蛋白表达解决方案

1、主要内容1，成功案例分享2，蛋白表达客户工作流程及存在的问题3，AJ 解决方案 德国耶拿公司德国耶拿公司Western Blot 整体解决方案整体解决方案样品制备样品制备 蛋白定量蛋白定量 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 匀浆器 垂直电泳、电泳电源 转膜转膜 膜封闭，一膜封闭，一/二抗体标记二抗体标记 显影检测显影检测湿法或半干转印 、电源 小型摇床 成像系统3Western 流程流程l蛋白样品的制备SDS-PAGE转膜封闭一抗杂交二抗杂交成像检测成像检测45 蛋白表达客户工作流程及存在的问题随着科研的深入，实验越来越难做高丰度的蛋白越来越少，低丰度蛋白越来也多多蛋白共同作用的研究越来越

2、多，比如蛋白磷酸化修饰研究向纵深方向开展，不仅要做体外检测，还要做在体实时检测6 蛋白表达客户工作流程及存在的问题蛋白表达的结果与基因表达不匹配不同的学生做出来的结果不一样，结果随机性大，不好重复 审稿人对蛋白表达结果有异议，不知道该如何提供证据7 蛋白表达客户工作流程及存在的问题耗时长，工作效率低原因原因 仪器灵敏度不够 没有选择正确的western 检测方法 没有按照正确的操作进行试验 没有使用最有效的转印方法8UVP Chemstudio系列系列超敏化学发光成像超敏化学发光成像可用于极地丰度蛋白表达的检测-60度科研冷CCD专用化学发光托盘4/3英寸超大芯片极高的物理像素高光通透性镜头B

3、ining功能宽泛的动态范围化学发光级暗箱810万物理像素数据可追溯 VisionWorks LS 软件 图像信息可以追踪溯源，任何修改都可以直接显示，确保分析结果的可信度如何选择合适的western blot检测方法？斯隆-凯瑟琳癌症中心主任Ushma S. Neill在担任 “临床调查研究杂志”评审期间曾连续拒绝了四篇本已接受并准备发表的来稿后明确指出，所有提交的western数据的建立必须是平等的，其中包括：1.1.所采用的检测方法定量范围是否所采用的检测方法定量范围是否可靠？可靠？2.2.实验者如何确定化学发光的曝光时间？实验者如何确定化学发光的曝光时间？3.3.是否有内参？内参是否可

4、靠？是否有内参？内参是否可靠？4.4.分析结果是否使用的是原始数据分析结果是否使用的是原始数据5.5.原始数据是否被人修改原始数据是否被人修改Source: Source: “All Data are not created Equal” Editorial by Ushma S. Neill, The Journal of Clinical Investigation Volume 119:424, 200912电泳胶和印迹电泳胶和印迹“For quantitative comparisons, appropriate reagents, controls and imaging metho

5、ds with linear signal ranges should be used.”“对于定量比较实验，应该使用适当的试剂、参比及线性范围内的成像方法。”- Nature 13Western Blot Workflow-Detection生成有色物质生成有色物质沉淀在膜上沉淀在膜上被检测被检测DAB显色法检测灵敏度低，不能有效的检测低丰度蛋白，且定量范围只有1.5OD更灵敏的检测方法：化学发光法DAB显色14化学发光检测的优势化学发光检测的优势 定量范围更广 高灵敏度（化学发光一般光强很弱）检测方法： 底片检测（传统的压片，显影，定影） CCD摄像头检测15Chemiluminescen

6、ce-Western Blot传统X光压片检测16Chemiluminescence-Western Blot无需外在激发光源，依靠自身发光，一般要求高灵敏度的冷CCD17为什么为什么 CCD技术优于底片成像？技术优于底片成像？CCD与光学强度具有真正的线性对应关系底片的反应是非线性的pg. SA-HRP CCD Counts Densitometric Counts (OD)CCD底片底片18 成像方式15s 曝光3D显示CCD 成像Film定量线性范围比较定量线性范围比较19CCD具有更宽的动力学线性范围(4.0 个数量级） 底片的动力学线性范围低（1.5 1.9 个数量级) CCD可进行

