要受影响。但有规律，可调整固定化方法，获得最适合的反应条件。3. 动力学常数的改变。米氏常数和最大反应速度会改变。4. 酶反应温度的改变。5. 增加酶的稳定性。对热、PH值、有机溶媒、蛋白质变性剂、蛋白质分解酶的稳定性增加。连续化反应稳定性好。固定化酶的最大好处。第二节 辅酶的固定化:一般采用载体共价偶联法第三节 细胞的固定化一概述固定化细胞是指直接将细胞固定在水不溶性载体

20、上，在一定的空间范围内进行生命活动（生长、繁殖和新陈代谢）的细胞。固定化细胞的优点：1、可增殖，细胞密度大，可获得高度密集而体积小的生产菌集合体。2、发酵稳定性好，可以较长时间反复使用或连续使用。3、发酵液中含菌体较少，有利于产品分离纯化。4、有利于需要辅酶和多酶系统才能进行的反应。二固定化细胞的分类：按细胞类型有微生物、植物、动物细胞。按其生理状态：固定化死细胞和生长细胞，介于两者之间的是固定化静止细胞和饥饿细胞。三固定化细胞的制备：同固定化酶。四固定化细胞技术今后发展的重要方向基因工程菌的固定固定化后酶稳定性提高稳定性提高的原因：固定化后的酶与载体多点连接，可防止酶分子伸展变形。酶活力的缓

21、慢释放。反应开始只有部分酶起作用，其余部分仅在开始起作用的酶变性后才起作用。抑制自降解，提高了酶稳定性。第四节 原生质体的固定化一固定化细胞在实际应用中的缺陷二固定化原生质体的制备【思考题】1固定化酶属于修饰酶吗？2固定化酶活力、稳定性、专一性等特性发生了哪些改变？为什么？3 影响固定化酶动力学特征的因素有哪些？4影响酶促反应的速率有哪几个因素？5 固定化酶的实际反应速率不同于固有速率？原因何在？6针对目前的研究现状，你认为可以从哪些角度来深入固定化酶技术的研究？请说明其理由。7、试述固定化生物催化剂的应用。8、固定化酶活力的测定方法有哪些？简要叙述每种方法。【教学效果追记】将理论课与试验课相

22、结合，进行设计性试验，自行设计，写出预试验报告，教师把关试验的技术性、综合性、科学性。纠正先入为主的固定化必有载体的概念，较难，老师讲课要比较多家尤其是权威之言。进行诊断教学、准确预测学生听课中的“心结”或“扣”的位置，以及在何处产生歧义等。【预习】化学酶工程第四章 化学酶工程【教学目的与要求】 了解为什么要对酶进行修饰，化学修饰的优缺点，掌握好化学修饰的基团、对应的方法。了解模拟酶的理论基础超分子化学基础；掌握五类模拟酶的基础知识：环糊精模拟酶、大环聚醚模拟酶、杯芳烃模拟酶、金属模拟酶、肽酶。【教学重点与难点】1、酶化学修饰的目的；2、酶化学修饰的原理；3、主客体化学、超分子化学、超分子4、

23、明了未来在蛋白质与酶工程领域中的研究方向、进展和热点。，【教学方法】讲授与CAI课件、幻灯胶片等直观教学手段相结合。【教学时数】4学时【教学内容】第一节 概述一酶的分子工程二具体内容第二节 酶分子的化学修饰一酶化学修饰的目的1.稳定性不够，不能适应大量生产的需要。2作用的最适条件不符。3酶的主要动力学性质的不适应。4临床应用的特殊要求。二、酶化学修饰的基本原理:1.如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性2.如何保护酶活性部位与抗抑制剂3.如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶4.如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境三影响酶蛋白化学修饰反应的因素1修饰剂的要求:修饰剂的分子量及链的长度（要求有较大的

