常见的生物化学与分子生物学实验

1、一动物组织蛋白质的提取【目的要求】1掌握动物组织蛋白质的提取方法。2了解动物组织蛋白质提取的原理。【实验原理】由于蛋白质种类很多，性质上的差异很大，即或是同类蛋白质因选用材料不同使用方法差别也很大，且又处于不同的体系中，因此不可能有一个固定的程序适用各类蛋白质的分离。但多数分离工作中的关键部分基本手段还是共同的，大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质。蛋白质在不同溶剂中溶解度的差异主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例，其次取决于这些基团的排列和偶极矩。故分子结构性质是不同

2、蛋白质溶解差异的内因。温度、pH、离子强度等是影响蛋白质溶解度的外界条件。提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用将细胞内蛋白质提取出来，并与其它不需要的物质分开。但动物材料中的蛋白质有些以可溶性的形式存在于体液如血浆、消化液等中可以不必经过提取直接进行分离。蛋白质中的角蛋白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白质，只需要适当的溶剂洗去可溶性的伴随物，如脂类、糖类以及其他可溶性蛋白质，最后剩下的就是不溶性蛋白质。蛋白质经细胞破碎后用水、稀盐酸及缓冲液等适当溶剂将蛋白质溶解出来，再用离心法除去不溶物即得粗提取液。【试剂器材】1实验小鼠20.9NaC13动物组织蛋白裂解缓冲液Tris50mM,NaC1150

3、mM，EDTA0.5mM，DTT1mM，TritonX-1001，去氧胆酸钠0.5，SDS0.14,PMSF/异丙醇储备液100mM,174mg/10m1于-20储存5-20储存的冰块。【操作步骤】1.颈椎脱白处死小鼠75酒精擦拭皮肤剪开腹部剪切肝脏组织称取0.6g置于含预冷0.9NaC16mL的平皿中。2.在平皿中剪碎肝脏组织并转移到匀浆器中。3在预冷的裂解缓冲液中添加PMSF/异丙醇储备液20?L/2mL。4迅速将2mL预冷的裂解缓冲液加入匀浆器中冰浴条件下充分研磨。5将组织研磨液转移到1.5mL的离心管中于4离心14000rpml0min。26离心完毕吸取上清液转移至一新的1.5ml离心

4、管中即为组织蛋白粗提取液。7所获蛋白提取液可保存于-20用于后续实验或用考马斯亮蓝等方法进行蛋白质浓度测定后保存备用。【注意事项】在整个制备过程中使组织始终处于冰浴状态以防蛋白质的降解。实验二蛋白质的定量Bradford法【目的要求】掌握考马斯亮蓝CoomassieBrilliantBlue法测定蛋白质含量的原理和方法。【实验原理】考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度是利用蛋白质与染料结合的原理定量测定微量蛋白质浓度具有快速、灵敏的特点。考马斯亮蓝G-250存在两种不同的颜色形式红色和蓝色。当染料与蛋白质结合后由红色转变成蓝色形式。蛋白质与G250的结合是通过范德华力实现的，并且在一定浓度范围内二者的结

5、合显色符合朗伯-比尔定律。结合后的产物在595nm处具有最大吸收峰，通过对溶液的光吸收测定，可获得与其结合蛋白质的量。【试剂器材】1考马斯亮蓝试剂考马斯亮蓝G-250100mg溶于25mL甲醇中加入800mL蒸馏水再加入100mL85磷酸，用蒸馏水稀释至1000mL滤纸过滤。2标准蛋白质溶液lmg/mL牛血清白蛋白lOOmg加0.9NaCl至100mL。3试管及试管架吸管。4.比色计。【操作步骤】一、标准曲线的制备取5支试管编号按下表操作编号1号液、2号液、3号液、4号液、5号液、标准蛋白质溶液、OmL、0.20、40.60.81.01mg/mL、0.9NaClmL、0.80.60.40.2蛋

