分子生物学之疾病相关基因的鉴定与基因功能研究

1、会计学1分子生物学之疾病相关基因的鉴定与基分子生物学之疾病相关基因的鉴定与基因功能研究因功能研究疾病相关基因是医学分子生物学最重疾病相关基因是医学分子生物学最重要的领域，因为几乎所有的疾病都与基因要的领域，因为几乎所有的疾病都与基因结构或表达变化有关，都是遗传因素和环结构或表达变化有关，都是遗传因素和环境因素相互作用的结果。境因素相互作用的结果。疾病相关基疾病相关基因因 致病基因致病基因：一种疾病的表型和一个基因一种疾病的表型和一个基因型呈直接对应的因果关系，型呈直接对应的因果关系，即该基因结构或表达的异常即该基因结构或表达的异常是导致该病发生的直接原因是导致该病发生的直接原因 疾病易感基因疾

2、病易感基因：环境因素和遗传因素均环境因素和遗传因素均起着一定作用，表现为起着一定作用，表现为2个以上基因的个以上基因的“微效作用微效作用”的相加，或者多基因间的的相加，或者多基因间的相互作用，而单一基因变相互作用，而单一基因变异仅增加对疾病的易感性异仅增加对疾病的易感性第1页/共33页第一节第一节 鉴定疾病相关鉴定疾病相关基因的原则基因的原则 第2页/共33页一、鉴定疾病相关基因的关一、鉴定疾病相关基因的关键是确定疾病表型和基键是确定疾病表型和基因间的实质联系因间的实质联系正确的诊断正确的诊断是鉴定疾病基因的先是鉴定疾病基因的先决条件决条件 确定疾病的遗传因素确定疾病的遗传因素，即通过孪，即通

3、过孪生子分析，领养分析和同胞罹患生子分析，领养分析和同胞罹患率分析等确定遗传因素是否在疾率分析等确定遗传因素是否在疾病发病中的作用及其作用程度。病发病中的作用及其作用程度。 第3页/共33页二、鉴定克隆疾病相关基因二、鉴定克隆疾病相关基因需要多学科多途径的综需要多学科多途径的综合策略合策略疾病相关基因鉴定克隆策略示意图疾病相关基因鉴定克隆策略示意图 第4页/共33页三、确定候选基因是多种三、确定候选基因是多种克隆疾病相关基因方克隆疾病相关基因方法的交汇法的交汇有许多途经能够达到最终鉴定有许多途经能够达到最终鉴定疾病相关基因的目的，这些方法最疾病相关基因的目的，这些方法最终将交汇在候选基因上。一

4、旦候选终将交汇在候选基因上。一旦候选基因被鉴定，即可筛检患者中该基基因被鉴定，即可筛检患者中该基因的突变。候选基因可不依赖其在因的突变。候选基因可不依赖其在染色体位置而予以鉴定，但常用的染色体位置而予以鉴定，但常用的策略仍然是首先找出候选染色体区策略仍然是首先找出候选染色体区域，然后在此区域内鉴定候选基因。域，然后在此区域内鉴定候选基因。 第5页/共33页第二节第二节 疾病相关基因克疾病相关基因克隆的策略和方法隆的策略和方法第6页/共33页一、不依赖染色体定位的疾一、不依赖染色体定位的疾病相关基因克隆策略病相关基因克隆策略 不依赖染色体定位的疾病相关不依赖染色体定位的疾病相关基因克隆策略包括功

5、能克隆、表基因克隆策略包括功能克隆、表型克隆及采用位点非依赖的型克隆及采用位点非依赖的DNA序列信息和动物模型来鉴定和克序列信息和动物模型来鉴定和克隆疾病基因。隆疾病基因。第7页/共33页（一）从已知蛋白质的功能和（一）从已知蛋白质的功能和结构出发克隆疾病基因结构出发克隆疾病基因功能克隆（功能克隆（functional cloningfunctional cloning）采用的是从蛋白质到采用的是从蛋白质到DNADNA的研究的研究路线，针对的是一些对影响疾病的路线，针对的是一些对影响疾病的功能蛋白具有一定了解的疾病功能蛋白具有一定了解的疾病 1 1依据蛋白质的氨基酸序列信息鉴定克隆依据蛋白质的

6、氨基酸序列信息鉴定克隆疾病相关基因疾病相关基因 2 2用蛋白质的特异性抗体鉴定疾病基因用蛋白质的特异性抗体鉴定疾病基因 第8页/共33页（二）从疾病的表型差异出发（二）从疾病的表型差异出发发现疾病相关基因发现疾病相关基因表型克隆（表型克隆（phenotype cloning）基于对疾病表型和基因结构或基因表基于对疾病表型和基因结构或基因表达的特征联系已经有所认识的基础上达的特征联系已经有所认识的基础上来分离鉴定疾病相关基因来分离鉴定疾病相关基因 第9页/共33页1. 从从疾病的表型疾病的表型出发，比较患者基因组出发，比较患者基因组DNA与正常人基因组与正常人基因组DNA的不同，直接对产生的不同