24、分子量）;修饰剂上反应基团的数目及位置（要求有较多的反应活性基团）;修饰剂上反应基团的活化方法与条件。2 酶性质的了解3 反应条件的选择:反应体系中酶与修饰剂的分子比例。 反应体系的溶剂性质，盐浓度和pH条件。 反应温度及时间。4 酶修饰方法 酶分子侧链基团的化学修饰;有机大分子对酶的化学修饰;蛋白质类及其他对酶的化学修饰。（1）蛋白质功能基的反应性（2）修饰剂的反应性四酶化学修饰的设计1 修饰剂的分子量、修饰剂链的长度对蛋白质的吸附性。2 修饰剂上反应基团的数目及位置。3 修饰剂上反应基团的活化方法与条件。（一）对酶性质的了解1 酶活性部位情况2 酶的稳定条件、酶反应最适条件3 酶分子侧链基

25、团的化学性质及反应活泼性等（二）修饰试剂的选择五修饰程度和修饰部位的测定（一）分析方法1直接法2间接法（二）化学修饰数据的分析1化学修饰的时间进程分析2确定必需基团的性质和数目六酶蛋白侧链的修饰:巯基的化学修饰;氨基的化学修饰;羧基的化学修饰;咪唑基的化学修饰;胍基的化学修饰;二硫键的化学修饰。七酶的化学交联：用某些双功能试剂(如戊二醛)能使酶分子间或分子内不同肽链部分共价交联，发生交联反应而改变酶的活性或稳定性。例如将人-半乳糖苷酶A经交联反应修饰后，其酶活性比天然酶稳定，对热变性与蛋白质水解的稳定性也明显增加。若将两种大小、电荷和生物功能不同的药用酶交联在一起，则有可能在体内将这两种酶同时

26、输送到同一部位，提高药效。八.金属离子置换修饰:改变酶分子中所含的金属离子，使酶的特性和功能发生改变的方法。九.酶分子内部修饰（一）蛋白主链修饰（肽链有限水解修饰）蛋白主链修饰采用酶法（用专一性较强的蛋白酶或肽酶为修饰剂）。十蛋白质化学修饰的局限性第三节十一杂合酶来自不同酶分子中的结构单元或是整个酶分子进行组合或交换，以产生具有所需性质的优化酶杂合体。第三节 抗体酶一、抗体与酶的异同：相同点：都是蛋白质，都有特异性。不同点：1）抗体无催化活力，酶有催化活力。2）本质差别：酶是能与反应过渡态选择结合的催化物质，抗体是和基态紧密结合的物质。3）酶的活性和合成受到代谢调节，种类有限。抗体只有在抗原存

27、在时才产生，种类无限。二、酶与底物形成过渡态理论抗体酶的定义：催化抗体（catalytic antibody），是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物，本质上是一类具有催化活力的免疫球蛋白，在其可变区赋予了酶的属性。抗体酶的制备：1、诱导法：用设计好的半抗原，通过与载体蛋白（如牛血清白蛋白）偶联制成抗原。然后对动物进行免疫，取免疫动物的脾细胞与骨髓瘤细胞杂交，杂交细胞则分泌单克隆抗体，经筛选和纯化，得抗体酶。2、拷贝法：用酶作为抗原免疫动物得到抗酶的抗体，再将此抗体免疫动物并进行单克隆化，获得单克隆的抗抗体。对抗抗体进行筛选，获得具有原来酶活性的抗体酶。第四节模拟酶一模拟酶的概念，

28、模拟酶的生物催化功能，用化学半合成法或化学全合成法合成了人工酶(artificial enzyme)催化剂。二模拟酶的理论基础1.模拟酶的金属辅基2.模拟酶的活性功能基3.模拟酶的高分子作用方式4.模拟酶与底物的作用酶分子具有一定的空间构型，它与被催化的底物的作用在构型上有较严格的匹配关系，体现了酶的专一性。为了模拟酶的结合功能，近年来人们合成了许多冠醚化合物来模拟酶。随着冠醚空穴尺寸的不同，其对底物的选择性也不一样。 5.模拟酶的性状（一）酶学基础（二）超分子化学1主客体化学(host-guest chemistry)：主体和客体在结合部位的空间及电子排列的互补。2超分子化学（supramo

29、lecular chemistry）超分子：该分子形成源于底物和受体的结合，这种结合基于非共价键相互作用，当接受体与络合离子或分子结合形成稳定的，具有稳定结构和性质的实体，形成超分子。功能：分子识别、催化、选择性输出三模拟酶的设计设计前：酶活性中心-底物复合物的结构酶的专一性及其同底物结合方式的能力反应的动力学及各中间物的知识设计中：为底物提供良好的微环境催化基团必须相对于结合点尽可能同底物的功能团相接近应具有足够的水溶性，并在接近生理条件下保持其催化活性四模拟酶的分类单纯酶模型：化学方法通过天然酶活性的模拟来重建和改造酶活性机理酶模型：通过对酶作用机制诸如识别、结合和过渡态稳定化的认识，来指

