分子生物学绪论b

1、会计学1分子生物学绪论分子生物学绪论b生物大分生物大分子子核核酸酸蛋白蛋白质质多多糖糖脂脂类类 它以核酸和蛋白它以核酸和蛋白质等生物大分子的结质等生物大分子的结构及其在遗传信息和构及其在遗传信息和细胞信息传递中的作细胞信息传递中的作用为研究对象。用为研究对象。第1页/共44页分子生物学分子生物学生物化学生物化学研究方研究方向向主要研究核酸、蛋白质和主要研究核酸、蛋白质和其它大分子的结构和功能，其它大分子的结构和功能，及它们之间的相互作用。及它们之间的相互作用。着重解决细胞中信息传递着重解决细胞中信息传递的问题。的问题。主要研究大、小分主要研究大、小分子在生命活动中的子在生命活动中的代谢转化过程

2、，如代谢转化过程，如糖酵解、脂肪氧化、糖酵解、脂肪氧化、三羧酸循环等。三羧酸循环等。研究方研究方法法以以X-射线等物理学方法研射线等物理学方法研究大分子结构，以生化与究大分子结构，以生化与遗传相结合的方法探索其遗传相结合的方法探索其功能。功能。采用生化和化学方采用生化和化学方法。法。重点是大重点是大分子的结分子的结构与功能构与功能重点是重点是分子的分子的代谢转代谢转化化第2页/共44页DNADNA一级结构一级结构DNADNA二级结构二级结构DNADNA三级结构三级结构第3页/共44页DNADNA的一级结构的一级结构实际上就是实际上就是DNADNA分子内碱基的排分子内碱基的排列顺序。列顺序。第4

3、页/共44页第5页/共44页第6页/共44页第7页/共44页第8页/共44页回文结构回文结构 palindrome第9页/共44页分分类类微卫星微卫星DNA（microsatelletite DNA）小卫星小卫星DNA（minisatelletite DNA）重复频率重复频率重复序列重复序列长度长度具有种属特具有种属特异性，常作异性，常作为一种分子为一种分子遗传标记。遗传标记。第10页/共44页第11页/共44页又称单又称单序列序列第12页/共44页The Double Helix (1953) The foundation of molecular biology Francis H. Cr

4、ick James D. Watson 第13页/共44页（1）反向平行，右手双）反向平行，右手双螺旋；螺旋；（ 2 ） 糖 与 磷 酸 通 过） 糖 与 磷 酸 通 过3,5- 磷酸二酯键在外侧磷酸二酯键在外侧形成骨架；形成骨架；（3）碱基在内部，平面）碱基在内部，平面与螺旋轴垂直；与螺旋轴垂直；（4）A=T，G C；（5）直径为）直径为2nm，螺距，螺距为为3.4 nm，10bp/helix；（ 6 ） 大 沟 （） 大 沟 （ m a j o r groove）和小沟（）和小沟（minor groove）第14页/共44页氢键碱基堆积力静电斥力疏水力有利于维持双螺有利于维持双螺旋结构旋结

5、构不利于维持双螺不利于维持双螺旋结构旋结构第15页/共44页除除B-DNA外，人们还发现到了其它的结构外，人们还发现到了其它的结构参数有一定差异的参数有一定差异的DNA，如，如A-DNA, Z-DNA，三链和四链，三链和四链DNA等，这一现象称为等，这一现象称为。分子间的三螺旋分子间的三螺旋DNADNA分子内的三螺旋分子内的三螺旋DNADNA平行的三螺旋结构平行的三螺旋结构 R-DNAR-DNAA-DNAA-DNA：周碱基数可变：周碱基数可变DNADNAZ-DNAZ-DNA：左旋：左旋DNADNADNA三螺旋结构中的第三螺旋结构中的第三条链与第一条链的序三条链与第一条链的序列和方向均相同，这种

6、列和方向均相同，这种的的DNA叫叫G四联体螺旋：含有端粒重复四联体螺旋：含有端粒重复序列的单链寡核苷酸可以形成四序列的单链寡核苷酸可以形成四联体螺旋结构。联体螺旋结构。第16页/共44页不同不同DNA结构形式相互转变的现象结构形式相互转变的现象，称为，称为。DNA基本结构：基本结构：B型型天然天然DNADNA分子中，分子中，以以B B型结构为主型结构为主在这个分子的某在这个分子的某些区段会出现些区段会出现A、Z型，甚至三链型，甚至三链、四链。、四链。这些不同的结构处于动态变化中这些不同的结构处于动态变化中第17页/共44页双链双链DNADNA中配对碱基的氢键不断处中配对碱基的氢键不断处于断裂和

