仪器分析第4讲 高效液相色谱法

1、第三章 高效液相色谱分析高效液相色谱分析High Performance Liquid ChromatographyHigh Performance Liquid Chromatography (HPLC)希腊语chroma（色彩） graphos（图谱）俄语德语Chromatographie英语Chromatography液相色谱法是指流流动动相相为为液体液体的色谱技术 u1960年代，由于气相色谱对高沸点有机物分析的局限性，年代，由于气相色谱对高沸点有机物分析的局限性，为了分离为了分离蛋白质、核酸蛋白质、核酸等不易汽化的大分子物质，气相等不易汽化的大分子物质，气相色谱的理论和方法被重新引入

2、经典液相色谱。色谱的理论和方法被重新引入经典液相色谱。u1960年代末年代末科克兰、哈伯、荷瓦斯、莆黑斯、里普斯克科克兰、哈伯、荷瓦斯、莆黑斯、里普斯克等人开发了世界上第一台高效液相色谱仪，开启了高效等人开发了世界上第一台高效液相色谱仪，开启了高效液相色谱的时代。液相色谱的时代。 u1971年科克兰等人出版了年科克兰等人出版了液相色谱的现代实践液相色谱的现代实践一一书，标志着高效液相色谱法（书，标志着高效液相色谱法（HPLC）正式建立。）正式建立。高效液相色谱法与经典液相色谱法的比较高效液相色谱法与经典液相色谱法的比较 经典液相色谱法经典液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法粒径粒径(m)75

3、-6003-50（常用（常用5-10）柱前压力柱前压力(atm)0.01-1.020-300分析时间分析时间(h)1-200.05-1.0色谱柱长度色谱柱长度(cm)50-2002-30柱效柱效(块块/m)2-50104-105样品用量样品用量(g)1-1010-6-10-2 GCHPLC应用范围应用范围热稳定、低沸点的热稳定、低沸点的物质物质热不稳定、高沸点、热不稳定、高沸点、离子型的物质离子型的物质热力学理论热力学理论较成熟较成熟正在发展中正在发展中分析成本分析成本低低高高分离能力分离能力与柱的类型有关与柱的类型有关较高较高约约80%80%的药物都能用高效液相色谱进行分离和纯化。特别是手性

4、的药物都能用高效液相色谱进行分离和纯化。特别是手性药物的分离分析。药物的分离分析。 食品本身组成食品本身组成, , 特别是营养成分，如糖、有机酸、维生素、蛋白特别是营养成分，如糖、有机酸、维生素、蛋白质、氨基酸、脂肪的分析；质、氨基酸、脂肪的分析； 食品添加剂，如防腐剂、抗氧化剂、合成色素、甜味剂和保鲜食品添加剂，如防腐剂、抗氧化剂、合成色素、甜味剂和保鲜化学物质的分析；化学物质的分析； 食品污染物，如农药残余和黄曲霉素等的分析。食品污染物，如农药残余和黄曲霉素等的分析。要制备或提取一些高纯化合物，如新合成化合物的结构鉴定，药要制备或提取一些高纯化合物，如新合成化合物的结构鉴定，药物的生物和毒

5、理试验。物的生物和毒理试验。人参、西洋参与三七的鉴别人参、西洋参与三七的鉴别min1020304050mAU050100150200 DAD1 C, Sig=203,16 Ref=360,100 (H:1DATAHUPINGGSSIDE14.D)min1020304050mAU05101520253035 DAD1 C, Sig=203,16 Ref=360,100 (H:1DATAHUPINGGSSIDE15.D)min1020304050mAU020406080100 DAD1 C, Sig=203,16 Ref=360,100 (H:1DATAHUPINGGSSIDE16.D)R1Rg1

6、ReRb1RdABCRg1Rg1ReReRfRb1RcRb2RdRc三种药材的三种药材的HPLC指纹图谱指纹图谱uDdCDdCDdCuDCdHsfsmpsmpmmdp)(2222由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用用100m的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见；的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见；现采用现采用510m的小颗粒，比表面积和柱容量都很大。的小颗粒，比表面积和柱容量都很大。基体是基体是3040m实心玻璃实心玻璃微球，表面附着一层厚度为微球，表面附着一层厚度为12m的多孔活性材料，如的多孔活性材料，如硅胶、氧化

7、铝等。硅胶、氧化铝等。表面积小，柱容量低。表面积小，柱容量低。固定相按照空隙深度分类：固定相按照空隙深度分类：SiOOHSiOOHSiOOH固定相表面C H SiCl18 373SiOOSiOOSiOO固定相表面C H18 37Si常用固定相 表3-2在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。例如，采用正相液在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。例如，采用正相液- -液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加

8、其中的极性溶剂，使保留时间缩短。极性溶剂，使保留时间缩短。高效液相色谱仪高效液相色谱仪 六通进样阀结构示意图进样阀进样阀柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒度柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒度的填料（的填料（20m）一般采用匀浆填充法装柱，先将）一般采用匀浆填充法装柱，先将填料调成匀浆，然后在高压泵作用下，快速将其压填料调成匀浆，然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内，经冲洗后，即可备用。入装有洗脱液的色谱柱内，经冲洗后，即可备用。n紫外检测器n荧光检测器n示差折光检测器n电导检测器 除紫外检测器之外应用最多的检测器； 可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。

9、差值与浓度呈正比；通用型检测器通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）； 灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱； 偏转式、反射式和干涉型三种型型对多环芳烃，维生素对多环芳烃，维生素B、黄、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应基酸、甾类化合物等有响应。离子色谱法中使用最广的检测器离子色谱法中使用最广的检测器原理：根据物质在某些介质中解离后所产生的电导变化来进行测定3-7 HPLC分离类型的选择分离类型的选择n选择合适的液相色谱分离类型选择合适的液相色谱分离类型 了解分析对象了解分析对象n要分析的组分的大致浓度要分析的组分的大致浓度

10、n干扰物质干扰物质 n试样的性质试样的性质化学结构化学结构分子量分子量极性、酸碱性极性、酸碱性溶解度参数溶解度参数溶于水溶于水排阻色谱，水为流动相排阻色谱，水为流动相相对分子质量相对分子质量2000不溶于水不溶于水排阻色谱，非水流动相排阻色谱，非水流动相同系物同系物键合相色谱键合相色谱不溶于水不溶于水异构体异构体液固色谱液固色谱样品样品分子大小差异分子大小差异排阻色谱排阻色谱反相键合相色谱反相键合相色谱相对分子质量相对分子质量溶于水，不离解溶于水，不离解2000排阻色谱，水为流动相排阻色谱，水为流动相碱碱阳离子色谱阳离子色谱溶于水，可离解溶于水，可离解酸酸阴离子色谱阴离子色谱溶于水，离子与非离子溶于水，离子与非离子反相离子对色谱反相离子对色谱 n选择合适的分析条件选择合适的分析条件n色谱柱色谱柱n流动相流动相n检测器的种类及条件（波长等）检测器的种类及条件（波长等）n样品的样品的预处理预处理方法方法1. 1. 环境中有机氯农药残留量分析环境中有机氯农药残留量分析固定相：薄壳型硅胶固定相：薄壳型硅胶(3750 m)流动相：正己烷流动相：正己烷流流速：速：1.5mL/min色谱柱：色谱柱：50cm 2.5mm(内径内径)检测器：