30、导酶模型的设计和合成单纯合成的酶样化合物：化学合成的具有酶样催化活性的简单分子主-客体酶模型按照模拟酶的属性:胶束酶模型;肽酶;抗体酶;分子印迹酶模型;半合成酶五主-客体酶模型六胶束酶模型七肽酶八半合成酶九印迹酶（一）分子印迹技术.分子印迹概念：制备对某一化合物具有选择性的聚合物的过程.（二）分子印迹酶:通过分子印迹技术可以产生类似于酶的活性中心的空腔，对底物产生有效的结合作用，并可以在结合部位的空腔内诱导产生催化基团，并与底物定向排列。性质：遵循米氏方程，催化活力依赖反应速度常数。【思考题】1.什么是酶分子的化学修饰？它包括什么内容？作用于酶分子的修饰和对一般蛋白质的修饰其目的有何不同？2.

31、酶分子的化学修饰的基本原理有哪些？如何理解化学修饰与酶的结构与功能的关系？3.哪些蛋白质侧链基团可以修饰？用来修饰的主要试剂是什么？修饰反应的类型有哪些？4.什么是大分子结合修饰?参与修饰的大分子有哪些？修饰后有什么用途？5.试分析酶分子的化学修饰发展趋势。6.酶的蛋白质工程的含义是什么？为什么要进行酶的蛋白质工程？7.酶活性中心的特点及主要化学基团。8. 研究酶活性中心的方法及差别标记与亲和标记的区别与特点。9. 酶化学修饰的目的是什么？常用的大分子修饰剂有哪些，修饰后的用途及原理。10. 总结消除酶的抗原性的方法，比较各自原理的不同并举例说明。11. 酶的蛋白质工程、酶分子化学修饰、酶的固

32、定化在目的方法上的异同点。12. 提高酶稳定性普遍使用的方法有哪些？举例说明实际应用。13. 蛋白质的功能的基础是什么？分析蛋白质的结构的手段有哪些？14. 蛋白质工程的常见方法有哪些？ 它们分别适用于那些场合？15. 举出本书以外的三个例子说明酶的蛋白质工程的实际应用。【教学效果追记】将各科知识作为本课程建构的骨架，先复习、回忆，启发学生进入最近发展区，从而建立起新的知识结构。以生物细胞膜比喻讲解反胶团，印象较深。先学后教，学生讲酶的蛋白质工程、化学修饰部分，积极性高，讲课同学收获较大。通过案例分析和讨论，构建 “学生自学、集体讨论、教师点评”三位一体的教学模式。【预习】酶的非水相催化第五章

33、 酶的非水相催化【教学目的与要求】掌握酶非水相催化的应用、影响因素。能设计酶非水相催化的工艺。【教学重点与难点】非水相介质中酶性质的改变原理，为什么酶能在非水相中反应。【教学方法】讲授与CAI课件、幻灯胶片等直观教学手段相结合。【教学时数】4学时【教学内容】第一节酶非水相催化的研究概况(一)非水介质中的酶催化反应具有以下优点：（1）提高有机底物的溶解度；（2）酶的热稳定性显著提高；（3）使某些反应的热力学平衡向合成的方向移动（如酯键与肽键的形成等）；（4）抑制了水参加的副反应（如肽水解等）；（5）产物易于分离纯化；（6）酶不溶于有机溶剂，易于回收再利用；（7）防止微生物的污染等。第二节 有机介

34、质中酶催化反应的影响因素一、水对酶分子空间构象的影响酶分子需要一层水化层，以维持其完整的空间构象。维持酶分子完整的空间构象所必需的最低水量称为必需水。二、水对酶催化反应速度的影响在催化反应速度达到最大时的水含量称为最适水含量。三、在有机介质体系中，结合水是影响酶催化活性的关键因素。不同的酶有不同的最佳水活度。四、有机溶剂对酶结构与功能的影响在有机溶剂中，某些酶的空间结构会受到破坏，因此酶在有机溶剂中进行催化反应，通常要将酶在加有保护剂的情况下进行冷冻干燥。五、有机溶剂对酶活性的影响极性较强有机溶剂，会夺取酶分子的结合水，影响酶分子微环境的水化层，从而降低酶的催化活性，甚至引起变性失活。极性系数

