亚抑菌浓度抗生素对铜绿假单胞菌生物膜形成的影响

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。亚抑菌浓度抗生素对铜绿假单胞菌生物膜形成的影响亚抑菌浓度抗生素对铜绿假单胞菌生物膜形成的影响 青岛大学硕士学位论文亚抑菌浓度抗生素对铜绿假单胞菌生物膜形成的影响姓名：李俊娟申请学位级别：硕士专业：内科学（呼吸病学）指导教师：蒋捍东2011052644 亚抑菌浓度抗生素对铜绿假单胞菌生物膜形成的影响目的：研究四种抗生素在不同亚抑菌浓度下对铜绿假单胞菌生物膜形成的影环丙沙星和阿米卡星的诹街峙嘌芯和痩。静态造膜结果：在校婷顾嘏时能抑制生物膜的形成，而在浓度时促进生物膜的形成；在培养基中，阿奇霉素浓度为时均促进

2、铜绿假单胞茵生物膜形成。亚抑菌浓度的头孢他啶和环丙沙星在蚅嘌芯种粕锬纬桑话卓窃贛培养基中浓度为关键词：铜绿假单胞菌，生物膜，阿奇霉素，亚抑菌浓度 ， 琫 疘琧簆， 引言引言在人类感染疾病中有的非社区获得性感染与生物膜相关】。很多细菌如铜 材料和方法第一章论文菌株来源头孢他啶：葛兰素史克产品戊二醛虾硫代硫酸钠无水物本翘嘶邢薰无水氯化钙奇杞;邢薰硝酸银嘌粢嘶嫌邢拊鹑喂对苯二酚毡救呋喃酮细菌培养箱毡恒温摇床妫医用硅胶片钲谑辛V谖耙迪鹚芸萍加邢薰 青岛大学硕士学位论文先将菌种取出于固体培养平板划线，置于温箱内过夜培养，后挑取单菌落取菌液用酶标仪测值，稀释菌液至在孔内混匀后取出尤氲煸群笤偃转至第校来渭又

3、恋趖。先将菌种取出于固体培养平板上划线，置于温箱内过夜培养，后挑取单菌用灭菌水新配置四种抗生素，并加入到上述四个试管中，使得阿奇霉素、头孢他啶、环丙沙星及阿米卡星的终浓度均为。做好标记挑取单菌落接种子四个试管中，于恒温摇床中培养分别于，菌液测定值描绘细菌生长曲线微管静置造膜，绘制生物膜生长时间曲线离心管阄乱补培养用对菌液进行适当稀释； 材料和方法孔板静置造膜，绘制生物膜生长时间曲线将孔板倒扣于吸水纸上，将水分吸干；新配置四种抗生素，并于管中倍比稀释至一系列的亚抑菌浓度在孔板中第入已倍比稀释的抗生素好靠准尤。每列为一个亚抑菌浓度，每个浓度有鲋馗础贚蚆培养基中分别造膜。其中在加入阿奇霉素的铜绿假单

4、胞菌造膜中，另外测定阿奇霉素浓度为和试管内静态造膜 青岛大学硕士学位论文用灭菌水新配制阿奇霉素，在用双蒸水多次充分漂洗，去掉浮游菌。蒸馏水清洗蒸馏水清洗跛嵋芤悍从 蒸馏水漂洗蒸馏水漂洗 结果第二节结果环丙沙星及阿米卡星在两种培养基中一致，分别为痩及。生长曲线测定在培养基培养时，四种抗生素阿奇霉素、头孢他啶、环丙沙星和阿米乏至三兰麓麓微管生物膜生长曲线测定 青岛大学硕士学位论文微图疚狿装迳锬氖奔淝摺门嘌狹髓培养基。纵 时，阿奇霉素浓度为时的硅胶片生物膜形成最多，空白组居中，不同浓度的阿奇霉素对铜绿假单胞菌生物膜形成的影响：在嘌校婷顾嘏任、及时生物膜形成量少于空白对照组，与空白对照组比较差别有统计

5、学意义注：·表示与空白对照组比较， 青岛大学硕士学位论文物膜形成量多于空白对照组，差别有统计学意义，任，鏼跏对亚抑菌浓度的环丙沙星星对铜绿假单胞菌生物膜形成的影响：、时生物膜形成量均少于空白对照组，统计学意义，尺迪昙 虹巍蜼亚抑菌浓度的阿米卡星对生物膜形成的影响：时所形成的生物膜量明显少于空白对照组，与空白对照组比较差别有生物膜形成量明显多于空白对照组，差别有统计学意义釵迪昙 青岛大学硕士学位论文 讨论第三节讨论并且极易形成生物膜。在呼吸科，肺部结构病变的患者往往会伴有的感染，如肺，、支气管扩张及慢性阻塞性肺部疾病等患者往往存在铜绿假单胞菌的持续的慢性感染，常常可形成铜绿假单胞菌生物

