核酸的制备实用教案

1、一、凝胶电泳-Gel electrophoresis琼脂糖凝胶电泳变性(binxng)琼脂糖凝胶电泳脉冲场凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳第1页/共118页第一页，共119页。1，琼脂糖凝胶电泳一般性检测采用琼脂糖凝胶电泳：SAGE-submerged agarose gel electrophoresis核酸样品从负极(fj)向正极移动。Nucleic acid samples placed in the gel will migrate towards the positive eletrode from negative electrode in horizontal direction. 第

2、2页/共118页第二页，共119页。第3页/共118页第三页，共119页。在中性在中性pHpH条件下，核酸带负电荷，主要来自条件下，核酸带负电荷，主要来自(li (li z)z)磷酸二酯键骨架上的磷酸基团。磷酸二酯键骨架上的磷酸基团。Nucleic acids are polyanionic at neutral pH. Nucleic acids are polyanionic at neutral pH. multiple negative charges due multiple negative charges due toto the the phosphate groups on

3、the phosphodiester phosphate groups on the phosphodiester backbone.backbone.第4页/共118页第四页，共119页。样品的分离效果与凝胶基质的孔隙度有关。随样品的分离效果与凝胶基质的孔隙度有关。随DNADNA分子增大，凝分子增大，凝胶浓度应降低。胶浓度应降低。琼脂糖凝胶可以分离长度为琼脂糖凝胶可以分离长度为100bp100bp至至60kb60kb的的DNADNA分子。分子。核酸染料核酸染料(rnlio)(rnlio)溴乙锭。紫外线观察。溴乙锭。紫外线观察。The degree of separation depended

4、 on the porosity of The degree of separation depended on the porosity of the matrix.the matrix.第5页/共118页第五页，共119页。第6页/共118页第六页，共119页。影响泳动率的因素：影响泳动率的因素：包括分子包括分子(fnz)(fnz)大小、电荷多少、颗粒形状和空间构型。大小、电荷多少、颗粒形状和空间构型。颗粒带电荷的密度越大，泳动速度越快。颗粒带电荷的密度越大，泳动速度越快。颗粒物理形状越大，与支持物介质摩擦力越大，泳动速度颗粒物理形状越大，与支持物介质摩擦力越大，泳动速度越小。越小。第7页

5、/共118页第七页，共119页。对于线性双链对于线性双链DNADNA分子，在凝胶电泳中，相对分子质量的常用分子，在凝胶电泳中，相对分子质量的常用对数与泳动率成反比关系。对数与泳动率成反比关系。利用利用DNADNA分子长度（分子长度（bpbp）的负对数与泳动距离）的负对数与泳动距离(jl)(jl)作图，可作图，可以方便准确地测定以方便准确地测定DNADNA片段的分子量。片段的分子量。第8页/共118页第八页，共119页。构型相同、但相对分子质量不同的DNA片段泳动速度不一样，在电泳过程中可以(ky)彼此分开。相对分子质量相同的DNA分子如果它们的空间构型不同，其迁移率也不同。质粒DNA存在闭环（

6、型，CC）、单链开环（型，OC）和线性（型，L）三种构型，三者之间的迁移率一般为型 型 型第9页/共118页第九页，共119页。以以pUC19质粒为例，有超螺旋的共价闭合环状质粒质粒为例，有超螺旋的共价闭合环状质粒DNA（covalently closed circular DNA, 简称简称(jinchng)cccDNA）、共价闭合环状质粒）、共价闭合环状质粒DNA一条单链一条单链断裂的开环质粒断裂的开环质粒DNA（open circular DNA, 简称简称(jinchng)ocDNA）、共价）、共价闭合环状质粒闭合环状质粒DNA两条单链断裂的线性质粒两条单链断裂的线性质粒DNA（lin

7、ear DNA, 简称简称(jinchng)L DNA）三种构型。）三种构型。电泳时电泳时cccDNA移动最快，其次为线性移动最快，其次为线性DNA，开环质粒，开环质粒DNA最慢，所以电泳最慢，所以电泳结果为三条分开的带。结果为三条分开的带。限制性酶切的质粒限制性酶切的质粒DNA为线性分子。为线性分子。第10页/共118页第十页，共119页。第11页/共118页第十一页，共119页。 M 1 2 3 21kb 5.1 4.9 4.2 3.5 2.0 1.9 1.5 1.3 0.94 0.83 M：DNA相对分子质量标准物（相对分子质量标准物（marker）；）；1：pUC19质粒质粒DNA经经

8、EcoR完全完全酶切；酶切；2：pUC19质粒质粒DNA经经EcoR部分部分(b fen)酶切；酶切；3：未酶切的：未酶切的pUC19质粒质粒DNA，提，提取结果好时，为一条带，以超取结果好时，为一条带，以超螺旋质粒螺旋质粒DNA为主，有时结果为主，有时结果为三条带，从下向上分别为超为三条带，从下向上分别为超螺旋质粒、线性质粒和开环质螺旋质粒、线性质粒和开环质粒。粒。第12页/共118页第十二页，共119页。通常采用的缓冲体系有通常采用的缓冲体系有3 3种：种：Tris.Tris.乙酸乙酸(y sun)(y sun)（TAETAE）、）、Tris.Tris.硼酸（硼酸（TBETBE）和）和Tr

