第二十一章DNA重组及重组DNA技术

1、整理ppt整理ppt DNA重组和重组重组和重组DNA技术技术DNA Recombination and Recombinant DNA technology第二十一章第二十一章整理pptnDNA重组重组（DNA recombination）是指不）是指不同同DNA分子断裂和连接而产生分子断裂和连接而产生DNA片段片段的交换并重新组合形成新的交换并重新组合形成新DNA分子的过程。分子的过程。n重组重组DNA技术技术（recombinant DNA technology）是指在体外将两个或两个以）是指在体外将两个或两个以上上DNA分子重新组合并在适当细胞中增殖分子重新组合并在适当细胞中增殖形成新

2、形成新DNA分子的过程。分子的过程。 整理ppt第一节第一节自然界自然界DNA重组和基因转移重组和基因转移DNA Recombination and Gene Transfer in Nature整理pptDNA重组重组同源重组同源重组 (homologous recombination)位点特异的重组位点特异的重组(site-specific recombination)转座重组转座重组(transposition recombination)接合作用接合作用 (conjugation)转化作用转化作用 (transformation)转导作用转导作用 (transduction)整理ppt

3、 发生在同源序列间的重组称为发生在同源序列间的重组称为同源重组同源重组(homologous recombination)，又称又称基本重组基本重组（general recombination）。是最基本的。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。段的交换。 以以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机制的同源重组为例，了解同源重组机制的的Holliday模型模型一、同源重组是最基本的一、同源重组是最基本的DNA重组方式重组方式整理pptnHolliday模型的模型

4、的4个关键步骤：个关键步骤： 两个同源染色体两个同源染色体DNA排列整齐；排列整齐；片段重组体片段重组体(patch recombinant)拼接重组体拼接重组体(splice recombinant) 一个一个DNA的一条链断裂、并与另一个的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成对应的链连接，形成Holliday中间体；中间体； 通过分支移动产生异源双链通过分支移动产生异源双链DNA； Holliday中间体切开并修复，形成两个双链中间体切开并修复，形成两个双链重组体重组体DNA，分别为：，分别为：整理ppt 片段重组体片段重组体 切开的链与原来断裂的是同一条链，重组切开的链与原来断

5、裂的是同一条链，重组 体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本本DNA。 拼接重组体拼接重组体 切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本链区的两侧来自不同亲本DNA。 整理pptn参与细菌参与细菌DNA同源重组的酶有数十种，其中最同源重组的酶有数十种，其中最关键的是关键的是RecA蛋白蛋白、RecBCD复合物复合物和和RuvC蛋蛋白白。nRecBCD复合物复合物具有三种酶活性，即依赖于具有三种酶活性，即依赖于ATP的核酸外切酶活性、可被的核酸外切酶活性、可被ATP增强的核酸内切增强的核酸内切酶活性以

6、及需要酶活性以及需要ATP的解螺旋酶活性。的解螺旋酶活性。 nRecA蛋白蛋白可结合单链可结合单链DNA（ssDNA），形成），形成RecA-ssDNA复合物。复合物。 nRuvC有内切酶活性，能专一性识别有内切酶活性，能专一性识别Holliday连连接点，并有选择地切开同源重组体的中间体。接点，并有选择地切开同源重组体的中间体。 内切酶内切酶 (recBCD)DNA侵扰侵扰(recA)分支迁移分支迁移 (recA) 内切酶内切酶(recBCD) DNA 连接酶连接酶5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 3 3 5 3

7、5 3 3 5 5 3 5 3 5 3 Holliday中间体中间体5 3 5 3 5 3 5 3 Holliday中间体中间体5 3 5 3 5 3 5 3 5 5 3 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 内切酶内切酶(ruvC)内切酶内切酶(ruvC) DNA连接酶连接酶 DNA连接酶连接酶拼接拼接重组体重组体片段片段重组体重组体整理ppt二、位点特异重组是发生在特异位点二、位点特异重组是发生在特异位点间的间的DNA整合整合 位点特异重组位点特异重组(site-specific