7、，直接对产生变异的变异的DNA片段进行克隆，而不需要基因片段进行克隆，而不需要基因的染色体位置或基因产物的其他信息。的染色体位置或基因产物的其他信息。 2. 针对针对已知基因已知基因。如果高度怀疑某种疾病是。如果高度怀疑某种疾病是由于某个特殊的已知基因所致，可通过比由于某个特殊的已知基因所致，可通过比较患者和正常对照间该基因表达的差异来较患者和正常对照间该基因表达的差异来确定该基因是否为该疾病相关基因。确定该基因是否为该疾病相关基因。 3. 针对针对未知基因未知基因的，可通过比较疾病和正常的，可通过比较疾病和正常组织中的所有组织中的所有mRNA的表达种类和含量间的表达种类和含量间的差异，从而克

8、隆疾病相关基因。这种差的差异，从而克隆疾病相关基因。这种差异可能源于基因结构改变，也可能源于表异可能源于基因结构改变，也可能源于表达调控机制的改变。达调控机制的改变。依据依据DNA或或mRNA的改变与疾的改变与疾病表型的关系，可有几种策略：病表型的关系，可有几种策略： 第10页/共33页针对未知基因常用的技针对未知基因常用的技术有术有mRNA差异显示差异显示（mRNA differential display，mRNA-DD）抑制消减杂交抑制消减杂交（suppressive substractive hybridization，SSH） 基因表达系列分析基因表达系列分析（SAGE） cDNA微

9、阵列微阵列 （cDNA microarray） 基因鉴定集成法基因鉴定集成法 （integrated procedure for gene identification） 第11页/共33页RDA技术原理和基本过程示意图技术原理和基本过程示意图第12页/共33页mRNA-DD技术原理和基本过程示意图技术原理和基本过程示意图 第13页/共33页（三）采用动物模型鉴定克隆疾（三）采用动物模型鉴定克隆疾病相关基因病相关基因人类的部分疾病，已经有相人类的部分疾病，已经有相应的动物模型。如果动物某种表应的动物模型。如果动物某种表型的突变基因定位于染色体的某型的突变基因定位于染色体的某一部位一部位, 而具

10、有相似人类疾病表型而具有相似人类疾病表型的基因很有可能存在于人染色体的基因很有可能存在于人染色体的同源部位。的同源部位。另外，当疾病基因在动物模另外，当疾病基因在动物模型上已完成鉴定，还可以采用荧型上已完成鉴定，还可以采用荧光原位杂交来定位分离人的同源光原位杂交来定位分离人的同源基因。基因。 第14页/共33页二、定位克隆是鉴定疾病二、定位克隆是鉴定疾病相关基因的经典方法相关基因的经典方法定 位 克 隆 （定 位 克 隆 （ p o s i t i o n a l cloning）：仅根据疾病基因在染仅根据疾病基因在染色体上的大体位置，鉴定克隆疾病色体上的大体位置，鉴定克隆疾病相关基因。相关基

11、因。定位克隆的起点是基因定位，即确定定位克隆的起点是基因定位，即确定疾病相关基因在染色体上的位置，然后根疾病相关基因在染色体上的位置，然后根据这一位置信息，应用据这一位置信息，应用DNA标记将经典的标记将经典的遗传学信息转换为遗传标记所代表的特定遗传学信息转换为遗传标记所代表的特定基因组区域，再以相关基因组区域的相连基因组区域，再以相关基因组区域的相连重叠群重叠群 （contig） 筛选候选基因，最后比筛选候选基因，最后比较患者和正常人这些基因的差异，确定基较患者和正常人这些基因的差异，确定基因和疾病的关系。因和疾病的关系。第15页/共33页（一）基因定位的方（一）基因定位的方法法1体细胞杂交

12、法通过融合细胞的筛查定位体细胞杂交法通过融合细胞的筛查定位基因基因 2染色体原位杂交是在细胞水平定位基因染色体原位杂交是在细胞水平定位基因的常用方法的常用方法3. 染色体异常有时可提供疾病基因定位的染色体异常有时可提供疾病基因定位的替代方法替代方法 4连锁分析是定位疾病未知基因的常用方连锁分析是定位疾病未知基因的常用方法法第16页/共33页（二）定位克隆的基本程序包（二）定位克隆的基本程序包括三大步骤括三大步骤1尽可能缩小染色体上的候选区域尽可能缩小染色体上的候选区域2构建目的区域的物理图谱构建目的区域的物理图谱3. 疾病相关基因的确定疾病相关基因的确定第17页/共33页（三）假肥大型肌营养不