9、is.Tris.磷酸（磷酸（TPETPE）。）。TAETAE缓冲能力很低，长时间电泳会导致电泳槽阴极变为碱性，缓冲能力很低，长时间电泳会导致电泳槽阴极变为碱性，阳极变为酸性，从而使缓冲能力降低。阳极变为酸性，从而使缓冲能力降低。第13页/共118页第十三页，共119页。琼脂糖凝胶电泳的分辨力较低，但它操作简便、应用范围广、琼脂糖凝胶电泳的分辨力较低，但它操作简便、应用范围广、适合于较大分子的分析。适合于较大分子的分析。DNADNA分子在电泳后短时间内位置可以保持不变，该技术分子在电泳后短时间内位置可以保持不变，该技术(jsh)(jsh)已成为已成为DNADNA、RNARNA分离和检测的重要手段

10、。分离和检测的重要手段。TBETBE与与TPETPE均有较强的缓冲能力，但从均有较强的缓冲能力，但从TPETPE凝胶回收的凝胶回收的DNADNA片段中片段中含有较高的磷酸盐，容易与含有较高的磷酸盐，容易与DNADNA一起沉淀，进而影响一些酶反应，一起沉淀，进而影响一些酶反应，如限制性酶切反应。如限制性酶切反应。第14页/共118页第十四页，共119页。琼脂糖浓度琼脂糖浓度 %分离范围分离范围 kb0.35600.61200.70.8100.90.571.20.40.12不同浓度的琼脂糖凝胶可分离线性不同浓度的琼脂糖凝胶可分离线性DNADNA分子的有效分子的有效(yuxio

11、)(yuxio)范围范围（指能够清楚地分开）（指能够清楚地分开）第15页/共118页第十五页，共119页。2 2，变性琼脂糖凝胶电泳，变性琼脂糖凝胶电泳RNARNA分子在变性琼脂糖凝胶中可以按大小不同分子在变性琼脂糖凝胶中可以按大小不同(b tn)(b tn)而相互而相互分开。分开。变性指利用变性剂破坏变性指利用变性剂破坏RNARNA的二级结构，消除二级结构对电泳的二级结构，消除二级结构对电泳迁移率的影响，使迁移率的影响，使RNARNA分子的泳动由分子大小来决定。分子的泳动由分子大小来决定。常用的变性剂有甲醛、乙二醛和二甲基亚砜等。常用的变性剂有甲醛、乙二醛和二甲基亚砜等。 第16页/共118

12、页第十六页，共119页。变性凝胶也可以检测DNA分子的碱基变异(biny)：恒定变性凝胶电泳，CDGE瞬时温度梯度凝胶电泳，TTGE温度梯度凝胶电泳，TGGE第17页/共118页第十七页，共119页。3 3，脉冲场琼脂糖凝胶电泳，脉冲场琼脂糖凝胶电泳大分子大分子DNADNA在电场作用下挤过孔径在电场作用下挤过孔径(kngjng)(kngjng)小于分子大小于分子大小的凝胶时，将会改变无规卷曲的构象，沿电场方向伸直，小的凝胶时，将会改变无规卷曲的构象，沿电场方向伸直，与电场平行，这样才能通过凝胶。与电场平行，这样才能通过凝胶。这时大分子通过凝胶的方式均相同，迁移率无差别，不能这时大分子通过凝胶的

13、方式均相同，迁移率无差别，不能达到分离的目的。达到分离的目的。第18页/共118页第十八页，共119页。当电场方向改变时，电场内的当电场方向改变时，电场内的DNADNA分子构象分子构象(u (u xin)xin)也发生改变，并重新定向，沿新的方向伸直也发生改变，并重新定向，沿新的方向伸直. .其转向时间与其粘弹性弛豫时间有关，并显著地依赖其转向时间与其粘弹性弛豫时间有关，并显著地依赖于分子大小。于分子大小。DNADNA分子越大，这种构象分子越大，这种构象(u xin)(u xin)改变需要的时间改变需要的时间越长。越长。第19页/共118页第十九页，共119页。在脉冲场琼脂糖凝胶电泳中，DNA

14、DNA分子在两个不同方向的均一或不均一电场中不断(bdun)(bdun)随电场方向改变分子本身的构象，并挤过凝胶。第20页/共118页第二十页，共119页。DNADNA分子构象分子构象(u xin)(u xin)改变时间小于脉冲电场周期，改变时间小于脉冲电场周期，DNADNA分子便可以按其分子大小，得到较好的分离效果；分子便可以按其分子大小，得到较好的分离效果；反之，反之，DNADNA分子变换时间大于脉冲电场周期，则凝胶中分子变换时间大于脉冲电场周期，则凝胶中DNADNA分子松弛变形与电场更替时间不相等，达不到分离目的。分子松弛变形与电场更替时间不相等，达不到分离目的。 第21页/共118页第

15、二十一页，共119页。Pulsed-field gel electrophoresis, PFGEField inversion gel electrophoresis, FIGE, 电场倒转凝胶电场倒转凝胶电泳电泳Contour-clamped homogeneous eletric field gel electrophoresis, CHEF, 钳位均匀电场电泳钳位均匀电场电泳 六边形排列的点电极六边形排列的点电极(dinj)，长而平行的电极，长而平行的电极(dinj)对形成匀强电场对形成匀强电场(夹角夹角120)。 第22页/共118页第二十二页，共119页。4 4，聚丙烯酰胺凝胶电泳