6、白质浓度200、400、600、800、1000ug/mL。另取6支试管编号为05按下表操作编号012345，1号液2号液3号液4号液5号液不同浓度蛋白质溶液mL0.10.10.10.10.10.9NaCImL0.1考马斯亮蓝试剂mL555555蛋白质含量ug0204060801003混匀各管室温下静置10分钟，于595nm处进行比色。二、绘制标准曲线以A595nm为纵坐标，标准蛋白质含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。三、测定未知样品蛋白质浓度测定方法同上取适量未知样品使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的A595nm值在标准曲线上查出其相当于标准蛋白质的量从而计算出未知样品的蛋白

7、质浓度。【注意事项】1在考马斯亮蓝试剂加入后的520分钟内测定光吸收因为在此段时间内颜色最稳定。2测定中蛋白一染料复合物会有少量吸附于比色杯壁上实验证明此复合物的吸附量是可以忽略的测定后可用乙醇将比色杯洗干净。实验三SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳【目的要求】1.了解并掌握SDS-PAGE电泳原理及方法。2掌握垂直板电泳的操作方法。【实验原理】十二烷基硫酸钠SDS-聚丙烯酰胺凝胶PAGE电泳，可根据蛋白质分子大小的差别分离蛋白质，并可测定蛋白质的相对分子量，其原理主要与电泳过程中存在的特殊物理效应有关1 凝胶的分子筛效应，聚丙烯酰胺凝胶是在催化剂的作用下聚合而成的具有网状立体结构的微孔凝胶蛋白质颗粒

8、，在电场中通过此凝胶时会受到阻碍。大分子蛋白质受到的阻力大，电泳速度小，而小分子蛋白质受到的阻力小，移动快。因而最终在凝胶中得以分离。2电荷效应，SDS是一种表面活性剂，在蛋白样品和PAGE凝胶中加入SDS则能与蛋白质分子上的疏水基团结合，使蛋白质表面覆盖一层SDS分子。由于十二烷基硫酸根带有大量负电荷，且电荷量远远超过蛋白质分子原有的带电量，因而掩盖了蛋白质分子本身的电荷差别，使各种SDS蛋白质复合物都带有均等密度的负电荷，分子之间的电荷差异消失。3变性效应，SDS同时还破坏了蛋白质中的非共价键，导致蛋白质变性，使SDS蛋白质复合物在溶液中呈现相似的形状。因此蛋白质在SDSPAGE凝胶中的电

9、泳迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而主要取决于分子量的大小在进行SDSPAGE电泳时同时使用蛋白质分子量标准样品，则可以在电泳完毕后根据标准分子量大小得知样品蛋白质的相对分子量。4凝胶对样品的浓缩效应SDSPAGE使用一种不连续的缓冲系统即分为低浓度的浓缩胶和较高浓度的分离胶，配制这两种凝胶所用缓冲液的pH值和离子强度也不相同。电泳时样品中的SDS蛋白质复合物首先经过浓缩胶，体积得到极大的浓缩，然后再经过分离胶被分离。SDSPAGE凝胶已经成为实验室常用的蛋白质分离方法，通常被用于蛋白质制品纯度的鉴定和蛋白质分子量的测定。【试剂器材】1,30凝胶贮备液，称取30g丙烯酰胺和NNV亚甲双

10、丙烯酰胺0.8g，用去离子水配制成100ml的溶液，过滤贮存于棕色瓶中，4冰箱保存。2,10凝胶贮备液，称取10g丙烯酰胺和NN-亚甲双丙烯酰胺0.5g，用去离子水配制成100ml的溶液，过滤贮存于棕色瓶中4冰箱保存。3，10SDS用去离子水配制贮存于室温中。4,ITEMED，NNNN-四甲基乙二胺。5,10过硫酸铵用去离子水在临用前配制。6,Tris-甘氨酸电泳缓冲液pH8.3Tris6.0g甘氨酸28.8g10SDS溶液10ml用蒸馏水定容至1000ml。7，1.5mol/LpH8.8Tris-HC1缓冲液称取Tris1。8, 1.5g加适量蒸馏水溶解用浓HCI调节pH值至&8,加蒸馏水至