8、recombination) 是由整合酶催化，在两个是由整合酶催化，在两个DNA序列的特异序列的特异位点间发生的整合。位点间发生的整合。整理ppt噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的特异靶位点发生选择性整合；反转录色体的特异靶位点发生选择性整合；反转录病毒整合酶可特异地识别、整合反转录病毒病毒整合酶可特异地识别、整合反转录病毒cDNA的的长末端重复序列长末端重复序列(long terminal repeat, LTR)。 （一）（一）噬菌体噬菌体DNA的整合的整合整理ppt（二）细菌的特异位点重组（二）细菌的特异位点重组沙门氏菌沙门氏菌H片段倒位决定鞭毛相转变

9、。片段倒位决定鞭毛相转变。整理ppt hix为反向重复序列，它们之间的为反向重复序列，它们之间的H片段片段可在可在Hin控制下进行特异位点重组控制下进行特异位点重组(倒位倒位)。H片段上有两个启动子片段上有两个启动子P，其一驱动，其一驱动hin基基因表达，另一正向时驱动因表达，另一正向时驱动H2和和rH1基因基因表达，反向表达，反向(倒位倒位)时时H2和和rH1不表达。不表达。rH1为为H1的阻遏蛋白基因。的阻遏蛋白基因。整理ppt H2鞭毛素鞭毛素 阻遏蛋白阻遏蛋白Hin重组酶重组酶转位片段转位片段hinH2IH1 H1鞭毛素鞭毛素hinH2IDNA启动序列启动序列H1启动序列启动序列沙门氏

10、菌沙门氏菌H H片段倒位决定鞭毛相转变片段倒位决定鞭毛相转变整理ppt（三）免疫球蛋白基因的重排（三）免疫球蛋白基因的重排 免疫球蛋白免疫球蛋白(Ig)，由两条轻链，由两条轻链(L链链)和两条重链和两条重链(H链链)组成，分别由三个独立的基因族编码，组成，分别由三个独立的基因族编码，其中两个编码轻链其中两个编码轻链( 和和 )，一个编码重链。，一个编码重链。 轻链的基因片段：轻链的基因片段：重链的基因片段：重链的基因片段：L V J C L V D J C 整理ppt 重链重链(IgH)基因的基因的V-D-J重排和轻链重排和轻链(IgL)基基因的因的V-J重排均发生在特异位点上。在重排均发生在

11、特异位点上。在V片片段的下游，段的下游，J片段的上游以及片段的上游以及D片段的两侧片段的两侧均存在保守的重组信号序列均存在保守的重组信号序列(recombination signal sequence, RSS)。此重排的重组酶基。此重排的重组酶基因因rag (recombination activating gene)共有共有两个，分别产生蛋白质两个，分别产生蛋白质RAG1和和RAG2。 CACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCCAC TGTTTTTGG重组信号序列重组信号序列基因片段基因片段整理ppt免疫球蛋白基因重排过程免疫球蛋白基因重排过程整理ppt三、转座重组三、转座

12、重组可使基因移位可使基因移位 由插入序列和转座子介导的基因移位或重由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为排称为转座转座(transposition)。 大多数基因在基因组内的位置是固定的，大多数基因在基因组内的位置是固定的，但有些基因可以从一个位置移动到另一位但有些基因可以从一个位置移动到另一位置。这些可移动的置。这些可移动的DNA序列包括插入序序列包括插入序列和转座子。列和转座子。 整理ppt 插入序列插入序列(insertion sequences, IS)组成：组成：IRTransposase GeneIR（一）插入序列转座（一）插入序列转座 二个分离的反向重复二个分离的反向重复(i

