分子生物学第9章

1、第九章第九章聚聚 合合 酶酶 链链 反反 应应 第一节第一节 PCR基本原理基本原理高温变性高温变性低温复性低温复性适温延伸适温延伸 高温变性高温变性：94左右，目的基因解链为单链，以作为扩增的模板； 低温复性低温复性：5560，一对特异性引物分别与模板3端互补结合； 适温延伸适温延伸：72，延伸反应； 每一循环使DNA分子扩增一倍，n次循环后，理论上DNA分子可扩增为2n。12345507295时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍聚合酶链反应的原理聚合酶

2、链反应的原理第二节第二节 PCR特点特点特异性强特异性强灵敏度高灵敏度高皮克皮克(pg=10(pg=10-12-12) )量级扩增到微克量级扩增到微克( (ugug=10=10-6-6) )水平水平能从能从100100万个细胞中检出一个靶细胞万个细胞中检出一个靶细胞病毒检测的灵敏度可达病毒检测的灵敏度可达3 3个个RFURFU，细菌为，细菌为3 3个细菌个细菌简便、快速简便、快速一次性加好反应液，一次性加好反应液，1 14 4 小时完成扩增小时完成扩增扩增产物一般用电泳分析扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提血液、体腔液

3、、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNADNA第三节第三节PCR体系组成和反应条件优化体系组成和反应条件优化 一、体系组成一、体系组成 DNADNA聚合酶聚合酶 引物（引物（PrimerPrimer） dNTPdNTP（原料）（原料） 目的目的DNADNA模板模板 缓冲液（缓冲液（BufferBuffer）(一一)DNA聚合酶聚合酶 (二二)引物引物 引物设计原则引物设计原则: :1 1引物长度引物长度 15-30nt15-30nt2 2引物组成引物组成 G/CG/C含量以含量以40%-60%40%-60%为宜为宜3 3引物结构引物结构 碱基随机分布、二级结构、引物二聚体，碱基随机分布、

4、二级结构、引物二聚体，33端不应有三端不应有三个连续的个连续的G/CG/C，55端可以修饰端可以修饰4 4引物特异性引物特异性 与其他序列的同源性一般与其他序列的同源性一般70%70%5 5引物浓度引物浓度 非特异性扩增，引物二聚体非特异性扩增，引物二聚体6 6引物质量引物质量 纯化纯化3引物设计常用软件主要有：lPrimer Premier 5.0 lOligo 6lprimer 3lThe Primer GeneratorlNet Primer (三三)dNTP 1 1应当根据目的应当根据目的DNADNA的长度和的长度和组成确定组成确定dNTPdNTP的浓度的浓度 2 2四种四种dNTPd

5、NTP要要等摩尔浓度等摩尔浓度配配制制 3 3dNTPdNTP的的质量质量也与扩增效率也与扩增效率有密切关系有密切关系(四四)模板模板 DNADNA或或RNARNA（先逆转录合成（先逆转录合成cDNAcDNA） 来源来源: :根据根据科学研究或临床检验科学研究或临床检验的需要，可以是临床标本的需要，可以是临床标本 ( (血液、尿液、羊水、分泌物等血液、尿液、羊水、分泌物等) )、药物标本、药物标本 ( (动植物细胞、动植物细胞、组织等组织等) )、法医标本、法医标本 ( (犯罪现场的血渍、精斑、毛发等犯罪现场的血渍、精斑、毛发等) )、病原体标本病原体标本 ( (病毒、细菌、真菌、支原体、衣原

6、体、立克病毒、细菌、真菌、支原体、衣原体、立克次体等次体等) )、考古标本、考古标本( (骨骸、毛发等骨骸、毛发等) ) 无论何种来源的标本，都应该进行无论何种来源的标本，都应该进行预处理预处理(五五)缓冲溶液缓冲溶液维持维持DNADNA聚合酶的活性和稳定性聚合酶的活性和稳定性1 1、pH=7pH=72 22 2、50mmol/L 50mmol/L KClKCl可以促进引物退火，但浓度过高会抑制酶可以促进引物退火，但浓度过高会抑制酶25mmol/L 25mmol/L (NH(NH4 4) )2 2SOSO4 4，SOSO4 4对金属离子有一定的结合力。对金属离子有一定的结合力。3 3、小牛血清