16、（，聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGEPAGE）聚丙烯酰胺凝胶是一种聚丙烯酰胺凝胶是一种(y zhn)(y zhn)人工合成的凝胶，人工合成的凝胶，由丙烯酰胺单体和甲叉丙烯酰胺在催化剂过硫酸胺和由丙烯酰胺单体和甲叉丙烯酰胺在催化剂过硫酸胺和加速剂加速剂TEMEDTEMED的作用下聚合而成。的作用下聚合而成。聚丙烯酰胺凝胶可分离聚丙烯酰胺凝胶可分离5-500bp5-500bp的小片段的小片段DNADNA分子，所分子，所以手工测序一般只能读出以手工测序一般只能读出500500个碱基。个碱基。第23页/共118页第二十三页，共119页。聚合时，由丙烯酰胺单体聚合成链状物，由交联剂甲叉聚合时，由丙烯酰胺单体

17、聚合成链状物，由交联剂甲叉双丙烯酰胺将链与链交联成网状，形成不溶于水的凝胶。双丙烯酰胺将链与链交联成网状，形成不溶于水的凝胶。根据待分离物质根据待分离物质(wzh)(wzh)的分子大小，应选用合适的凝的分子大小，应选用合适的凝胶浓度。胶浓度。第24页/共118页第二十四页，共119页。 被分离被分离(fnl)物质与凝胶浓度之间的关系物质与凝胶浓度之间的关系被分离物质被分离物质被分离物的相对分子被分离物的相对分子质量质量适用的凝胶浓度适用的凝胶浓度蛋白质蛋白质10520%30%15%20%1015%5%10%2%-5%核核 酸酸104104 105105 210815%20%5%10%2%2.6

18、%第25页/共118页第二十五页，共119页。最常用的蛋白质分离体系为最常用的蛋白质分离体系为pH8.9pH8.9的碱性缓冲液体系的碱性缓冲液体系. .因为因为(yn wi)(yn wi)大多数蛋白质的等电点略偏酸性或中大多数蛋白质的等电点略偏酸性或中性，在性，在pH8.9pH8.9的碱性缓冲体系中带负电荷，向正极移的碱性缓冲体系中带负电荷，向正极移动。动。第26页/共118页第二十六页，共119页。在有些情况下，需要在缓冲体系中加入解离剂，将分子内在有些情况下，需要在缓冲体系中加入解离剂，将分子内的非共价键破坏，这种体系称为解离体系。的非共价键破坏，这种体系称为解离体系。常用的解离剂有常用的

19、解离剂有SDSSDS、尿素等，它们同时、尿素等，它们同时(tngsh)(tngsh)也是某也是某些蛋白质（如膜蛋白）的促溶剂。些蛋白质（如膜蛋白）的促溶剂。解离剂可以减弱分子空间构象的差别，有利于了解分子的解离剂可以减弱分子空间构象的差别，有利于了解分子的大小与迁移率之间的关系。大小与迁移率之间的关系。 第27页/共118页第二十七页，共119页。PAGEPAGE分为连续电泳体系和不连续电泳体系。分为连续电泳体系和不连续电泳体系。连续电泳体系指整个电泳体系中的缓冲液、连续电泳体系指整个电泳体系中的缓冲液、pHpH值和凝胶孔值和凝胶孔径大小径大小(dxio)(dxio)相同，主要用于核酸分析。相

20、同，主要用于核酸分析。第28页/共118页第二十八页，共119页。不连续电泳体系不连续电泳体系(tx)(tx)中，除了电泳槽中的缓冲体系中，除了电泳槽中的缓冲体系(tx)(tx)和和pHpH值与凝胶中不同外，凝胶本身也由缓冲体系值与凝胶中不同外，凝胶本身也由缓冲体系(tx)(tx)、pHpH值和凝胶孔径不同的两种凝胶堆积而成，该体系值和凝胶孔径不同的两种凝胶堆积而成，该体系(tx)(tx)主要主要用于蛋白质样品的分离。用于蛋白质样品的分离。不连续电泳体系不连续电泳体系(tx)(tx)制胶比较麻烦，但它对样品有高效浓制胶比较麻烦，但它对样品有高效浓缩效应，可以大大提高分辨能力。缩效应，可以大大提

21、高分辨能力。第29页/共118页第二十九页，共119页。蛋白质分子的分离鉴定采用不连续电泳体系进行，在蛋白质分子的分离鉴定采用不连续电泳体系进行，在电泳时除具有电荷效应和分子筛效应外，还有浓缩效电泳时除具有电荷效应和分子筛效应外，还有浓缩效应。应。浓缩效应主要浓缩效应主要(zhyo)(zhyo)在浓缩胶中完成，浓缩胶在浓缩胶中完成，浓缩胶pHpH为为6.96.9。第30页/共118页第三十页，共119页。在浓缩胶中，蛋白质样品在快慢离子间被浓缩形成一狭在浓缩胶中，蛋白质样品在快慢离子间被浓缩形成一狭小的中间层，并按其蛋白质所带负电荷量多少小的中间层，并按其蛋白质所带负电荷量多少(dusho)(

22、dusho)依次排列成带。依次排列成带。浓缩的样品进入分离胶后，胶的孔径变小，浓缩的样品进入分离胶后，胶的孔径变小，pHpH值升高，值升高，电场强度恒定，蛋白质的分离取决于它们的电荷性质、电场强度恒定，蛋白质的分离取决于它们的电荷性质、分子大小和形状。分子大小和形状。第31页/共118页第三十一页，共119页。SDS-PAGESDS-PAGE可用于蛋白质分子量的测定可用于蛋白质分子量的测定SDSSDS（十二烷基硫酸钠）是一种阴离子去污剂，在溶液中能（十二烷基硫酸钠）是一种阴离子去污剂，在溶液中能与蛋白质分子的疏水部分定量结合，把大多数蛋白质拆分成与蛋白质分子的疏水部分定量结合，把大多数蛋白质拆