13、nverted repeats, IR)序列序列 特有的正向重复序列特有的正向重复序列 一个转座酶（一个转座酶（transposase)编码基因编码基因整理ppt插入序列发生转座的形式：插入序列发生转座的形式：保守性转座保守性转座(conservative transposition) 复制性转座复制性转座(duplicative transposition)整理ppt插入序列的复制性转座插入序列的复制性转座整理ppt 转座子转座子(transposons) 可从一个染色体可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。位点转移到另一位点的分散重复序列。IRIRTransposase Gene

14、有用基因有用基因（二）转座子转座（二）转座子转座 转座子组成：转座子组成： 反向重复序列反向重复序列转座酶编码基因转座酶编码基因抗生素抗性等有用的基因抗生素抗性等有用的基因整理ppt 细菌的可流动性元件细菌的可流动性元件A插入序列：转座酶编码基因两侧连接反向末端重复序列插入序列：转座酶编码基因两侧连接反向末端重复序列(箭头所示箭头所示)B转座子转座子Tn3：含有转座酶、：含有转座酶、-内酰胺酶及阻遏蛋白编码基因内酰胺酶及阻遏蛋白编码基因C转座子转座子Tn10：含四环素抗性基因及两个相同的插入序列：含四环素抗性基因及两个相同的插入序列IS10L整理ppt由转座子介导的转座由转座子介导的转座整理p

15、pt四、原核细胞可通过接合、转化和转导四、原核细胞可通过接合、转化和转导进行基因转移或重组进行基因转移或重组（一）接合作用（一）接合作用当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为转移称为接接合作用合作用(conjugation)。整理ppt 可接合质粒如可接合质粒如 F 因子因子(F factor) 细菌染色体外的小型环状双链细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。分子。 质粒质粒整理ppt（二）转化作用（二）转化作用通过自动获取或人为地供给外通过

16、自动获取或人为地供给外源源DNA，使细胞或培养的受体细胞，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为获得新的遗传表型，称为转化作用转化作用 (transformation)。整理ppt例：例：溶菌时，裂解的溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。片段被另一细菌摄取。整理ppt（三）转导作用（三）转导作用当病毒从被感染的（供体）细胞释放当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞时，发出来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移转移及基因重组即为及基因重组即为转导作用转导作用(transduction)。整理ppt噬菌

17、体的生活史噬菌体的生活史溶菌生长途径溶菌生长途径 (lysis pathway)溶源菌生长途径溶源菌生长途径 (lysogenic pathway)整理ppt第二节第二节 重组重组DNA技术技术Recombinant DNA Technology整理ppt重组重组DNA技术的发展史技术的发展史1865年年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验。的豌豆杂交试验。1944年年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验。的肺炎球菌转化实验。1973年年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子。分子。1977年年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传美国

18、南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的技术制造医学上重要的药物。药物。1980年年 开始建造第一家应用重组开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂。技术生产胰岛素的工厂。1997年年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉。英国罗林研究所成功的克隆了多莉。整理ppt重组重组DNA技术相关概念技术相关概念 克隆克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或拷来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。贝的集合。 获取同一拷贝的过程称为克隆化获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。即无性繁殖。 DNA克隆克隆整理p

19、pt 技术水平：技术水平：分子克隆分子克隆(molecular clone) （即（即DNA 克隆）克隆） 细胞克隆细胞克隆 个体克隆（动物或植物）个体克隆（动物或植物）整理ppt其主要过程包括：在体外将目的其主要过程包括：在体外将目的DNA片段片段与能自主复制的遗传元件（又叫载体）连接，与能自主复制的遗传元件（又叫载体）连接，形成重组形成重组DNA分子，进而在受体细胞中复制、分子，进而在受体细胞中复制、扩增，从而获得单一扩增，从而获得单一DNA分子的大量拷贝。分子的大量拷贝。重组重组DNA技术，又称分子克隆（技术，又称分子克隆（molecular cloning）或）或DNA克隆（克隆（DN