35、lgP2的极性溶剂一般不适宜作为有机介质酶催化溶剂使用。六、有机溶剂对底物和产物分配的影响有机溶剂能改变酶分子必需水层中底物和产物的浓度。若有机溶剂极性小，则疏水性底物在其中溶解度大，浓度高，但难于从有机溶剂中进入必需水层，与酶分子活性中心结合的底物浓度因此较低，酶的催化速度低。反之，则疏水水性底物溶解度低，也会使催化速度减慢。一般选用2 lgP 5的有机 溶剂作为有机介质为宜。（1）有机溶剂对酶分子表面结构的影响（2）有机溶剂对酶活性中心结合位点的影响第三节 酶在有机介质中的催化特性（一）底物专一性：在极性较强的有机溶剂中，疏水性较强的底物容易反应；而在极性较弱的有机溶剂中，疏水性较弱的底物

36、容易反应。（二）对映体选择性K LD = （kcat/Km ）L/（kcat/Km ）D立体选择系数越大，表明酶催化的对映体选择性越强。一般，酶在水溶液中催化的立体选择性较强。（三）区域选择性: 即酶能够选择底物分子中某一区域的基团优先进行反应。区域选择性的强弱可以用区域选择系数K rs的大小来衡量。(四) 键选择性:即在同一个底物分子中有2种以上的化学键都可与酶反应时，酶对其中一种化学键优先反应。与酶的来源和有机介质的种类有关。(五)稳定性: 热与储存稳定性均提高。（六） pH记忆和分子印迹特性pH记忆：有机溶剂中的酶能够保持它冷冻干燥前或吸附到载体上之前所在缓冲液中的pH时的状态。应用：控

37、制有机相中酶催化的最适pH酶在冻干前可用配体作印迹。竞争性抑制剂，可诱导酶活性中心构象发生变化，而此种构象在除去抑制剂后，因酶在有机介质中的高度刚性而得到保持。(七)反应平衡：有机介质能改变某些酶催化的反应平衡。第四节 有机介质中酶催化反应的条件及控制目前有机介质中酶催化反应研究所涉及的酶类主要有脂肪酶、过氧化物酶、漆酶、酯酶、脱氢酶、蛋白水解酶 (胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶) 等。有机介质中酶催化反应在多肽合成、聚合物合成、药物合成以及立体异构体拆分等方面显示出广阔的应用前景第五节 有机介质中酶催化的应用。（一）手性药物的拆分（二）手性高分子聚合物的制备1、可生物降解的聚酯的合成2、糖酯的合成

38、（三）酚树脂的合成（四）导电有机聚合物的合成辣根过氧化物酶可以在与水混溶的有机介质（如：丙酮、乙醇、二氧六环等）中，催化苯胺聚合生成聚苯胺。（五）发光有机聚合物的合成辣根过氧化物酶在有机介质中可以催化对苯基苯酚合成聚对苯基苯酚，将这种聚合物制成二极管，可以发出蓝光，是一种具有良好前景的蓝光发射材料。（六）食品添加剂的生产1、利用脂肪酶或的酯酶催化作用生成所需的酯类。利用脂肪酶 在有机介质中的转酯反应，将甘油三酯转化为具有特殊风味的可可脂；利用酯酶催化小分子醇和有机酸合成具有各种香型的酯类。2、利用嗜热菌蛋白酶生产天苯肽3、利用芳香醛脱氢酶生产香兰素（七）生物柴油的生产：在有机介质中，脂肪酶可以