23、分成亚单位，变成线状，并带上阴离子。这些亚单位，变成线状，并带上阴离子。这些(zhxi)(zhxi)阴离子阴离子掩盖了蛋白质分子本身所带的电荷差异。掩盖了蛋白质分子本身所带的电荷差异。SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳消除了电荷效应，只有分子筛效应，聚丙烯酰胺凝胶电泳消除了电荷效应，只有分子筛效应，蛋白质的电泳迁移率完全取决于分子量，迁移率与分子量对蛋白质的电泳迁移率完全取决于分子量，迁移率与分子量对数呈线性关系。数呈线性关系。第32页/共118页第三十二页，共119页。用于核酸分离的聚丙烯酰胺凝胶的缓冲体系是连续体系，用于核酸分离的聚丙烯酰胺凝胶的缓冲体系是连续体系，主要分离较小的核酸（主要

24、分离较小的核酸（5-500bp5-500bp），迁移率与分子大小），迁移率与分子大小(dxio)(dxio)和构型（如线性、缺口环化、超螺旋）有关。和构型（如线性、缺口环化、超螺旋）有关。如果样品中所有的如果样品中所有的DNADNA分子均为线性分子，可用迁移率比较分子均为线性分子，可用迁移率比较其大小其大小(dxio)(dxio)（以标准核酸片段作标准对照）。（以标准核酸片段作标准对照）。第33页/共118页第三十三页，共119页。核酸序列测定采用核酸序列测定采用(ciyng)(ciyng)以尿素为解离剂的聚丙烯酰胺以尿素为解离剂的聚丙烯酰胺凝胶。凝胶。 第34页/共118页第三十四页，共11

25、9页。二、核酸的序列二、核酸的序列(xli)(xli)测定测定DNA sequencingDNA sequencing基本原理：将基本原理：将DNADNA的序列的序列(xli)(xli)测定转化为测定转化为DNADNA片段的长度分析。片段的长度分析。第35页/共118页第三十五页，共119页。1 1，化学法测序，化学法测序-Maxam-Gilbert (chemical) sequencing-Maxam-Gilbert (chemical) sequencing Allan Maxam and Walter Gilbert Allan Maxam and Walter Gilbert （19

26、771977） 用化学物质在特定碱基位置断裂用化学物质在特定碱基位置断裂(dun li)DNA(dun li)DNA分子，产生分子，产生总体上只差一个碱基的一套总体上只差一个碱基的一套DNADNA片段。片段。chemicals are used chemicals are used toto cleave the DNA at certain cleave the DNA at certain positions, generating a set of fragments that differ positions, generating a set of fragments that di

27、ffer by one nucleotide.by one nucleotide.第36页/共118页第三十六页，共119页。DNADNA片段的一条链在片段的一条链在5 5 端用端用32P32P标记。标记。然后进行特定的化学修饰然后进行特定的化学修饰(xish)(xish)。将修饰将修饰(xish)(xish)的碱基从脱氧核糖分子上除去后用哌啶断的碱基从脱氧核糖分子上除去后用哌啶断裂（裂（piperidinepiperidine）。）。 The reaction conditions are chosen so that,on The reaction conditions are chose

28、n so that,on average, only one modification will be introduced average, only one modification will be introduced into each copy of the DNA o each copy of the DNA molecule.第37页/共118页第三十七页，共119页。化学法使用特异的化学试剂修饰化学法使用特异的化学试剂修饰DNADNA分子中的不同碱基，然后分子中的不同碱基，然后用哌啶切断多核苷酸链；用哌啶切断多核苷酸链；通过四组不同的特异反应，就可以将末

29、端（通过四组不同的特异反应，就可以将末端（3-3-或或5-5-端）端）带有放射性标记的带有放射性标记的DNADNA分子切成不同长度的寡核苷酸片段。分子切成不同长度的寡核苷酸片段。这些这些(zhxi)(zhxi)寡核苷酸的长度相当于从特异反应引起的切点寡核苷酸的长度相当于从特异反应引起的切点到标记末端之间的长度。到标记末端之间的长度。第38页/共118页第三十八页，共119页。用分辨力极高的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳将这些不同用分辨力极高的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳将这些不同长度长度(chngd)(chngd)的寡核苷酸片段分离开来并进行自显影的寡核苷酸片段分离开来并进行自显影。在四组反应中，整体上相邻

30、的两条带仅相差一个碱基在四组反应中，整体上相邻的两条带仅相差一个碱基，由此可读出所测定的，由此可读出所测定的DNADNA的序列。的序列。第39页/共118页第三十九页，共119页。G G反应反应 用硫酸二甲脂（用硫酸二甲脂（dimethyl sulfatedimethyl sulfate，简称，简称DMSDMS）使鸟嘌）使鸟嘌呤上的呤上的N7N7原子甲基化。原子甲基化。甲基化的鸟嘌呤与脱氧戊糖之间的糖苷键在中性环境甲基化的鸟嘌呤与脱氧戊糖之间的糖苷键在中性环境(hunjng)(hunjng)中加热而断裂，鸟嘌呤碱基脱落，多核苷酸中加热而断裂，鸟嘌呤碱基脱落，多核苷酸骨架在鸟嘌呤处发生断裂。骨架