7、再生状态之中，特别是稳于断裂和再生状态之中，特别是稳定性较低的富含定性较低的富含A-TA-T的区段，氢键的区段，氢键的断裂和再生更为明显。在微观上的断裂和再生更为明显。在微观上，它们常常发生瞬间的单链泡状结，它们常常发生瞬间的单链泡状结构，这种现象称为双螺旋的呼吸作构，这种现象称为双螺旋的呼吸作用。用。对于一些识别双链对于一些识别双链DNADNA开链成单链开链成单链的蛋白质结合到的蛋白质结合到DNADNA上具有重要作上具有重要作用。这些蛋白质需要处于呼吸状态的用。这些蛋白质需要处于呼吸状态的双链双链DNADNA来阅读和识别来阅读和识别DNADNA内部所内部所含信息（如碱基序列、碱基上可以作含信

8、息（如碱基序列、碱基上可以作用的氢供体、氢受体的数目和方位等用的氢供体、氢受体的数目和方位等）。）。第18页/共44页是指是指DNA双螺旋进一双螺旋进一步扭曲盘绕所形成的构象，包括线形双步扭曲盘绕所形成的构象，包括线形双链中的纽结、超螺旋、多重螺旋、分子链中的纽结、超螺旋、多重螺旋、分子内局部单链环和环状内局部单链环和环状DNA中的超螺旋及中的超螺旋及连环等拓扑学性质。连环等拓扑学性质。1、超螺旋、超螺旋DNA形状更紧密，在形状更紧密，在DNA 组装中组装中有重要作用；有重要作用；2、超螺旋程度的改变介导了、超螺旋程度的改变介导了DNA结构的变结构的变化，有利于功能的发挥；化，有利于功能的发挥

9、；3、超螺旋、超螺旋DNA能实现松弛态能实现松弛态DNA所不能实所不能实现的结构转化。现的结构转化。第19页/共44页在物理和化学因素的影响下，维在物理和化学因素的影响下，维系核酸二级结构的氢键和碱基堆系核酸二级结构的氢键和碱基堆积力受到破坏，积力受到破坏，DNA双链解旋双链解旋成单链，这一过程称为成单链，这一过程称为DNA的的变性。变性。第20页/共44页1、核酸的变性可发生在整个、核酸的变性可发生在整个DNA分子中，分子中，也可发生在局部的双螺旋节段上（局部变也可发生在局部的双螺旋节段上（局部变性）。性）。2、DNA变性不涉及核苷酸中二酯键的断裂变性不涉及核苷酸中二酯键的断裂。3、引起变性

10、的因素有酸、碱、尿素、胍等、引起变性的因素有酸、碱、尿素、胍等变性剂和乙醇、丙酮等化学因素以及热、变性剂和乙醇、丙酮等化学因素以及热、紫外线等物理因素。紫外线等物理因素。4、变性后的、变性后的DNA其一系列的物理、化学性其一系列的物理、化学性质都发生变化，如质都发生变化，如260nm处紫外吸收值降处紫外吸收值降低，粘度下降，沉降速度增加，浮力密度低，粘度下降，沉降速度增加，浮力密度上升等。上升等。5、熔解曲线的中点，即一半的、熔解曲线的中点，即一半的DNA双螺旋双螺旋解为单链所对应的温度称为熔解温度或解解为单链所对应的温度称为熔解温度或解链温度。链温度。6、每一种、每一种DNA都有一个解链温度

11、，都有一个解链温度，Tm值值是一个固定常数。是一个固定常数。第21页/共44页第22页/共44页第23页/共44页分子碰分子碰撞撞时间长时间长核心作核心作用用时间短时间短拉拉链拉拉链作用作用限制因限制因素素第24页/共44页 不完全变性不完全变性DNA容易迅速复容易迅速复性；性；复性复性DNA分子不一定是原有分子不一定是原有互补链，大部分不是原配，而互补链，大部分不是原配，而是形成杂交分子；是形成杂交分子；复性复性DNA分子的结构和理化分子的结构和理化性质等均得到恢复。性质等均得到恢复。第25页/共44页、DNA片段小的比大的容易复性。片段小的比大的容易复性。、盐可以减少两条互补链负电荷的排盐