39、催化油脂与小分子醇类的酯交换反应，生成和苏分子的酯类混合物。（八）多肽的合成（九）甾体转化【思考题】1. 何为非水相？常见非水相酶促反应体系有哪些？非水相中酶的特性和酶促反应的特点是什么？2. 什么是必需水和水活度？水是如何影响非水相中酶的特性？3. 为什么在非水相中仍然可以保持酶催化活性和稳定性？4. 分析logP与酶活性之间的关系。5. 酶促反应非水介质主要包括哪些反应系统？其中最常用的是哪一种？6. 酶在非水介质中的催化反应有什么优点？7. 非水介质中酶催化反应的特征是什么？8. 有机溶剂中如何调节酶的催化活性和选择性？9. 非水相中常用的酶和反应类型有哪些？10. 非水相酶促催化在工业

40、上重要的应用有哪些？【教学效果追记】作为酶工程领域最热门的非水相催化，有许多待研究与开发之处，把最新期刊的内容引入课堂，学生自己想出来的结论印象深，有成就感。运用生产实际问题及学科疑点激发思维。先拓宽自身知识面，触类旁通，用相关图片辅助说明，将抽象难懂的内容形象化，采用通俗易懂的事例映射晦涩的知识，辅助学生对知识的理解。【预习】酶反应器第六章 生物酶工程【教学目的与要求】掌握酶非水相催化的应用、影响因素。能设计酶非水相催化的工艺。【教学重点与难点】非水相介质中酶性质的改变原理，为什么酶能在非水相中反应。【教学方法】讲授与CAI课件、幻灯胶片等直观教学手段相结合。【教学时数】2学时【教学内容】第

41、一节 概述一、酶的蛋白质工程的目标二、酶的蛋白质工程的流程三、酶的蛋白质工程的前景第二节 酶的蛋白质工程的原理和方法一、蛋白质结构与功能的关系二、蛋白质结构的测定和预测三、基因突变、剪接和重组蛋白的表达第三节 酶分子的定向进化一、酶分子定向进化的基本原理二、酶分子定向进化的策略和方法第七章 酶反应器【教学目的与要求】掌握酶反应器的种类、设计原理，操作注意事项。【教学重点与难点】两种理想的酶反应器的比较。酶反应器与微生物反应器的异同。【教学方法】讲授与CAI课件、幻灯胶片等直观教学手段相结合。【教学时数】2学时【教学内容】第一节 概论一、定义: 用于酶进行催化反应的容器及其附属设备称为酶反应器。

42、酶反应器是用于完成酶促反应的核心装置。它为酶催化反应提供合适的场所和最佳的反应条件，以便在酶的催化下，使底物（原料）最大限度地转化成产物。它处于酶催化应过程的中心地位，是连接原料和产物的桥梁。二、生物反应器设计的主要目标：使产品的质量最高，生产成本最低。三、评价生物反应器的主要标准：反应器生产能力的大小和产品质量的高低。第二节 反应器的类型按结构区分搅拌罐式反应器（Stirred Tank Reactor, STR）鼓泡式反应器(bubble column reactor, BCR )填充床式反应器(packed column reactor, PCR )流化床式反应器( Fluidized

43、Bed Reactor, FBR)膜反应器(Membrane Reactor, MR)按操作方式区分分批式反应(batch )连续式反应(continuous )流加分批式反应(feeding batch )混合形式连续搅拌罐反应器（Continuous Stirred Tank Reactor, CSTR）分批搅拌罐反应器（Batch Stirred Tank Reactor, BSTR）第三节 酶反应器的选择一、影响酶反应器选择的因素很多，但一般可以从以下几个方面考虑：酶的形式(游离/固定化.)固定化酶的形状底物的物理性质酶反应动力学性质酶的稳定性操作要求反应器制造、控制成本二、酶反应器的

44、操作-酶反应器使用中应注意的问题1、 酶的稳定性对酶反应器的功效是很重要的。在操作过程中，有时需要用酸或碱来调节反应液PH。如果局部的pH过高或过低，就会引起酶的失活，或者使底物和产物发生水解反应。这时，可用加快搅拌已促使混合均匀。2、如果底物和产物在反应器中不够稳定的话，可以采用高浓度的酶，以减少底物和产物在反应器中的停留时间，从而减少损失。3、防止微生物 污染三、酶反应器操作中，生产能力逐渐降低，主要原因是固定化酶活性降低或损失。造成固定化酶活性损失的原因：（1）酶本身的失活；（2）酶从载体上脱落；（3）载体的破碎或溶解。第四节 酶反应器的设计一、设计目的：设计一个既能充分发挥生物反应的优