11、1000ml。0.5mol/L、pH6.8Tris-HC1缓冲液，称取Tris60.6g加500ml蒸馏水溶解用浓HC1调节pH值至6.8加蒸馏水至1000ml。9, 0.05mol/LpH8.0Tris-HCl缓冲液称取Tris6.1g加500ml蒸馏水溶解用浓HCl调节pH值至8.0加蒸馏水至1000ml。10, 2样品缓冲液蔗糖4g溴酚蓝2mg10SDS溶液2ml5卩巯基乙醇0.5ml0.05mol/LTris-HClpH8.02ml用蒸馏水定容至10.0ml11, 0.25考马斯亮蓝R250将2.5g考马斯亮蓝R250溶解于450ml甲醇中再加入450ml蒸馏水和100ml冰乙酸混匀过

12、滤除去颗粒物质。12, 洗脱液将50ml甲醇和75ml冰乙酸溶解于875ml蒸馏水中混匀。13, 预染蛋白质分子量标准：117kD、90kD、49kD、35kD、26kD、19kD共6种蛋白质14, 电泳槽、电泳仪、扫描仪、染色缸、摇床、一次性手套、微量加样器等。操作步骤】1 制备凝胶1准备玻璃板洗净、晾干。按电泳槽使用说明装好按下表配制12分离胶溶液5和5浓缩胶溶液表3-1浓缩胶与分离胶的配制溶液成分12分离胶溶液ml5浓缩胶溶液ml30凝胶贮备液4.010凝胶贮备液2.51.5mol/LpH8.8Tris-HC12.5，0.5mo/LpH6.8Tris-HCl1.25，10SDS0.1，0

13、.051TEMED0.8，0.4蒸馏水2.50.7510过硫酸铵0.10.05总体积10.05.02小心将分离胶注入准备好的玻璃间隙中并为浓缩胶留有空间。轻轻在顶层加入几毫升去离子水以阻止空气中的氧对凝胶聚合的抑制作用。3凝胶聚合后倒掉上层水用滤纸吸干凝胶顶端的水。4按表3-1配制浓缩胶注入分离胶上端插入梳子应小心避免产生气泡。2点样1待测蛋白样品的制备若样品为水溶液且蛋白质含量大于10mg/ml可将待测液与样品缓冲液等体积混匀100加热3min。2 浓缩胶聚合后拔去梳子将凝胶放入电泳槽中在上、下槽中加入电泳缓冲液3将样品混合液、标准蛋白按次序加入梳孔中。3电泳起始电压为8V/cm当染料进入分

14、离胶后将电压调至15V/cm继续电泳至溴酚蓝到达分离胶底部关闭电源。4 染色取下凝胶将凝胶浸泡于考马斯亮蓝染色液中在摇床上室温缓慢摇动30-60min。5 脱色换洗脱液于摇床上室温缓慢摇动12小时其间更换12次洗脱液。洗脱后的凝胶可以照像或干燥也可置于含有20甘油的水中密闭保存。【注意事项】1SDS-PAGE电泳要求样品的离子强度尽量要低如果离子强度过高应经透析或离子交换除盐后再进行电泳。2 丙烯酰胺试剂是一种神经毒素可通过皮肤吸收会因多次积蓄而中毒。操作时应极其小心需要带一次性手套。3 上样量以1015ul为宜如果样品蛋白含量过少为保证区带清晰可增加上样量6同时应将样品缓冲液浓度提高二倍或更