12、可以减少两条互补链负电荷的排斥作用，通常增加盐浓度，可加速两条斥作用，通常增加盐浓度，可加速两条互补链重新结合的速度。互补链重新结合的速度。、DNA浓度越大，两条互补链彼此相浓度越大，两条互补链彼此相遇的可能性越大，复性速度也越快。遇的可能性越大，复性速度也越快。第26页/共44页 一定的盐一定的盐浓度浓度 适宜的温适宜的温度度复性是分子杂交的理论基础复性是分子杂交的理论基础第27页/共44页 亲缘关系很近的亲缘关系很近的不同来源的不同来源的DNADNA单链或单链或RNARNA单链单链与与DNADNA单链之间单链之间通过碱基互补形通过碱基互补形成杂交分子的过成杂交分子的过程程, ,叫做核酸分叫

13、做核酸分子杂交。子杂交。DNA/DNADNA/RNA第28页/共44页根据核酸分子杂交的原理，有目的地人工根据核酸分子杂交的原理，有目的地人工制备或从基因组中分离一段已知序列的制备或从基因组中分离一段已知序列的DNA，使其带上标记，经变性后成为单，使其带上标记，经变性后成为单链，在一定条件下与待测链，在一定条件下与待测DNA单链杂交单链杂交，如两者序列有同源性，就形成带有标记，如两者序列有同源性，就形成带有标记的双链的双链DNA分子，即检测到了待测的分子，即检测到了待测的DNA。这段带有标记的核苷酸序列称为。这段带有标记的核苷酸序列称为核酸探针或基因探针（核酸探针或基因探针（Gene prob

14、e）。）。第29页/共44页第30页/共44页DNADNA序列分析技术是揭开生命奥秘的一把金钥匙序列分析技术是揭开生命奥秘的一把金钥匙吴瑞士吴瑞士 引物引物- -延伸测序策略延伸测序策略19711971年首次成功地年首次成功地测定了测定了噬菌体两噬菌体两个粘性末端的完整个粘性末端的完整序列。序列。F.SangerF.Sanger末端终止法末端终止法K.MullisK.MullisPCRPCRM.SmithM.Smith碱基定点突变技术碱基定点突变技术第31页/共44页利用脱氧核苷三磷酸（利用脱氧核苷三磷酸（dNTPdNTP）的类似）的类似物双脱氧核苷三磷酸（物双脱氧核苷三磷酸（ddNTPddN

15、TP）取代）取代正常的底物。正常的底物。第32页/共44页 在在DNA合成反应中除了加入合成反应中除了加入4种正常种正常dNTP外，再加入外，再加入1种少量的种少量的ddNTP，反，反应产物是一系列长短不一的核苷酸链。在应产物是一系列长短不一的核苷酸链。在4组独立的核苷酸反应中，分别加入组独立的核苷酸反应中，分别加入4种种不同的不同的ddNTP，结果生成，结果生成4组核苷酸链，组核苷酸链，它们分别终止于每一个它们分别终止于每一个A、T、C、G的位的位置上。对这置上。对这4组核苷酸进行聚丙烯酰胺凝组核苷酸进行聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸的单链胶电泳区分长度差一个核苷酸的单链DNA ，可

16、读出序列。，可读出序列。 ddNTP可以在可以在DNA聚合酶作用聚合酶作用下和多核苷酸链的下和多核苷酸链的3羟基形成磷酸羟基形成磷酸二酯键，但却不能再与下一个核苷二酯键，但却不能再与下一个核苷酸缩合，结果使得多核苷酸链的延酸缩合，结果使得多核苷酸链的延伸终止伸终止。ddNTP的的作用作用方法过方法过程程第33页/共44页聚丙烯酰胺凝胶电泳第34页/共44页 DNA DNA聚合酶聚合酶 单链单链DNADNA模板模板 单链寡核苷酸引物单链寡核苷酸引物 MgMg2+2+ 4 4种种dNTP (dATP,dGTP,dCTPdNTP (dATP,dGTP,dCTP和和dTTP)dTTP) 4 4种种ddNTP ddNTP (ddATP,ddGTP,ddCTP(ddATP,ddGTP,ddCTP和和ddTTP)ddTTP)第35页/共44页第36页/共44页实现了凝胶电泳、初始数据获取、碱基阅读实现了凝胶电泳、初始数据获取、碱基阅读等步骤自动化。等步骤自动化。DNADNA自动测序仪自动测序仪第37页/共44页第38页/共44页第39页/共44页又称单又称单序列序列第40页/共44页是指是指DNA双螺旋进一双螺旋进一步扭曲盘绕所形成的构象，包括线形双步扭曲盘绕所形成的构象，包括线形双链中的纽结、超螺旋、多重螺旋、分子链中的纽结、超螺旋、多重螺旋、分子内局部单链环和环状内局部