第十五章 微生物酶的生产

1、u了解酶与酶制剂的概念、酶的催化特点及影响酶催化的因素；了解酶的合成原理；了解青霉素酰化酶、-半乳糖苷酶、天冬酰胺酶的生产；u熟悉酶的发酵生产工艺流程；u掌握酶的发酵工艺条件控制、影响产酶的因素、酶的提取和精制方法和工艺要求。第一节 概述u认识酶认识酶 酶是细胞原生质合成的一类具有高度催化活性的特殊蛋白质，来源于生物体，人们称它为“生物催化剂”，能够使生物体内发生各种各样的化学变化。 通过采取适当的理化方法，将酶从生物组织或细胞以及发酵液中提取出来，加工成具有一定纯度标准的生化制品，称酶制剂。 酶这类生物催化剂，除了具有一般化学催化剂的特性外，还有其独特的优点：催化效率高；专一性强；作用条件温

2、和等。温度pH值激活剂和抑制剂蛋白水解酶影响酶催化因素第二节 合成原理u酶的生物合成模式酶的生物合成模式同步合成型同步合成型 又称为生长偶联型。属于这一类型的酶，其生物合成可以诱导，但不受分解代谢物和反应产物阻遏。而且去除诱导物或细胞进入平衡期后，酶的合成立即停止。同步合成型酶，酶的合成与细胞生长同步进行，细胞进入对数生长期，酶大量产生，细胞生长进入平衡期后酶的合成随着停止。中期合成期中期合成期 酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而在细胞进入平衡期后，酶的合成随着停止。该类酶的特点是，其合成受反馈阻遏。延续合成型延续合成型 酶的合成伴随着细胞的生长而开始，但在细胞进入平衡期后，酶还可以延续合

3、成较长的时间，该类酶可受诱导，但不受分解代谢物和产物阻遏。滞后合成型滞后合成型 只有当细胞生长进入平衡期后，酶才开始合成并大量积累，该类酶在对数生长期不合成，可能是由于受到分解代谢物阻遏作用的影响，当阻遏解除后，酶才开始大量合成。u微生物酶合成的调节与控制微生物酶合成的调节与控制第三节 酶的生产工艺过程u酶的发酵生产工艺过程酶的发酵生产工艺过程 包括：原料处理，水解糖制备；种子的扩大培养；无菌空气的制备；发酵控制；成品提取、精制等过程微生物蛋白酶发酵生产工艺发酵培养中的工艺控制发酵培养中的工艺控制培养基成分及其控制培养基成分及其控制 菌体培养过程中基质主要控制以下成分：碳源、氮源、碳氮比、无机

4、盐、生长因子、产酶促进剂等。温度的影响及控制温度的影响及控制 酶生产过程中，为了有利于菌体的生长和酶的合成，可采用阶段控制温度，即在生长期，控制生长的最适温度，在酶的合成期采用生产的最适温度，但由于微生物合成酶的模式不同，所以应根据合成模式，来控制适宜的温度。pH值对酶生产的影响及控制值对酶生产的影响及控制 酶生产适宜的pH值通常与酶反应的最适pH值相接近。但酶反应的最适pH值对某些酶来说可能是最不稳定的，应针对不同情况进行控制。酶生产的pH值控制，一般根据酶生产所需求的pH值确定培养基的碳氮比和初始pH值，在一定通气搅拌条件的配合下，使培养过程的pH值变化适合酶生产的要求。但是，也有在培养基

5、中添加缓冲剂使其具有缓冲能力以维持一定pH值的；也有在培养过程中当培养液pH值过高时添加糖或淀粉来调节，pH值过低时用通氨或加大通气量来调节的。此外，也有用补料来控制培养基的碳氮比与pH值。溶解氧对酶生产的影响溶解氧对酶生产的影响 酶生产所用的菌体一般都是需氧微生物，培养时都需要通风搅拌，但培养基中溶氧的浓度因菌种而异。泡沫和消沫剂泡沫和消沫剂 发酵过程中，泡沫的存在会阻碍CO2排除，直接影响氧的溶解，因而将影响微生物的生长和产物的形成。采取消泡措施加以控制。添加诱导剂和抑制剂添加诱导剂和抑制剂 某些诱导酶，在培养基中不存在诱导物质时，酶的合成便受到阻碍，而当有底物或类似物存在时，酶的合成就顺