15、高。4 溴酚蓝染料是指示剂为电泳时可见的迁移标志物。5 凝胶聚合的时间与温度有关夏天聚合快可置于冰浴中减慢聚合冬天室温低可放入温箱中加快聚合。实验四蛋白质转印实验半干式【目的要求】1掌握半干式蛋白质转印技术的基本操作。2掌握蛋白质转印后的检测方法。【实验原理】蛋白质印迹Westernblotting是将蛋白质电泳分离技术与免疫标记技术结合所形成的一种鉴定特异性抗原的方法。蛋白质转印应先将含某抗原的蛋白混合物进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶SDS-PAGE电泳使各种蛋白成分根据分子量的不同分离开来再通过电转移将各种蛋白成分转印到硝酸纤维素膜NC或PVDF膜上通过特异试剂抗体作为探针与膜上的相应抗原发生

16、结合再与酶标记的抗Ig抗体结合洗涤后加入底物进行显色。根据显色条带的位置和深浅可以对抗原及其分子量或相对含量进行检测。蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种优点可检测到低至1-5ng的靶蛋白。本实验的主要目的是采用半干式电转移将SDS-PAGE凝胶电泳分离后的蛋白质从凝胶转移至固相支持材料上。裁剪与凝胶一样大小的硝酸纤维素膜用去离子水浸湿后再浸入转移缓冲液内随后取出进行转移半干式电转移在室温操作所需时间较短将凝胶及与之相贴的硝酸纤维素膜夹于事先用转移缓冲液浸泡过的滤纸之间平放在电转仪上负极在上正极在下凝胶在阴极端薄膜在阳极端转移方向从阴极到阳极根据

17、凝胶面积设置电流室温下进行转移转移结束取出薄膜丽春红染色检测转印效果。【试剂器材】1半干式电泳转印槽2硝酸纤维素膜3滤纸4转移电泳仪5培养皿6万向旋转摇床7转印缓冲液【操作步骤】1将电泳后的SDSPAGE凝胶浸在转印缓冲液中洗10min。2 去掉浓缩胶测量剩余胶的尺寸大小。3 剪1张和胶大小一致的硝酸纤维素膜，用铅笔在膜的右下角做一个标记用于定位。剪6张和胶大小一致的滤纸，尺寸一定不能大于胶的尺寸，否则多出的部分会在胶的边缘接触形成短路导致转移不充分。4 将膜及滤纸在转印缓冲液中浸润10min。5 将3张湿滤纸放到半干电转仪的底部平板电极上负极，然后依次放置胶、硝酸纤维素膜、滤纸3张注意堆放整

18、齐同时注意每层之间避免气泡存在，一般可用试管碾压赶走气泡，注意一旦胶和膜接触位于胶表面的蛋白就会结合到膜上，所以胶一定要一次成功，不要试图调整胶的位置，否则蛋白质色带可能会印上去最后产生重迭影像。6 待所有的膜和胶都放好后，盖上转印仪的上盖，让上部的平板电极压紧由滤纸、膜、胶形成的三明治结构，注意正负极，转印结束后才可以打开上盖。7连接转移电泳仪电流通常设为lmA/cm2左右。8cmX7cm的胶通常使用100mA恒流转移。大胶必须限制电流在0.8mA/cm2防止电流过大产生过多热量影响转印。转印时间如下表所示。8转印结束取出转印三明治打开后依次取出转印膜及凝胶。9将转印膜浸入丽春红染色液中观察

19、是否有红色蛋白条带出现转印后的凝胶可以进行考马斯亮蓝染色看有无蛋白质残留若电泳时加有预染标准蛋白质marker则可在转印膜上看到相应色带帮助确定转印成功并可评估转印效率。10若继续进行免疫杂交实验则用去离子水漂洗转印膜后可进行封闭。【注意事项】1.不要切去胶的一角以作标记因为这样容易导致短路或转移不充分。尽可能在电泳结束后就进行转印防止样品在胶内弥散开来。2. 丙烯酰胺浓度越低蛋白越容易转移下来。所以应选择可以分离蛋白最低浓度的凝胶进行电泳。梯度胶适用于转印一系列不同大小的蛋白因为凝胶的孔与不同大小的蛋白匹配良好。3. 蛋白质结合到硝酸纤维素膜上主要是通过疏水键对于常规使用效果非常好。但对于小