13、良基（三）假肥大型肌营养不良基因的克隆是定位克隆的因的克隆是定位克隆的成功例证成功例证首先，根据患病女性首先，根据患病女性X染色体与第染色体与第21号常染色体的易位，以及男患儿发生小的号常染色体的易位，以及男患儿发生小的Xp21.2缺失并伴发三种其他缺失并伴发三种其他X连锁隐性遗连锁隐性遗传病，再运用传病，再运用RFLP连锁分析将连锁分析将DMD基因基因定位于定位于Xp21。然后，分别克隆得到了基因的然后，分别克隆得到了基因的2个不同个不同的 片 段 ， 分 别 命 名 为的 片 段 ， 分 别 命 名 为 X J 系 列 探 针 和系 列 探 针 和pERT87系列探针，根据两片段的比较，证

14、系列探针，根据两片段的比较，证明明DMD基因约为基因约为2300 kb，占，占X染色体的染色体的1%以上，该基因编码肌营养不良蛋白以上，该基因编码肌营养不良蛋白（dystrophin），影响横纹肌和心肌的结构），影响横纹肌和心肌的结构和收缩功能。和收缩功能。假肥大型肌营养不良（假肥大型肌营养不良（DMD）第18页/共33页三、确定常见病的基因需三、确定常见病的基因需要全基因组关联分析要全基因组关联分析和全外显子测序和全外显子测序全基因组的关联研究（全基因组的关联研究（genome-wide association study, GWAS）全外显子测序（全外显子测序（whole exon seq

15、uencing）第19页/共33页四、生物信息数据库贮藏丰四、生物信息数据库贮藏丰富的疾病相关基因信息富的疾病相关基因信息人类基因组计划和多种模式生人类基因组计划和多种模式生物基因组测序的完成物基因组测序的完成, 生物信息学生物信息学的发展的发展, 计算机软件的开发应用和计算机软件的开发应用和互联网的普及，人们通过已获得的互联网的普及，人们通过已获得的序列与数据库中核酸序列及蛋白质序列与数据库中核酸序列及蛋白质序列进行同源性比较，或对数据库序列进行同源性比较，或对数据库中不同物种间的序列比较分析、拼中不同物种间的序列比较分析、拼接，预测新的全长基因等，进而通接，预测新的全长基因等，进而通过实验

16、证实，从组织细胞中克隆该过实验证实，从组织细胞中克隆该基因，这就是所谓的基因，这就是所谓的电子克隆电子克隆 （in silico cloning）。）。 第20页/共33页第三节第三节 疾病相关基因的疾病相关基因的功能研究功能研究第21页/共33页基因的功能实际是基因的功能实际是基因产物的功能基因产物的功能，也就是编码基因的蛋白质功能和非编码也就是编码基因的蛋白质功能和非编码基因基因RNA的功能，前者是本节讨论的重的功能，前者是本节讨论的重点。点。基因产物之一蛋白质的功能可以从三个不基因产物之一蛋白质的功能可以从三个不同水平来描述：同水平来描述： 生物化学水平生物化学水平，主要描述基因产物参与

17、，主要描述基因产物参与了何种生化过程，如属于激酶、转录因了何种生化过程，如属于激酶、转录因子等；子等； 细胞水平细胞水平, 主要论述基因产物在细胞内主要论述基因产物在细胞内的定位和参与的生物学途径，例如，某的定位和参与的生物学途径，例如，某蛋白质定位于核内，参与蛋白质定位于核内，参与DNA的修复过的修复过程，有可能并不了解确切的生物化学功程，有可能并不了解确切的生物化学功能；能； 整体水平整体水平, 主要包括基团表达的时空性主要包括基团表达的时空性及基因在疾病中的作用。及基因在疾病中的作用。第22页/共33页一、基因比对及功能诠释一、基因比对及功能诠释 常用的两大双序列比对工具是常用的两大双序

18、列比对工具是BLAST和和FASTA,分别由美国国立生物技术信息中分别由美国国立生物技术信息中心（心（NCBI）和欧洲生物信息学研究所）和欧洲生物信息学研究所（EBI）开发和维护。）开发和维护。NCBI的主页是的主页是/；EBI的主页是的主页是http:/www.ebi.ac.uk/。 第23页/共33页二、利用工程细胞研究基因二、利用工程细胞研究基因功能功能 （一）采用基因重组技术建立基（一）采用基因重组技术建立基因高表达工程细胞系因高表达工程细胞系（二）基因沉默技术抑制特异基（二）基因沉默技术抑制特异基因的表达因的表达 第24页/共33页