7、更精确的浓度比较 CCD无需多次曝光CCD系统 可提示过饱和反应 过饱和像素警示 底片无法警示过饱和区域-数据失真CCD 系统无需任何消耗品 无需底片及冲洗试剂 无需冲洗设备及暗室降低了输出成本 (热敏打印 vs. 底片)为什么为什么 CCD技术优于底片成像？技术优于底片成像？20化学发光化学发光 vs. X光片曝光光片曝光 X光片曝光化学发光所需材料胶片、暗室、显影液、定影液 只需一台成像仪线性范围窄，只有约1.8 O.D. 宽，超过4 O.D.灵敏度最灵敏的检测方法低至fg级最灵敏的检测方法低至fg级21CCD成像与胶片法对比成像与胶片法对比Film与传统的压片法对比ChemStudio系

8、列成像系统在相同曝光时间内能得到更宽的定量范围和更高的灵敏度CCDFilmIntensityIntensityConcentrationConcentration22化学发光成像的局限化学发光成像的局限 分子量大小非常接近的蛋白（磷酸化蛋白） 特点：特点：分子量非常接近，无法进行剪膜检测 传统操作方法：传统操作方法： 先检测第一个蛋白 将第一个目标蛋白的抗体剥离掉（巯基乙醇处理5-6个小时，且会将第二个目标蛋白洗掉一部分，影响检测结果的准确性） 检测第二个蛋白 方法缺陷：方法缺陷：检测步骤繁琐、巯基乙醇气味难以忍受、检测结果不准确 表达变化差异1042324荧光素化学发光，二抗由酶标记荧光，二

9、抗由荧光素标记荧光标记抗体的使用多色荧光多色荧光多重检测多重检测COX IVAlpha-TubulinRabbit anti-COX IVMouse anti-tubulinGoat anti-rabbitGoat anti-mouseCOX IVAlpha-Tubulin25凝胶制备凝胶制备电泳电泳电泳电泳抗体杂交抗体杂交成像检测成像检测目的蛋白抗体剥离目的蛋白抗体剥离需要将第一个目的蛋需要将第一个目的蛋白的抗体剥离掉，然白的抗体剥离掉，然后再进行第二个目的后再进行第二个目的蛋白的抗体杂交检测蛋白的抗体杂交检测5h分子量接近的多蛋白检测对比多色荧光法化学发光法26磷酸化蛋白检测磷酸化蛋白检测

10、27化学发光法无法准确区分和定量目的蛋白多色荧光法检测两个目的蛋白分开检测，再后续合并成一张图片不同蛋白之间无干扰准确区分和定量目的蛋白近红外成像更适合近红外成像更适合western blot成像成像近红外成像RGB可见荧光成像NC膜、PVDF膜在不同激发波长下的荧光背景NIR波长下膜的背景极低，更适合做western blot检测2829 近红外荧光相对于RGB荧光背景低，结果灵敏度更高，准确性更高，图片更漂亮，因此被广泛应用于western blot 多色荧光成像Western 检测的方法检测的方法 化学发光化学发光 压片法 灵敏度高，定量范围窄 CCD成像 灵敏度高，定量范围宽 多色荧光

11、多色荧光 定量准确、多重检测 RGB荧光 背景高 NIR荧光 背景低、定量准确 DAB显色显色 定量范围窄，灵敏度低30 化学发光（灵敏度） + 最优搭配 近红外多色荧光（宽线性范围，多重检测，持久信号）最优化方案最优化方案-两种方法结合使用两种方法结合使用31UVP Chemstudio全能成像超敏化学发光多色荧光近红外多色荧光在体实时检测的解决办法在体实时检测的解决办法活体成像活体成像33动物成像植物成像34在体实时检测在体实时检测氙灯光源：氙灯光源：可以为成像系统提供从紫外到近红外的全光谱激发光，即可作为顶置光源，亦可作为透射光源，无限扩展了仪器的荧光成像应用。氙灯光源提供更强的激发光，

12、提高检测灵敏度。应用举例：应用举例：RGB/NIR多色荧光成像、2D DIGE、小动物活体成像和植物成像。荧光光源介绍荧光光源介绍LED光源光源：波长固定不可改变，光强弱，无法进行小动物成像，无法提供透射光源激光光源激光光源：波长固定不可改变，光强太强，易造成荧光淬灭，背景高，无法同时提供顶置和透射光源35荧光光源介绍荧光光源介绍氙灯氙灯/卤素灯卤素灯LED激光激光光谱范围全光谱固定波长固定波长光强强弱最强Western成像满足满足满足小动物成像最优不支持背景太高应用拓展灵活拓展不可拓展不可拓展透射荧光支持不支持不支持36滤光片的选择滤光片的选择37AJ如何帮助客户如何提高实验效率？快速半干转印快速半干转印快速：15min-50min，湿转一般1.5h-过夜节省缓冲液、冷却