20、A cloning）或基因工）或基因工程（程（genetic engineering）技术）技术整理ppt 目的：目的： 分离获得某一感兴趣的基因或分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）整理ppt一、重组一、重组DNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 DNA聚合酶聚合酶 逆转录酶逆转录酶 T4DNA连接酶连接酶 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 末端转移酶末端转移酶 Taq DNA聚合酶聚合酶重组重组DNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别特

21、异序列，切割识别特异序列，切割DNADNA连接酶连接酶催化催化DNA中相邻的中相邻的5 磷酸基和磷酸基和3 羟基末端之间形成磷酸二羟基末端之间形成磷酸二酯键，使酯键，使DNA切口封合或使两个切口封合或使两个DNA分子或片段连接分子或片段连接DNA聚合酶聚合酶合成双链合成双链cDNA分子或片段连接；分子或片段连接；缺口平移制作高比缺口平移制作高比活探针；活探针； DNA序列分析；序列分析；填补填补3 末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而无外切活性，而无53 外切活性。常用于外切活性。常

22、用于cDNA第二链合成，双链第二链合成，双链DNA 3 末端标记等末端标记等反转录酶反转录酶合成合成cDNA；替代替代DNA聚合酶聚合酶I进行填补，标记或进行填补，标记或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5 羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶末端转移酶在在3 羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基整理ppt限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease) 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuc

23、lease, RE)是一类核酸内切酶，能识别双链是一类核酸内切酶，能识别双链DNA分子分子内部的特异序列内部的特异序列, 并裂解磷酸二酯键。并裂解磷酸二酯键。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam H 定义：定义：整理ppt与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源系统，限制外源DNA，保护自身，保护自身DNA。、（基因工程技术中常用（基因工程技术中常用型）型） 分类：分类： 作用：作用：整理ppt第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该

24、细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。 命名：命名：Hin d 属属 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶整理ppt类酶识别序列特点类酶识别序列特点 回文结构回文结构(palindrome) 切口切口 ：平端切口平端切口、粘端切口粘端切口整理pptBam HGTCCAGGCCTAGGATCC GGGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG平端切口平端切口黏端切口黏端切口整理ppt有些限制性内切酶虽然识别序列不完全

25、有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍末端伍末端(compatible end)。 GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC GATCTAG GATCT A 同尾酶同尾酶整理ppt来源不同的限制酶，但能识别和切割来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同一位点，这些酶称同裂酶或同功异源酶同裂酶或同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam HGGATCCCCTAGGGCCT

26、AGGATCC GBst同裂酶：同裂酶：名称名称 识别序列及切割位点识别序列及切割位点名称识别序列及切割点名称识别序列及切割点切割后产生切割后产生突出末端突出末端:BamH 5GGATCC.3GATCC.3Bgl 5AGATCT.3GATCT.3EcoR EcoR 5GAATTC.3AATTC.3Hind Hind 5AAGCTT.3AGCTT.3 Hpa Hpa 5CCGG.3CGG.3 Mbo Mbo 5GATC.3GATC.3 Nde Nde 5GATATG.3TATG.3切割后产生切割后产生3突出末端突出末端:Apa 5GGGCCC.3C.3Hae 5PuGCGCPy.3Py.3Kpn

27、 5GGTACC.3C.3Pst 5CTGCAG.3G.3Sph 5GCATGC.3C.3切割后产生平末端切割后产生平末端:Alu 5AGCT.3CT.3EcoR 5GATATC.3ATC.3Hae Hae 5GGCC.3CC.3Pvu Pvu 5CAGCTG.3CTG.3Sma Sma 5CCCGGG.3GGG.3 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶整理ppt 二、重组二、重组DNADNA技术中常用的载体技术中常用的载体 定义定义为携带目的基因，实现其无性繁殖为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。分子。 载体按功能分为载体按功