31、在鸟嘌呤处发生断裂。第40页/共118页第四十页，共119页。G+AG+A反应反应(fnyng) (fnyng) 用甲酸使用甲酸使A A和和G G嘌呤环上的嘌呤环上的N N原子质子化，使糖苷键变原子质子化，使糖苷键变得不稳定，再用哌啶使嘌呤脱落。得不稳定，再用哌啶使嘌呤脱落。第41页/共118页第四十一页，共119页。T+CT+C反应反应 用肼（用肼（hydrazinehydrazine）使）使T T和和C C的嘧啶环断裂，再用哌啶的嘧啶环断裂，再用哌啶除去除去(ch q)(ch q)碱基。碱基。C C反应反应 当有当有NaClNaCl存在时，只有存在时，只有C C与肼发生反应，与肼发生反应，

32、T T不发生反不发生反应。断裂的应。断裂的C C可用哌啶除去可用哌啶除去(ch q)(ch q)。哌啶也可使脱。哌啶也可使脱去碱基处的磷酸二酯键断裂。去碱基处的磷酸二酯键断裂。 第42页/共118页第四十二页，共119页。上述四组反应中，应控制时间只让很小一部分碱基被修饰上述四组反应中，应控制时间只让很小一部分碱基被修饰(xish)(xish)，这样在一种，这样在一种DNADNA分子形成的群体中，每个相关位点都分子形成的群体中，每个相关位点都有可能被切断形成一种末端带标记的寡核苷酸片段。有可能被切断形成一种末端带标记的寡核苷酸片段。但用哌啶切断链的反应必须是定量的。但用哌啶切断链的反应必须是定

33、量的。第43页/共118页第四十三页，共119页。反应完毕后，一般用尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳反应完毕后，一般用尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳（7mol/L7mol/L尿素，尿素，8%8%胶）进行分析。胶）进行分析。电泳时电压在电泳时电压在4000V4000V左右，凝胶的温度保持在左右，凝胶的温度保持在6565，以保证以保证DNADNA在变性状态下进行电泳。在变性状态下进行电泳。电泳完毕后，将胶抽干电泳完毕后，将胶抽干(chu n)(chu n)，进行放射自显影，进行放射自显影，从胶片上可读出从胶片上可读出DNADNA序列。序列。 第44页/共118页第四十四页，共119页。图图 化学法测定化学法测定DN

34、ADNA序列时的序列时的G G反应反应(fnyng)(fnyng)（A A）和化学法测定）和化学法测定DNADNA序列图解（序列图解（B B） 第45页/共118页第四十五页，共119页。第46页/共118页第四十六页，共119页。2 2，酶法测序，酶法测序Sanger-Coulson (dideoxy or enzymatic) sequencingSanger-Coulson (dideoxy or enzymatic) sequencing Frederick Sanger and Alan CoulsonFrederick Sanger and Alan CoulsonKlenow f

35、ragment, Klenow fragment, single-stranded DNA, single-stranded DNA, a primera primerddNTPs-dideoxynucleoside triphosphatesddNTPs-dideoxynucleoside triphosphatesdNTPs,-dNTPs,-3535SATPSATP第47页/共118页第四十七页，共119页。用用M13M13噬菌体载体噬菌体载体(zit)(zit)制备单链制备单链DNADNA。DNA molecule was cloned into a vector such as the

36、 DNA molecule was cloned into a vector such as the bacteriophage M13 bacteriophage M13 toto produce single-stranded DNA. produce single-stranded DNA. 第48页/共118页第四十八页，共119页。测序胶测序胶-6-20% polyacrylamide6-20% polyacrylamide7M urea7M urea which acts as a which acts as a denaturantdenaturant to to reduce

37、the effects of DNA reduce the effects of DNA secondary secondary structure.structure.第49页/共118页第四十九页，共119页。英国生物化学家英国生物化学家F. SangerF. Sanger（19181918）第一个完成）第一个完成(wn chng)(wn chng)了了胰岛素的氨基酸序列测定。胰岛素的氨基酸序列测定。1919世纪前叶人们就知道蛋白质，并了解其水解产物中有一些氨基世纪前叶人们就知道蛋白质，并了解其水解产物中有一些氨基酸。酸。到了到了2020世纪初，科学家发现蛋白质是氨基酸通过肽键连接而成的世

38、纪初，科学家发现蛋白质是氨基酸通过肽键连接而成的长链，长链，19401940时基本弄清了组成蛋白质的时基本弄清了组成蛋白质的2020种不同氨基酸，但对于种不同氨基酸，但对于这些氨基酸在蛋白质中如何排列一无所知。这些氨基酸在蛋白质中如何排列一无所知。SangerSanger从从19451945年起，选择当时已知的最小蛋白质胰岛素作为研究年起，选择当时已知的最小蛋白质胰岛素作为研究对象，经过十年的艰苦奋斗，终于测出了牛胰岛素所含的对象，经过十年的艰苦奋斗，终于测出了牛胰岛素所含的5151个氨个氨基酸的排列顺序，于基酸的排列顺序，于19581958年获得第一个诺贝尔奖。年获得第一个诺贝尔奖。第50页

39、/共118页第五十页，共119页。双脱氧法（双脱氧法（dideoxy methoddideoxy method），也称酶法（），也称酶法（enzyme enzyme methodmethod）或链终止法（）或链终止法（the chain termination the chain termination methodmethod），由），由SangerSanger于于19771977年建立。年建立。以以35P35P、35S35S替代替代32P32P作为标记物。作为标记物。该方法的原理是利用该方法的原理是利用(lyng)2,3-(lyng)2,3-双脱氧核苷三双脱氧核苷三磷酸（磷酸（2,3-dd