45、点，又可克服一些限制因素，以最低的生产成本，获得最高的产量和质量的酶反应器。二、.设计原理（依据）：(1) 底物的酶促反应动力学以及温度、压力、pH等操作参数对此特性的影响；(2) 反应器的形式和反应器内流体流动状态及传热特性；(3) 产物的产量和生产工艺流程。三、设计步骤：1、确定酶反应器的类型酶反应器的设计，首先要根据酶、底物和产物的性质，按照上一节所述的选择原则，选择并确定反应器的类型。2、确定反应器的制造材料由于酶催化反应具有条件温和的特点，通常都是在常温、常压、pH近乎中性的环境中进行反应，所以酶反应器的设计对制造材料没有什么特别要求，一般采用不锈钢制造反应容器即可。3、进行热量衡算

46、酶催化反应一般在3070的常温条件下进行，所以热量衡算并不复杂。温度的调节控制也较为简单，通常采用一定温度的热水通过夹套（或列管）加热或冷却方式，进行温度的调节控制，热量衡算是根据热水的温度和使用量计算。对于某些耐高温的酶，例如高温淀粉酶，可以采用喷射式反应器，热量衡算时，根据所使用的水蒸气热焓和用量进行计算。4、进行物料衡算酶反应动力学参数/底物用量/酶量/反应体积/反应器数量【思考题】1.酶反应器与发酵反应器的区别。2. 试比较各类酶反应器的优缺点。3.选择酶反应器时需考虑哪几方面的因素？4. 设计酶反应器时需考虑哪些操作参数？5. 酶反应器在使用过程中应注意哪些问题？如何防止酶反应器的微

47、生物污染？6. 常见的酶反应器有哪些类型？其基本特征是什么？7. 什么是连续式酶生化反应器，它包括哪两种理想模型？各有何特点？【教学效果追记】引入实物图片，弥补现场实习难的弊端。【预习】研究的方向、进展和热点、核酶第八章 研究的方向、进展和热点、核酶【教学目的与要求】通过本章的学习使学生了解和掌握蛋白质与酶工程的方向、进展和热点。掌握酶分子定向进化的原理、方法与优缺点。【教学重点与难点】核酶、抗体酶、模拟酶。重点：酶分子定向进化的实际意义。【教学方法】讲授与CAI课件、幻灯胶片等直观教学手段相结合。【教学时数】3学时【教学内容】第一节 生物酶工程定义：属于蛋白质的非合理设计，它不需要事先了解酶

48、的空间结构和催化机制，人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制（随机突变、基因重组和自然选择），在体外改造酶基因，并定向选择（或筛选）出所需性质的突变酶.（一）理论基础:人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制，在体外对基因进行随机突变，从一个或多个已经存在的亲本酶（天然的或者人为获得的）出发，经过基因的突变和重组，构建一个人工突变酶库，通过一定的筛选或选择方法最终获得预先期望的具有某些特性的进化酶。（二）基本原理：定向进化随机突变选择定向进化的实质是达尔文进化论在分子水平上的延伸和应用。定向进化是在体外模拟突变、重组和选择的自然进化，使进化朝着人们需要的方向发展。定向进化与自然进化的异同

49、点:两者的不同：1进化动力不同：保守突变, 非保守取代；2进化方向不同： 适应突变的积累；3进化速度不同： 非常漫长 只需几年、甚至几天；4进化目标不同： 适应环境 超越生物学意义的要求，探索所希望的蛋白质在顺序空间的可及性。第二节核酶一、剪接型核酶II型内含子锤头核酶二、剪切型核酶 发夹核酶自体催化丁型肝炎病毒（HDV)核酶RNaseP异体催化剪接型核酶的作用机制是通过既剪又接的方式除去内含子（Intron)剪切型核酶 这类RNA进行自身催化的反应是只切不接。三、核酶的应用1. 基础理论：生命起源的探索2. 医药：3. 植物抗病毒第三节杂交酶一、定义：指由来自两种或两种以上的酶的不同结构片段构建成的新酶。二、应用：改变酶的非催化特性;创造新活性的酶;研究蛋白质的结构和功能的关系等。【思考题】1. 人们为什么要开展对酶的人工模拟