28、能分为 克隆载体克隆载体(cloning vector) 表达载体表达载体(expression vector) 整理ppt克隆载体克隆载体(cloning vector)为使插入的外源为使插入的外源DNA序列被扩增而特意序列被扩增而特意设计的载体称为设计的载体称为克隆载体克隆载体。表达载体表达载体(expression vector) 为使插入的外源为使插入的外源DNA序列可转录翻译成序列可转录翻译成 多肽链而特意设计的载体称为多肽链而特意设计的载体称为表达载体表达载体。整理ppt（一）克隆载体（一）克隆载体至少有一个复制起点使载体在宿主细胞中进行至少有一个复制起点使载体在宿主细胞中进行自主

29、复制自主复制，并能使克隆的外源并能使克隆的外源DNA片段得到同步扩增；片段得到同步扩增；至少有至少有一个选择标志一个选择标志（selection marker）：选择标志是）：选择标志是区分含与不含载体的细胞所必需的，包括抗生素抗性基区分含与不含载体的细胞所必需的，包括抗生素抗性基因、因、-半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（lacZ）、营养缺陷耐受基因等。）、营养缺陷耐受基因等。有适宜的有适宜的RE的单一切点的单一切点：载体中一般都构建有一段特异：载体中一般都构建有一段特异性核苷酸序列，在这段序列中包含了多个性核苷酸序列，在这段序列中包含了多个RE的单一切点，的单一切点，可供外源基因插入时选择，

30、叫多克隆位点（可供外源基因插入时选择，叫多克隆位点（multiple cloning sites，MCS）。）。1. 1. 克隆载体应具备的基本特点克隆载体应具备的基本特点 整理ppt（1 1）质粒）质粒 (plasmid)特点特点: : 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息传信息, , 会赋予宿主细胞一些遗传性状。会赋予宿主细胞一些遗传性状。 2. 常用的克隆载体常用的克隆载体 细菌染色体外的小型细菌染色体外的小型环状双链环状双链DNA分子。分子。pUC18质粒载体图谱质粒载体图谱 整理ppt 噬菌体噬菌体DNA改造系统改造系统 gt系列（插入型

31、，适用系列（插入型，适用cDNA克隆）克隆） EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）系列（置换型，适用基因组克隆）（2 2）噬菌体）噬菌体(phage) M13噬菌体噬菌体DNA改造系统（含改造系统（含lacZ基因）基因） M13mp系列系列 pUC系列系列整理ppt柯斯质粒柯斯质粒（cosmid）载体（又称黏粒载体）载体（又称黏粒载体） 酵母人工染色体酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒动物病毒DNA改造的载体改造的载体 （如腺

32、病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）（3）其他克隆载体）其他克隆载体整理ppt（二）表达载体（二）表达载体表达载体是指用来在宿主细胞中表达外源基因表达载体是指用来在宿主细胞中表达外源基因的载体。的载体。根据宿主细胞分为：根据宿主细胞分为：原核表达载体原核表达载体真核表达载体真核表达载体整理ppt1. 1. 原核表达载体原核表达载体 原核表达载体的基本组成原核表达载体的基本组成 R R：调节序列；：调节序列；P P：启动子；：启动子；SDSD：SDSD序列；序列；TTTT：转录终止序列：转录终止序列整理ppt2. 2. 真核表达载体真核表达载体 真核表达载体

33、的基本组成真核表达载体的基本组成 OriPro：原核复制起始序列；P：启动子；MCS：多克隆位点； TT：转录终止序列；orieuk：真核复制起始序列。整理ppt第三节第三节重组重组DNA技术基本原理技术基本原理和操作步骤和操作步骤整理ppt 基本原理基本原理目的基因的获取目的基因的获取DNA导入受体细胞导入受体细胞外源基因与载体的连接外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建克隆载体的选择和构建重组体的筛选重组体的筛选克隆基因的表达克隆基因的表达 以以 质质 粒粒 为为 载载 体体 的的DNA 克克 隆隆 过过 程程整理ppt（一）目的基因的分离获取（一）目的基因的分离获取分分n化学合成法化学