40、NTP2,3-ddNTP，dideoxynucleotide dideoxynucleotide ）来终）来终止止DNADNA的复制反应。的复制反应。第51页/共118页第五十一页，共119页。DNADNA聚合酶（如聚合酶（如KlenowKlenow片段）在片段）在DNADNA复制过程中催化多核苷复制过程中催化多核苷酸链的延伸，单核苷酸被连接在延伸链的酸链的延伸，单核苷酸被连接在延伸链的3-OH3-OH上；上；如果掺入一个如果掺入一个(y )2,3-ddNTP(y )2,3-ddNTP，延伸反应就会停止，延伸反应就会停止。第52页/共118页第五十二页，共119页。根据这一原理设计四组反应，每

41、组反应中都含有根据这一原理设计四组反应，每组反应中都含有(hn yu):(hn yu):正常的四种脱氧核苷酸正常的四种脱氧核苷酸dNTPdNTP（其中一种带有（其中一种带有32P32P标记）标记）单链单链DNADNA模板（即待测模板（即待测DNADNA，一般通过，一般通过M13M13丝状噬菌体制备）丝状噬菌体制备）DNADNA聚合酶聚合酶I I引物（可以根据载体序列人工合成）引物（可以根据载体序列人工合成）另外每一组反应还加入一种另外每一组反应还加入一种2,3-ddNTP2,3-ddNTP。也可以标记引物或也可以标记引物或ddNTP.ddNTP.第53页/共118页第五十三页，共119页。以以

42、A A管为例，凡聚合反应进行到模板的管为例，凡聚合反应进行到模板的T T碱基时，碱基时，2-dATP2-dATP和和2,3-ddATP2,3-ddATP都有可能掺入都有可能掺入. .如果如果(rgu)(rgu)掺入掺入2-dATP2-dATP，聚合反应可以继续进行。，聚合反应可以继续进行。如果如果(rgu)(rgu)掺入掺入2,3-ddATP2,3-ddATP，链延伸反应即告终止，这样，链延伸反应即告终止，这样在反应产物中就会产生末端为在反应产物中就会产生末端为A A的单链的单链DNADNA片段群体。片段群体。第54页/共118页第五十四页，共119页。将四组反应产物用凝胶电泳进行分析，在整体

43、上四个泳道中自将四组反应产物用凝胶电泳进行分析，在整体上四个泳道中自显影产生的相邻条带只有一个碱基的差异，由此可读出显影产生的相邻条带只有一个碱基的差异，由此可读出DNADNA的序的序列。列。应用应用35S35S标记的标记的dNTPdNTP替代替代32P32P标记的标记的dNTPdNTP，电泳图谱更加，电泳图谱更加(gnji)(gnji)清晰，分辨力更高，每次实验可以读出更多的碱基序清晰，分辨力更高，每次实验可以读出更多的碱基序列。列。第55页/共118页第五十五页，共119页。目前双脱氧测序反应一般利用双链目前双脱氧测序反应一般利用双链DNADNA模板通过聚合酶链式反模板通过聚合酶链式反应进

44、行，并采用四种不同颜色的荧光素分别标记四种双脱氧应进行，并采用四种不同颜色的荧光素分别标记四种双脱氧核苷酸。核苷酸。这使得四组测序反应可以在一个这使得四组测序反应可以在一个EppendorfEppendorf管进行，分析管进行，分析(fnx)(fnx)时通过毛细管电泳在时通过毛细管电泳在DNADNA自动测序仪即可读出相应的自动测序仪即可读出相应的DNADNA序列。序列。 第56页/共118页第五十六页，共119页。第57页/共118页第五十七页，共119页。基本的原理为基本的原理为DNADNA聚合酶不能区分聚合酶不能区分dNTPdNTP和和ddNTPddNTP，一旦，一旦ddNTPddNTP被

45、作为底物连接至被作为底物连接至新生新生(xnshng)(xnshng)链，链，DNADNA的延伸合成会终止，从而产生单链的的延伸合成会终止，从而产生单链的DNADNA片段；片段；由于存在很多模板分子，以及由于存在很多模板分子，以及dNTPdNTP和和ddNTPddNTP连接的随机性，连接的随机性，DNADNA合成反应可以合成反应可以在任一碱基位置终止。在任一碱基位置终止。经过一段时间后可得到一个不同长度的单链经过一段时间后可得到一个不同长度的单链DNADNA群体，电泳时它们可以按大小群体，电泳时它们可以按大小分开，并且相邻条带之间仅差一个碱基。分开，并且相邻条带之间仅差一个碱基。从胶的下面开始

46、向上可以读出从胶的下面开始向上可以读出DNADNA分子的核苷酸序列。越靠近引物端的位置产分子的核苷酸序列。越靠近引物端的位置产生的片段越小。生的片段越小。第58页/共118页第五十八页，共119页。链终止法中用于测序的链终止法中用于测序的DNADNA聚合酶必须满足聚合酶必须满足3 3个条件：个条件：高酶活性，即与模板结合能力高酶活性，即与模板结合能力(nngl)(nngl)强，可合成足够长的强，可合成足够长的DNADNA单链；单链；无无5 5 33 外切核酸酶活性，外切核酸酶活性，5 5 33 核酸酶活性可将新合成的核酸酶活性可将新合成的DNADNA链的链的5 5 端除去，改变合成产物的长度，