20、的多肽建议使用小孔径0.2um的膜。表4-1转印时间和蛋白分子量的关系分子量MW转印时间1t20kDa30分钟20kDa80kDa60分钟gt80kDa90分钟以8X7cm的迷你胶在100mA恒流的条件为例84. PVDF膜比硝酸纤维素膜更疏水在转印过程中结合蛋白更紧密可以耐受更多的SDS。目前PVDF膜一般比硝酸纤维素膜需要更严谨的封闭条件适用于蛋白测序。尼龙膜通过疏水和静电相互作用结合其SDS耐受度甚至高于PVDF膜但也需要更严谨的圭寸闭条件主要建议用于Northern和Southern杂交。实验五质粒DNA的提取碱裂解法【目的要求】1掌握碱裂解法制备质粒DNA的原理和方法进一步认识质粒D

21、NA的性质。2初步掌握分子克隆基本操作技术。【实验原理】质粒plasmid是能在染色体外自我复制的稳定共生型遗传单位主要存在于细菌、放线菌、真菌和某些动植物细胞中。它能在细菌中垂直遗传且保持稳定的拷贝数赋予宿主细胞某些特殊的表型。迄今为止从细菌中分离得到的质粒都是双链闭合环状DNA分子大小为lkb200kb。在基因工程研究中质粒是最常用的一种基因克隆载体用于运载外源基因进入宿主细胞。因此质粒DNA的提取和纯化是分子生物学技术中的一项基础工作。质粒DNA提取的关键是要与细菌染色质DNA分开。常用的提取方法有煮沸法、碱裂解法、去污剂法、有机溶剂法和溶菌酶法等不同方法各有利弊应根据不同质粒的性质、不

22、同宿主菌的特性及后继的纯化方法等多种因素综合加以选择。一般以碱裂解法最为常用因为它对细菌的裂解完全对染色质DNA和蛋白质的变性充分因而所提取的质粒DNA产量高、纯度高。但如果碱变性时间过长有可能会导致质粒DNA变性导致随后的内切酶酶切困难。碱裂解法提取质粒DNA的主要原理和步骤是1 接种含质粒的单个菌落到培养基中过夜培养。随着细菌的生长质粒DNA也随之自主复制。必要时可以在细菌生长后期在培养基中适量加入氯霉素以抑制宿主细胞的蛋白质合成和染色质DNA的复制细菌的数量不再增加而质粒DNA的复制基本不受影响从而大量扩增质粒DNA的拷贝数。2 离心收集细菌。3 加入强碱溶液裂解菌体必要时可以适量加入溶

23、菌酶。此时大分子量线状的细菌染色质DNA和蛋白质发生变性而闭合环状的质粒DNA多数仍不变性处于自然状态。4 几分钟后加入中和液将pH值调至中性。在高盐浓度条件下大部分染色质DNA与蛋白质不能复性交连成不溶性网状结构在去污剂SDS的作用下形成絮状沉淀。而质粒DNA分子量小且为闭合环状结构少数变性的质粒DNA也能够迅速复性呈溶解状态。95离心去除大部分细胞碎片、染色质DNA、RNA和蛋白质。质粒DNA保留在上清中。6 最后再用RNA酶消化酚/氯仿抽提、透析和乙醇或异丙醇沉淀等方法进一步去除残余蛋白质和核酸纯化质粒DNA。【试剂器材】1LB培养基蛋白胨10g酵母抽提液5gNaC110g加蒸馏水至lOOOmL用NaOH调pH至7.5高压蒸汽消毒20min。21号液50mmo1/L葡萄糖25mmo1/LTris-ClpH&010mmo1/LEDTA必要时在使用前加溶菌酶4mg/mL3I号液0.2mol/LNaOH含1SDSII号液必须在实验时新鲜配制4I号液