19、三、研究生物大分子间的相三、研究生物大分子间的相互作用可确定基因功能互作用可确定基因功能 在一些情况下在一些情况下, 即使对基因的序列、结即使对基因的序列、结构和表达模式有清楚的认识，但仍然难以阐构和表达模式有清楚的认识，但仍然难以阐明基因所表达的蛋白质的功能。此时通过研明基因所表达的蛋白质的功能。此时通过研究该蛋白质与已知功能蛋白质的相互作用，究该蛋白质与已知功能蛋白质的相互作用，无疑将非常有助于对该蛋白质功能的了解。无疑将非常有助于对该蛋白质功能的了解。 常用的高通量筛查蛋白质间相互作用的常用的高通量筛查蛋白质间相互作用的方法是方法是酵母双杂交技术酵母双杂交技术（见第二十章）和（见第二十章

20、）和噬噬菌体展示技术菌体展示技术。 第25页/共33页四、利用基因修饰动物四、利用基因修饰动物整体研究基因功能整体研究基因功能 尽管在体外对基因功能的研究可提供尽管在体外对基因功能的研究可提供大量信息，但是只有在整体内的研究才能大量信息，但是只有在整体内的研究才能真实反映该基因在体内的真正作用。真实反映该基因在体内的真正作用。通过在实验动物，持别是小鼠体内进通过在实验动物，持别是小鼠体内进行相关的基因操作，获得基因修饰动物品行相关的基因操作，获得基因修饰动物品系，已成为在体研究基因功能的重要手段系，已成为在体研究基因功能的重要手段，常用的有，常用的有转基因动物转基因动物和和基因敲除动物基因敲除

21、动物。 第26页/共33页疾病相关基因是医学分子生物学最重疾病相关基因是医学分子生物学最重要的领域，因为几乎所有的疾病都与基因要的领域，因为几乎所有的疾病都与基因结构或表达变化有关，都是遗传因素和环结构或表达变化有关，都是遗传因素和环境因素相互作用的结果。境因素相互作用的结果。疾病相关基疾病相关基因因 致病基因致病基因：一种疾病的表型和一个基因一种疾病的表型和一个基因型呈直接对应的因果关系，型呈直接对应的因果关系，即该基因结构或表达的异常即该基因结构或表达的异常是导致该病发生的直接原因是导致该病发生的直接原因 疾病易感基因疾病易感基因：环境因素和遗传因素均环境因素和遗传因素均起着一定作用，表现

22、为起着一定作用，表现为2个以上基因的个以上基因的“微效作用微效作用”的相加，或者多基因间的的相加，或者多基因间的相互作用，而单一基因变相互作用，而单一基因变异仅增加对疾病的易感性异仅增加对疾病的易感性第27页/共33页三、确定候选基因是多种三、确定候选基因是多种克隆疾病相关基因方克隆疾病相关基因方法的交汇法的交汇有许多途经能够达到最终鉴定有许多途经能够达到最终鉴定疾病相关基因的目的，这些方法最疾病相关基因的目的，这些方法最终将交汇在候选基因上。一旦候选终将交汇在候选基因上。一旦候选基因被鉴定，即可筛检患者中该基基因被鉴定，即可筛检患者中该基因的突变。候选基因可不依赖其在因的突变。候选基因可不依

23、赖其在染色体位置而予以鉴定，但常用的染色体位置而予以鉴定，但常用的策略仍然是首先找出候选染色体区策略仍然是首先找出候选染色体区域，然后在此区域内鉴定候选基因。域，然后在此区域内鉴定候选基因。 第28页/共33页三、确定候选基因是多种三、确定候选基因是多种克隆疾病相关基因方克隆疾病相关基因方法的交汇法的交汇有许多途经能够达到最终鉴定有许多途经能够达到最终鉴定疾病相关基因的目的，这些方法最疾病相关基因的目的，这些方法最终将交汇在候选基因上。一旦候选终将交汇在候选基因上。一旦候选基因被鉴定，即可筛检患者中该基基因被鉴定，即可筛检患者中该基因的突变。候选基因可不依赖其在因的突变。候选基因可不依赖其在染色体位置而予以鉴定，但常用的染色体位置而予以鉴定，但常用的策略仍然是首先找出候选染色体区策略仍然是首先找出候选染色体区域，然后在此区域内鉴定候选基因。域，然后在此区域内鉴定候选基因。 第29页/共33页（三）采用动物模型鉴定克隆疾（三）采用动物模型鉴定克隆疾病相关基因病相关基因人类的部分疾病，已经有相人类的部分疾病，已经有相应的动物模