47、给顺序的阅读造端除去，改变合成产物的长度，给顺序的阅读造成误差；成误差；第59页/共118页第五十九页，共119页。无无3 3 55 外切酶活性，原因与相同。外切酶活性，原因与相同。所以用于测序的所以用于测序的DNADNA聚合酶都经过了人工的修饰。聚合酶都经过了人工的修饰。第一个用于测序的第一个用于测序的DNADNA聚合酶为聚合酶为KlenowKlenow片段，不具有片段，不具有5 5 33 外切酶活性，外切酶活性，但仅能合成长约但仅能合成长约250250个核苷酸的个核苷酸的DNADNA分子，经聚丙烯酰胺凝胶电泳后，会分子，经聚丙烯酰胺凝胶电泳后，会形成一些阴影形成一些阴影(ynyng)(yn

48、yng)条带，说明有许多终止反应由酶活性造成。条带，说明有许多终止反应由酶活性造成。现在广泛采用的现在广泛采用的DNADNA聚合酶由聚合酶由T7T7噬菌体编码，又称噬菌体编码，又称sequenasesequenase，即测序酶。，即测序酶。SequenaseSequenase工作效率高，无外切酶活性。工作效率高，无外切酶活性。第60页/共118页第六十页，共119页。第61页/共118页第六十一页，共119页。第62页/共118页第六十二页，共119页。链终止法测序时可通过以下几种方法制备模板：链终止法测序时可通过以下几种方法制备模板：插入质粒载体的双链插入质粒载体的双链DNADNA，可以采用

49、碱变性，可以采用碱变性(binxng)(binxng)或热变性或热变性(binxng)(binxng)使双链使双链DNADNA变为单链，能够进行双向测序；变为单链，能够进行双向测序；用用M13M13载体制备单链载体制备单链DNAM13DNAM13载体是根据复制型载体是根据复制型M13M13基因组改进的基因组改进的双链双链DNADNA，可以和质粒一样进行操作，用它感染宿主菌可产生单链，可以和质粒一样进行操作，用它感染宿主菌可产生单链模板，但只能制备小片段模板，但只能制备小片段DNADNA；第63页/共118页第六十三页，共119页。用噬菌粒（用噬菌粒（phagemidphagemid）制备单链）

50、制备单链DNADNA噬菌粒含有两个复制起噬菌粒含有两个复制起始位点，一个为大肠杆菌质粒起始位点，一个是来自始位点，一个为大肠杆菌质粒起始位点，一个是来自M13M13、fdfd等等单链单链DNADNA噬菌体基因组的复制起始点。当大肠杆菌中同时含有噬噬菌体基因组的复制起始点。当大肠杆菌中同时含有噬菌粒和辅助菌粒和辅助(fzh)(fzh)噬菌体时，因后者携带编码噬菌体复制酶及噬菌体时，因后者携带编码噬菌体复制酶及外壳蛋白的基因，因此可激活噬菌粒外壳蛋白的基因，因此可激活噬菌粒DNADNA复制，产生单链模板。复制，产生单链模板。PCRPCR产生单链模板产生单链模板两个引物中一个连接有很小的磁珠，可用两

51、个引物中一个连接有很小的磁珠，可用吸磁的办法从扩增产物中得到单链模板。不对称吸磁的办法从扩增产物中得到单链模板。不对称PCRPCR。第64页/共118页第六十四页，共119页。DNADNA聚合酶在延伸多聚核苷酸时只有聚合酶在延伸多聚核苷酸时只有(zhyu)3(zhyu)3 核苷酸核苷酸配对正确才能进行，这可能是为何完全单链模板在无引配对正确才能进行，这可能是为何完全单链模板在无引物时不能起始复制的原因。物时不能起始复制的原因。因为在缺少引物的情况下，聚合酶不能确定因为在缺少引物的情况下，聚合酶不能确定3 3 核苷酸核苷酸配对正确与否，无法确定下一步反应。配对正确与否，无法确定下一步反应。大肠杆

52、菌基因组复制时，每个冈崎片段长大肠杆菌基因组复制时，每个冈崎片段长1000-20001000-2000核核苷酸，约需苷酸，约需40004000个引物。个引物。第65页/共118页第六十五页，共119页。3 3，光点测序（，光点测序（pyrosequencingpyrosequencing）焦磷酸测序涉及焦磷酸测序涉及(shj)(shj)四种酶：四种酶：DNADNA聚合酶（聚合酶（DNA polymeraseDNA polymerase）硫酸化酶硫酸化酶(ATP sulfurylase)(ATP sulfurylase)荧光素酶荧光素酶(luciferase)(luciferase)双磷酸酶双磷

53、酸酶(apyrase). (apyrase). 第66页/共118页第六十六页，共119页。反应反应(fnyng)体系体系:DNA单链单链测序引物。测序引物。dNTP反应反应(fnyng)底物底物:APS (adenosine 5 phosphosulfate)荧光素荧光素(luciferin)第67页/共118页第六十七页，共119页。在每一轮测序反应中，只能加入在每一轮测序反应中，只能加入(jir)四种四种dNTP（dATP S，dTTP，dCTP，dGTP）之一）之一;如该如该dNTP与模板配对，聚合酶就可以催化该与模板配对，聚合酶就可以催化该dNTP掺入到引掺入到引物链中并释放焦磷酸基