34、合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列其产物的氨基酸序列 。nPCRPCR法法n从基因组从基因组DNADNA文库中获取目的文库中获取目的DNADNAn从从cDNAcDNA文库中获取目的文库中获取目的DNADNA整理ppt化学合成法获取目的基因化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。序列。整理ppt5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA2 2、PCR技术的工作原理技术的工作原理5 5 5 5 5 5 5 5 整理pptCyc

35、le 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板次循环后，模板DNA的含量的含量可以扩大可以扩大100万倍以上。万倍以上。整理pptPCR技术原理示意图技术原理示意图 整理pptn PCR的基本反应步骤的基本反应步骤变性变性95C95C延伸延伸72C退火退火Tm-5C整理ppt 模板模板DNA 特异性引物特异性引物 耐热耐热DNA聚合酶聚合酶 dNTPs Mg2+n PCR体系基本组成成分体系基本组成成分整理ppt利用特异性引物以利用特异性引物以cDNA或基因组或基因组DNA为模板获为模板获得已知目的基因片段得已知目的基因片段, 或与逆转录反应相

36、结合，直或与逆转录反应相结合，直接以组织和细胞的接以组织和细胞的mRNA为模板获得目的片段；为模板获得目的片段；利用简并引物从利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中获得文库或基因组文库中获得序列相似的基因片段；序列相似的基因片段；利用随机引物从利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中克隆文库或基因组文库中克隆基因。基因。 PCR技术技术的主要用途的主要用途（一）目的基因的克隆（一）目的基因的克隆整理ppt利用利用PCR技术可以随意设计引物在体技术可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。变等改造。 PCR技术高度敏感，对模板技术高度

37、敏感，对模板DNA的的量要求很低，是量要求很低，是DNA和和RNA微量分析的微量分析的最好方法。最好方法。 （三）（三）DNA和和RNA的微量分析的微量分析（二）基因突变（二）基因突变整理ppt将将PCR技术引入技术引入DNA序列测定，使测序序列测定，使测序工作大为简化，也提高了测序的速度；工作大为简化，也提高了测序的速度；待测待测DNA片段既可克隆到特定的载体后片段既可克隆到特定的载体后进行序列测定，也可直接测定。进行序列测定，也可直接测定。PCR与其他技术的结合可以大大提高基与其他技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性因突变检测的敏感性 。（四）（四）DNA序列测定序列测定（五）基因突

38、变分析（五）基因突变分析整理pptn逆转录逆转录PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)是将是将RNA的逆转录反应和的逆转录反应和PCR反应联合反应联合应用的一种技术。应用的一种技术。nRT-PCR是目前从组织或细胞中获得目的基因是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的以及对已知序列的RNA进行定性及半定量分进行定性及半定量分析的最有效方法。析的最有效方法。 （一）逆转录（一）逆转录PCR技术技术几种重要的几种重要的PCR衍生技术衍生技术整理pptn原位原位PCR(in situ PCR)是在组织切片或细胞涂片是在组织切片或细胞涂片上的单个细胞内进行的

39、上的单个细胞内进行的PCR反应，然后用特异反应，然后用特异性探针进行原位杂交，即可检出待测性探针进行原位杂交，即可检出待测DNA或或RNA是否在该组织或细胞中存在。是否在该组织或细胞中存在。n原位原位PCR方法弥补了方法弥补了PCR技术和原位杂交技术技术和原位杂交技术的不足，是将目的基因的扩增与定位相结合的的不足，是将目的基因的扩增与定位相结合的一种最佳方法。一种最佳方法。（二）原位（二）原位PCR技术技术整理ppt（三）实时（三）实时PCR技术技术实时实时PCR(real-time PCR)技术通过动态技术通过动态监测反应过程中的产物量，消除了产物堆积监测反应过程中的产物量，消除了产物堆积对