6、膜。细菌生物膜是指在多聚糖、蛋白质和核酸等组成的基质内相互粘连粘附于物体表面的细菌群体。细菌生物膜一旦形成，固着态的耐药性将在原来浮游态的基础上增加数倍至数千倍，常规药敏试验敏感的药物可能已经耐药，导致感染难以清除。极易形成生物膜，这也是导致临床上抗茵治疗失败的重要原因之一。是近年来感染领域研究的热点，主要集中于其耐药机制的研究：如可产生抗生素灭活酶或抗生素修饰酶，如一内酰胺酶、氨基糖苷钝化酶等；改变抗菌药物作琇嘌信嘌钡腗值为痩。可见不同培养条件下浮游菌对 青岛大学硕士学位论文的形成，对于其机制尚不明确。膜结果亦提示亚抑菌浓度的阿奇霉素能促进生物膜的形成。亚抑菌浓度抗生素对细菌生物膜形成的调控

7、随抗生素种类、浓度、作用时间和菌种 讨论依据本实验条件，亚抑菌浓度的阿奇霉素能抑制浮游菌的生长，但是却促株生物膜的形成过程如下：发现菌株在左右即开始在玻片表面黏附聚集，在培养熳笥沂保皇浅醪叫纬缮锬天时基本具备生物膜三维结构，此后生物膜逐渐达到平衡状态。但在本实验在孔板、玻璃试管内及硅胶片静置造膜时，的阿奇霉素与空白对照组比较抑制了的胞外多糖的产生。故推断在本实验中培 青岛大学硕士学文论文对生物膜的促进作用，并非通过激活发挥主要作用的，这也是与众多研究在嘌信嘌保繁承桥任狹时均可以抑制生物膜 大，故本实验选用了倍比稀释的方法，这样就不可避免导致两个浓度间距太大。但是目前关于亚抑菌浓度头孢他啶和环丙

8、沙星对铜绿假单胞菌生物膜的影响研究并不且根据实验结果得出：亚抑菌浓度阿奇霉素促进生物膜的形成；而亚抑菌浓度的头孢他啶、环丙沙星及阿米卡星对生物膜的影响与浓度和培养基有密切的关系。对于亚抑菌浓度抗生素对铜绿假单胞菌生物膜的影响的机制尚不清楚，尤其是大环内酯类阿奇霉素所表现的促进生物膜形成的作用，本实验可以除系统引起的作用，对于其具体机制需要进一步探讨。 霉素的敏感性亦不同。件密切相关 附图空白图婷顾嘏任杞浩炷峁放大倍数醅二··二、：了一。懈。 青岛大学硕士学位论文、：冀。骸鬻蘩鎏、，“：鬻遂摹攀。：建摹琷茹裫鬻笺一 口痩痩 ： 甈琈琣甂瓸，瓵甆珺：·：珿甒；鳎瓸簃

9、；：铑龋炊嘌圆煌竿碳俚锬舾行缘挠跋靃山东医药，甴海痺產産痯狟琓： ·。 ，： 青岛大学硕士学位论文志，：成的动态观察谌酱笱：，：，甁琍觯琍 ，】，：；珻琍，琘琕 珺 ： 瓾珼 铜绿假单胞菌生物膜的治疗进展铜绿假单胞菌为一种机会性致病菌，它是院内感染四大条件致病菌之一，可引起呼吸道感染、败血症、骨髓炎、心内膜炎、牙髓炎及尿路感染等各种疾病。该菌耐药性较强，耐药机制复杂，并且极易形成生物膜。随着各种侵入性检查、体内人工留置物的广泛使用，如气管插管、中心静脉置管、导尿管、心内起搏器及人工关节等，铜绿假单胞菌的感染日趋增多，常常会引起生物膜相关感染。所谓生物膜是指附着在有生命或无生命的物体表

10、面的由细菌自身产生的多聚基少，可能已处于解聚阶段。阶段，发现有如下变异：一种为鞭毛和其他移形性变异，导致细菌不能很好的粘附于异物表面；另一种为突变体无法生成发样附属物一菌毛，使细菌只能在物质表面形成单层细菌而不能形成微生物菌落。这些都可能影响生物被膜形成的最初粘附阶段。细菌粘附到异物表面后同时会吸引周围同种细菌并增殖为有组织的小菌落。小菌落间相互传递化学信号分子嘲，即基因表达蛋白质等物质生成，在生长繁殖的同时分泌大量的胞外基质粘附单个细胞而形成微生物菌落，基质随着生物被膜的成熟而增加，主要成分包括胞外多糖、蛋白质、死细胞、磷脂等，其中以胞合成的基因在生物被膜形成的过程中上调，在生物膜菌和浮游菌