6、利进行。u酶的提取和精制工艺过程酶的提取和精制工艺过程酶的提取和精制方法酶的提取和精制方法酶的提取酶的提取 提取过程大致分为发酵液的预处理、酶的沉淀或吸附和解脱几个步骤。主要方法有盐析法和有机溶剂沉淀法，也有采用单宁沉淀法和吸附法的。酶生产的精制酶生产的精制 酶生产的精制过程，主要有除杂、脱盐、浓缩、结晶、干燥等过程。杂质的除去杂质的除去 酶提取液中，除所需酶外，还含有大量的杂蛋白、多糖、脂类和核酸等，为了进一步纯化，可用下列方法除去：调pH值和加热沉淀法、蛋白质表面变性法、选择性变性法、降解或沉淀核酸法 、利用结合底物保护法除去杂蛋白 脱盐脱盐 酶的提纯以及酶的性质研究中，常常需要脱盐。最常

7、用的脱盐方法是透析和凝胶过滤。浓缩浓缩 酶的浓缩方法很多，有冷冻干燥、离子交换、超滤、凝胶吸水、聚乙二醇吸水等。 冷冻干燥法是最有效的方法，它可将酶液制成干粉。这种方法既能使酶浓缩，酶又不易变性，便于长期保存。酶的结晶酶的结晶 把酶提纯到一定纯度以后(通常纯度应达50以上)，可进行结晶，伴随着结晶的形成，酶的纯度经常有一定程度的提高。 酶的结晶方法主要是缓慢地改变酶蛋白的溶解度，使其略处于过饱和状态。常用改变酶溶解度的方法有以下几种：盐析法、有机溶剂法、复合结晶法、透析平衡法、等电点法等。 结晶条件的选择。在进行酶的结晶时要选择一定条件与相应的结晶方法配合。这不仅为了能够得到结晶，也是为了保证

8、不引起酶活力丧失。影响酶结晶主要有：酶液的纯度、酶的浓度、温度、时间、pH值、金属离子、晶种、结晶器皿处理等。蛋白酶提取和精制工艺蛋白酶提取和精制工艺 工业用的粗制蛋白酶用盐析法提取。将培养物滤去菌体，用盐酸调节pH值至4.0以下，加入硫酸铵使浓度达55，静置过夜，去上清液，将沉淀通过压滤除母液，于40干燥24h，烘干后进行磨粉与包装，即可得工业用粗酶制品。 医用或啤酒工业用酶，需进一步精制，其方法是：将压滤所得的酶泥溶于 pH2.5的0.005molL乳酸缓冲液中，用脱色树脂脱色(收率93)，用真空薄膜蒸发器于40浓缩2倍以上(收率90)，再通过离子交换树脂(732、701树脂混合床)脱盐

9、(收率90)、喷雾干燥或冷冻干燥、磨粉，即可得淡黄色乃至乳白色的粉状酶制品。第四节 其他酶的生产天冬酰胺酶的生产天冬酰胺酶的生产 斜面培养基接种后于37培养24小时后，取20ml菌种培养基于100ml三角瓶中（母瓶），灭菌后，接种一环斜面菌种，37振荡培养8小时后，再扩大至2L培养瓶（子瓶），培养基装量为400ml，接种量为1%1.5%，37振荡培养16小时后，扩大至1000L种子罐，培养基装量为600L，灭菌后接种量1%，37通风培养4小时后，得种子培养液。 将6m3发酵培养基加至10m3发酵罐中，灭菌后按8%接种量接种上述种子培养液，37通风培养6小时后，发酵结束，用高速管式离心机分离收集

10、菌体。 离心分离后的菌体于5下加入2倍体积（W/V）丙酮，搅拌均匀后，压滤，滤饼过筛后风干，得干菌体。按每kg干菌体加入15L，0.01mol/L，pH8.0硼酸缓冲液于37搅拌提取1.5小时后，降温至30，用5mol/L醋酸调pH4.34.5，压滤，收集滤液，于pH4.3下加入2倍体积（V/V）丙酮，搅拌均匀，放置34小时，倾出上清液，下层悬浮物离心收集沉淀。上清液回收丙酮，沉淀于5下真空干燥，得酶粗粉。 取上述粗粉加20倍体积（W/V）的0.3%的甘氨酸溶液，用2 mol/L NaOH溶液调pH8.8，7搅拌提取1.5小时后，离心除去沉淀，上清液于60加热半小时，冷却至5，离心除去沉淀，上清液滤清，于5下加入2倍体积（V/V）丙酮，搅拌均匀，放置34小时，离心收集沉淀。 用510倍体积（W/V）0.01mol/L，pH8.0硼酸缓冲液溶解沉淀，于5离心，倾出上清液即为L-天冬酰胺酶溶液。用2 mol/L NaOH溶液调pH8.8，离心除去沉淀，上清液用2mol/L盐酸调节pH7.7，加入50%聚乙二醇使其浓度达16%，于25静置45天，离心收集沉淀，用20倍体积（W/V）蒸馏水溶解，离心取上清液，于5下加入2倍体积（V/V）丙酮，搅拌均匀，放置34小时，离心收集沉淀，用510倍体积（W/V）0.05mol/L，pH6.4硼酸