40、定量分析的干扰，亦被称为定量对定量分析的干扰，亦被称为定量PCR。 整理pptn实时实时PCR技术原理技术原理QR3355上游上游引物引物下游下游引物引物荧光标记引物荧光标记引物RQ 3355整理pptn实时实时PCRPCR分类：分类：实时实时PRC非探针类非探针类探针类探针类1. TaqMan1. TaqMan探针法探针法 2. 2. 分子信标探针法分子信标探针法 3. FRET3. FRET探针法探针法 整理ppt图20-3 TaqMan探针法实时PCR原理示意图组织或细胞染色体组织或细胞染色体DNA基因片断基因片断克隆载体克隆载体重组重组DNA分子分子含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌

41、限制性内切酶限制性内切酶受体菌受体菌基因组基因组DNA文库文库存在于转化细胞内存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所由克隆载体所携带的所有基因组有基因组DNA的集合的集合从基因组从基因组DNA文文库获取目的基因库获取目的基因限制酶切位点限制酶切位点限制酶消化限制酶消化 除去中间片段除去中间片段cos LR coscos L左臂左臂R cos右臂右臂真核生物染真核生物染色体色体DNA限制酶部分消化限制酶部分消化 外源外源DNA与载体与载体DNA混合混合 连接反应连接反应 体外包装体外包装 用重组噬菌体用重组噬菌体感染大肠杆菌感染大肠杆菌 20 Kb DNA 片段片段 cos LR cos20 Kb

42、 外源外源 DNA 片段片段 基因文库基因文库用随机切割的真核生物染色体用随机切割的真核生物染色体DNA片段构建基因文库片段构建基因文库 mRNA cDNA 双链双链cDNA 重组重组DNA分子分子 cDNA文库文库 反转录酶反转录酶 载体载体 受体菌受体菌 复制复制 从从cDNA文库获取目的基因文库获取目的基因 逆转录酶逆转录酶A A A A T T T T AAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T T整理ppt（二）载体的选择与构建（二）载体的选择与构建选选目的不同，操作基因的性质不同，载目的不同，操作基因的性质不同，载体的选择和改建方法也不同。体的选择和改

43、建方法也不同。 目的：目的： 获得某一目的基因或获得某一目的基因或DNA片段片段 获得目的获得目的DNA片段所编码的蛋白质片段所编码的蛋白质整理ppt载体载体插入插入DNA片段片段宿主细胞宿主细胞质粒质粒510kb细菌，酵母细菌，酵母噬菌体载体噬菌体载体20kb细菌细菌黏粒黏粒50 kb细菌细菌BAC400kb细菌细菌YAC3 Mb酵母酵母不同载体的克隆容量及适宜宿主细胞不同载体的克隆容量及适宜宿主细胞 整理ppt（三）目的（三）目的DNA与载体连接与载体连接接接方式：（方式：（1）单一相同黏端连接单一相同黏端连接 （2 2）不同黏端连接不同黏端连接 （3）通过其他措施产生黏端进行连接通过其他

44、措施产生黏端进行连接 黏端连接黏端连接Bam H切割反应切割反应 GGATCC CCTAGGT4 DNA连接酶连接酶15CGATCC GGCCTAG目的基因用目的基因用 Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG载体载体DNA用用Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG重组体重组体GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG载体自连载体自连目的基因自连目的基因自连单一相同黏端连接单一相同黏端连接不同

45、黏端连接（定向克隆）不同黏端连接（定向克隆）GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAGAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAEco R切割位点切割位点Bg l切割位点切割位点AATTCGATCTAGAATTCGGATCTAAATTCGATCTAGEcoR+ Bg l双酶切双酶切Eco R+ Bg l双酶切双酶切GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAT4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体整理ppt由平端加上新的酶切位点，再用限制由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。 人工接头人工接头(linker)连接