11、中有多达种不同 青岛大学硕士学位论文和表面扩散，具体调控机制目前尚不清楚。细菌一旦形成生物膜会造成耐药性显著增加，抗生素不易渗透，细菌表面抗原位点被覆盖等后果，继而表现为耐药和抗吞噬等特点。生物膜与浮游菌之间的区主要别在于：在生物膜内细菌密度高于浮游状态，导致生物膜内营养物质和氧气缺乏，同时代谢产物、废物和细菌分泌的一些因子的水平抗生素为阿奇霉素、红霉素、罗红霉素及克拉霉素等。理论上大环内酯类抗生素不一、体外实验中亚抑菌浓度大环内酯类药物对生物膜的影响的形成，其机制如下： 是通过抑制胞外的多糖来抑制生物膜的形成。粘液菌株胞外多糖是藻酸盐，而非粘液多糖较对照组减少了。萵蝴研究了从患者痰中分离的株

12、株粘液其粘附的抑制作用没有完全的相关性。因为阿奇霉素对非粘液菌株为种迫禾甯杏琎系统，减少信号分子的产生。 青岛大学硕士学位论文基因组成，编码猘卜加到一定的浓度，分别与和蛋白特异性结合并激活转录，从而调节一系列然虻谋泶锒偈沟缘鞍酌浮钚缘鞍酌浮舛舅谹等生成；察生物膜的形成。旌笠吧蚉可形成成较厚、有孔状通道的成熟生物膜结构，、基因缺陷型黏附、聚集形成明显稀薄的早期生物膜结构。可见基因缺陷可影响铜绿假单胞菌体外形成生物膜的能呈薄膜状，均显著吧薄于野生型菌株。这两个实验证明了群体感应系统在生物膜形厚于突变菌株，突变菌株生物膜厚度仅为野生型生物膜的，也证明了群体感应系统基因缺陷明显影响生物膜的分化成熟过程

13、。并且盯突变株形成的突变菌株在生物膜形成和对抗生素的敏感性方面与野生株存在明显差异。扰研究表明大环内酯类抗生素能抑制的系统，抑制信号感应分 发挥了的作用。患者中分离的在体外可以表达上述两种嘲，从患者痰中也可检测得到口副，对于的研究经历了一个不断认识的过程。一开始，萂叫研究了例，并且信号分子系统在患者铜绿的感染疾病中，对在生物膜内缺氧的环境中生存发挥了重要的作用矣蒀籋控制表达的鼠李糖脂在维持生物膜结构方面是必需的“射。以上这些发现都提示了在生物膜形成中的作用比之前想象的重要的多，主要是之前的研究所用的菌株为其生成的能力得到破坏，故而得出上述结论。游铣擅傅谋泶铮羌偕杩赡苁钦庑干倭康南碌骷纯梢缘贾虏

14、鶤大幅度 青岛大学硕士学位论文的两者生物膜形成无差别，故而得出的阿奇霉素没有杀灭成熟铜绿假单胞 总之，无论是体外还是体内试验，大环内酯类抗生素对抗铜绿假单胞菌有比较乐观的研究，但是众多试验也证明亚抑菌浓度大环内酯类药物婷顾对生物膜的影响，随着实验条件和所研究的菌株的不同而不同，随着亚抑菌浓度和作用时间的不同出现相反的结果。在这一领域很多方面都没达成共识，尤其是对于系统中各个因子之间的相互联系和作用需要进一步的探讨。需要研究的空间还很大：而且体外的环境与体内环境相差太大，需要进一步探索实验条件，为更好的研究在体内的治病机制提供条件。三、药物的联合应用治疗感染关于联合抗生物膜的研究中，不同药物联合

15、对生物膜的作用亦不同。其中过体外试验发现，罗红霉素可以抑铝多糖蛋白复合物合成，从而增强氟罗沙星渗透过细菌生物膜能力，对氟罗沙星杀灭细菌生物膜中的有增效作用。聂大平等删可减少细菌的粘附和被膜存活菌数：与环丙沙星，头孢他啶联合用药能增强其杀菌作的头孢他啶作用锊牧媳砻嫒杂邢妇婊睿陌卓亲饔等 青岛大学硕士学位论文对于联合治疗生物膜感染效果好于单药治疗，筛选系统，利用这种筛选系统他们发现了两种具有群体感应显著抑制作用的药物： 参考文献瓵琀甁：瓸，瓸：甗： 瓺牛珻 琕：琓，甂 ，： ， 青岛大学硕士学位论文甌。 ，珿，瓽珼琣瓵瓹，： 瓸，：， ，琂， ： 参考文献， ，：珻琍，琘琕 琍臠，甊，甁琣瓽，甁，甋，甁 ，甀甌 青岛大学硕士学位论文甈瓺珽，甁琑琣 ： ，甊，琈琒簍，瓹珻瓻琒，琂琑琂 ，甋，瓼，甅簉：，琘琘，甅，甇琣 青岛大学硕士学位论文瓽甌甂 ：琈 琌琄 珹甀，珼，珹虬 ：，：陈迁，王睿，方向群，等罗红霉素与氟罗沙星联合应用对铜绿假单胞菌生物被膜的影响聂大平跤衩，王卫东等大环内酯类药物与环丙沙星，头孢