54、团（物链中并释放焦磷酸基团（PPi）。）。第68页/共118页第六十八页，共119页。掺入的掺入的dNTP和释放和释放(shfng)的焦磷酸是等摩尔数目的的焦磷酸是等摩尔数目的. dATP S (deoxyadenosine alfa-thio triphosphate) 是是dATP的替代物的替代物;因为因为DNA聚合酶对聚合酶对dATP S的催化效率比对的催化效率比对dATP的催化的催化效率高，且效率高，且dATP S不是荧光素酶的底物。不是荧光素酶的底物。第69页/共118页第六十九页，共119页。硫酸化酶硫酸化酶 催化催化APS和和PPi形成形成ATP，ATP和焦磷酸的摩尔和焦磷酸的摩

55、尔数目是一致的。数目是一致的。ATP驱动荧光驱动荧光(ynggung)素酶介导的荧光素酶介导的荧光(ynggung)素素向氧化荧光向氧化荧光(ynggung)素素(oxyluciferin) 的转化的转化;氧化荧光氧化荧光(ynggung)素发出与素发出与ATP量成正比的可见光信量成正比的可见光信号。号。 第70页/共118页第七十页，共119页。光信号由光信号由CCD摄像机检测摄像机检测(jin c)。每个峰的高度每个峰的高度(光信号光信号)与反应中掺入的与反应中掺入的核苷酸数目成正比。核苷酸数目成正比。 第71页/共118页第七十一页，共119页。ATP和未掺入的和未掺入的dNTP由双磷酸

56、酶降解，淬灭光信号，并由双磷酸酶降解，淬灭光信号，并再生反应再生反应(fnyng)体系。体系。然后就可以加入下一种然后就可以加入下一种dNTP。 第72页/共118页第七十二页，共119页。每次只加入一种每次只加入一种dNTP。当反应液中发出亮点时，可知。当反应液中发出亮点时，可知核苷酸已掺入，仪器可以记下反应。核苷酸已掺入，仪器可以记下反应。如无亮点出现，表明该核苷酸不与模板链配对，则不会如无亮点出现，表明该核苷酸不与模板链配对，则不会出现记录。出现记录。连续快速地依次加入，周而复始，随着链的不断延伸，连续快速地依次加入，周而复始，随着链的不断延伸，相应相应(xingyng)的顺序也被阅读。

57、的顺序也被阅读。第73页/共118页第七十三页，共119页。4 4，DNADNA芯片测序芯片测序将各种排列顺序的寡聚核苷酸点播在面积很小的芯片上，每个点的将各种排列顺序的寡聚核苷酸点播在面积很小的芯片上，每个点的寡核苷酸在排列的方阵中都有指定的位置。寡核苷酸在排列的方阵中都有指定的位置。将待测的将待测的DNADNA分子与芯片温浴，凡是能杂交的寡聚核苷酸都会在确分子与芯片温浴，凡是能杂交的寡聚核苷酸都会在确定定(qudng)(qudng)的位置发出信号，然后根据获取的信息将寡聚核苷酸的位置发出信号，然后根据获取的信息将寡聚核苷酸的顺序进行对比组装，拼接成完整的顺序进行对比组装，拼接成完整DNAD

58、NA顺序。顺序。第74页/共118页第七十四页，共119页。根据统计，可测根据统计，可测DNADNA片段的长度片段的长度(chngd)(chngd)是芯片上排列的是芯片上排列的寡聚核苷酸数目的平方根。假如寡聚核苷酸的长度寡聚核苷酸数目的平方根。假如寡聚核苷酸的长度(chngd)(chngd)为为8 8个碱基，则其可能的排列顺序为个碱基，则其可能的排列顺序为48=6553648=65536，而可读的片段长度而可读的片段长度(chngd)(chngd)仅为仅为6553665536的平方根，等于的平方根，等于256bp256bp。即使一个芯片可容纳即使一个芯片可容纳10485761048576个不同

59、的个不同的1010碱基寡聚核苷酸，碱基寡聚核苷酸，可读片段长也仅为可读片段长也仅为1kb1kb。如果要完成如果要完成1Mb1Mb的测序，以的测序，以2020个寡聚核苷酸的数目计算，芯个寡聚核苷酸的数目计算，芯片需携带的组合数目将达片需携带的组合数目将达10121012，只有采用极微量的电子操，只有采用极微量的电子操作才能完成。作才能完成。 第75页/共118页第七十五页，共119页。5 5，自动化测序，自动化测序荧光标记物：用四种不同的荧光染料荧光标记物：用四种不同的荧光染料(rnlio)(rnlio)分别标记分别标记ddATPddATP、ddCTPddCTP、ddTTPddTTP和和ddGT

60、P-ddGTP-四色荧光标记。四色荧光标记。这这4 4种标记的种标记的ddNTPddNTP混合加入到一个反应中，聚合反应完成后，可以获得末端分混合加入到一个反应中，聚合反应完成后，可以获得末端分别带有别带有A A、C C、T T、G G标记的标记的DNADNA单链。电泳分离的单链单链。电泳分离的单链DNADNA条带通过监测仪时，条带通过监测仪时，发出不同颜色的荧光信号，由计算机读出碱基顺序。发出不同颜色的荧光信号，由计算机读出碱基顺序。自动测序的原理仍然为链终止法，但将自动测序的原理仍然为链终止法，但将4 4个反应合并为一个，在一个泳道中进个反应合并为一个，在一个泳道中进行电泳。行电泳。最早文