46、连接通过其他措施产生黏端进行连接通过其他措施产生黏端进行连接整理ppt人工接头及其应用人工接头及其应用CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco REco REco REco R整理ppt在末端转移酶在末端转移酶(terminal transferase) 的作的作用下，在用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。造出粘性末端，再进行粘端连接。 同聚物加尾连接同聚物加尾连接整理ppt5 3 3 5 载体载体DNA5 3 3 5 目的基因目的基因限制酶或机械剪切限制酶或机械剪切限制酶限制酶 5 3 3 5 5 3 T(T)nT T(

47、T)nT 3 5 5 3 3 5 3 A(A)nA A(A)nA 3 5 -核酸外切酶核酸外切酶-核酸外切酶核酸外切酶末端转移酶末端转移酶+ dATP末端转移酶末端转移酶+ dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体5 整理pptPCR法针对目的针对目的DNADNA的的5 5 - -和和3 3 - -端，设计一对特异引物，端，设计一对特异引物，在每条引物的在每条引物的5 5 - -端分别加上不同的端分别加上不同的RERE位点，然位点，然后以目的后以目的DNADNA为模板，经为模板，经PCR PCR 扩增便可得到带扩增便可得到带有引物序列

48、的目的有引物序列的目的DNADNA，再用相应，再用相应RERE切割切割PCRPCR产物，产生黏端，随后便可与带有相同黏端的产物，产生黏端，随后便可与带有相同黏端的线性化载体进行有效连接。线性化载体进行有效连接。整理ppt 平端连接平端连接 限制性内切酶切割产生的平端限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端粘端补齐或切平形成的平端适用于：适用于：目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连整理ppt3. 3. 粘粘- -平末端连接平末端连接n黏黏- -平末端连接是指目的平末端

49、连接是指目的DNADNA和载体之间通过和载体之间通过一端为黏端、另一端为平端的方式进行连接。一端为黏端、另一端为平端的方式进行连接。 n属于定向克隆属于定向克隆整理ppt受体菌条件：受体菌条件：安全宿主菌安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷限制酶和重组酶缺陷处于感受态处于感受态(competent) 导入方式：导入方式：转化转化 (transformation)转染转染 (transfection)感染感染 (infection)（四）重组（四）重组DNA转入受体细胞转入受体细胞转转整理ppt1. 借助载体上的遗传标志进行筛选借助载体上的遗传标志进行筛选 (1) 利用抗生素抗性标志筛选利用抗生素抗性

50、标志筛选(2) 利用基因的插入失活利用基因的插入失活/插入表达插入表达 特性筛选特性筛选(3) 利用标志补救筛选利用标志补救筛选(4)利用噬菌体的包装特性进行筛选利用噬菌体的包装特性进行筛选（五）重组体的筛选与鉴定（五）重组体的筛选与鉴定筛筛整理ppt2. 序列特异性筛选序列特异性筛选 (1) RERE酶切法酶切法(2) PCR法法 (3) 核酸杂交法核酸杂交法(4) DNA测序法测序法 3. 亲和筛选法亲和筛选法插入失活筛选带有重组载体的克隆插入失活筛选带有重组载体的克隆 互补筛选（蓝互补筛选（蓝- -白筛选）白筛选） 菌落或噬斑原位杂交筛选重组体菌落或噬斑原位杂交筛选重组体 整理ppt重组重组DNADNA技术操作过程可形象归纳为：技术操作过程可形象归纳为： 小结小结分分分离获取目的基因分离获取目的基因 选选载体的选择与构建载体的选择与构建接接目的目的DNADNA与载体连接与载体连接 转转重组重组DNADNA转入受体细胞转入受体细胞筛筛重组体的筛选与鉴定重组体的筛选与鉴定整理ppt重组重组DNA技术操作的主要步骤技术操作的主要步骤载体载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因组基因组DNA cDNA 人工合成人工合成PCR产物产物限制酶消化限制酶消化开环载体开环载体DNA目的基因目的基因连接酶连接酶重组体重组体转化转化体外包