7、白蛋白或明胶小牛血清白蛋白或明胶可以维持酶活性，能保证可以维持酶活性，能保证PCRPCR的稳定性的稳定性4 4、甲酰胺或二甲基亚砜甲酰胺或二甲基亚砜有利于松解发夹结构等二级结构，促进有利于松解发夹结构等二级结构，促进引物退火引物退火5 5、Mg2+:Mg2+:影响酶活性及变性解链、引物退火、扩增效率、扩增特影响酶活性及变性解链、引物退火、扩增效率、扩增特异性等异性等二、条件优化二、条件优化 ( (一一) )反应温度和反应时间反应温度和反应时间1 1变性温度和时间变性温度和时间 95953030秒或秒或97 97 1515秒秒2 2退火温度和时间退火温度和时间 退火温度应当低于引物退火温度应当低

8、于引物TmTm值值3-5 3-5 ，通常为，通常为50-50-65 65 ，20-4020-40秒钟秒钟3 3延伸温度和时间延伸温度和时间 TaqDNATaqDNA聚合酶的最适温度为聚合酶的最适温度为75-80 75-80 ，72 72 ，1min1min ( (二二) )循环次数循环次数循环次数决定循环次数决定PCRPCR扩增效率扩增效率一般控制在一般控制在30-4030-40次次酶活性下降、酶活性下降、dNTPdNTP浓度下降等，会使反应进入平台期浓度下降等，会使反应进入平台期三、产物分析三、产物分析 ( (一一) )电泳分析电泳分析 ( (二二) )酶切分析酶切分析既能对既能对PCRPC

9、R产物进行鉴定，又能对靶基因进行分型产物进行鉴定，又能对靶基因进行分型 ( (三三) )杂交分析杂交分析检测检测PCRPCR产物特异性，是否存在变异产物特异性，是否存在变异 ( (四四) )序列分析序列分析检测检测PCRPCR产物特异性最可靠的方法产物特异性最可靠的方法第四节第四节 常用常用 PCR技术技术 一、逆转录一、逆转录PCR (RT-PCR) 一步法一步法: :逆转录和逆转录和PCRPCR在同一个反应体系中进行在同一个反应体系中进行 两步法两步法: :逆转录和逆转录和PCRPCR在两个反应体系中分开进行在两个反应体系中分开进行 引物很关键。引物很关键。 oligo(dToligo(d

10、T) )引物引物 特异性引物特异性引物 随机引物随机引物 逆转录逆转录PCRPCR可以与可以与DNADNA印迹法联合，分析扩增产物，从而分印迹法联合，分析扩增产物，从而分析样品中的析样品中的RNARNA含量，研究基因表达含量，研究基因表达 逆转录逆转录PCRPCR灵敏度较低，属于灵敏度较低，属于半定量分析半定量分析 二、实时定量二、实时定量PCR (Q-PCR)对荧光信号的实时检测来跟踪对荧光信号的实时检测来跟踪PCRPCR进程，标准曲线定量分析起始模板进程，标准曲线定量分析起始模板水平水平1 1实时定量实时定量PCRPCR探针探针 特异性荧光探针特异性荧光探针：荧光报告：荧光报告/ /淬灭基

11、团淬灭基团 EBEB或或SGSG作为荧光探针作为荧光探针2 2实时定量实时定量PCRPCR应用应用与逆转录联合可以定量分析与逆转录联合可以定量分析mRNAmRNA以研究基因表达以研究基因表达基础研究与临床诊断基础研究与临床诊断 3 3实时定量实时定量PCRPCR特点特点 PCRPCR高效性高效性、核酸分子杂交、核酸分子杂交特异性特异性、荧光技术、荧光技术高灵敏度高灵敏度和和可计量性可计量性、TaqDNATaqDNA聚合酶的聚合酶的外切酶活性外切酶活性封闭条件，没有污染，自动化程度高，多重反应封闭条件，没有污染，自动化程度高，多重反应定量原理定量原理确定初始模板的浓度 初始 DNA量越多, 荧光

12、达到某一值（域值）时所需要的循环数越少（Ct值） Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量荧光强度荧光强度-循环数曲线循环数曲线初始模板量对数初始模板量对数-C(T)循环数标准曲线循环数标准曲线10410310610510210循环阈值（循环阈值（CtCt）与初始模板含量）与初始模板含量 初始模板量越多，C(t)值越小 C(t)与初始模板浓度的对数值成线性关系荧光定量实时荧光定量实时PCR与普通与普通PCR的比较的比较 灵敏度高 灵敏的荧光检测较电泳检测灵敏度高 特异性高 使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合，提高了PCR反应的特异性 定量准确

13、全程监控，准确的算法进行定量 无需跑胶，自动化程度高4通道实时荧光定量通道实时荧光定量PCR仪仪荧光定量PCR仪是一种带有激发光源和荧光信号检测系统的PCR仪，通常配有电脑系统及相应的分析软件。荧光定量荧光定量 PCR仪仪三、修饰引物三、修饰引物PCR 对特定对特定DNADNA序列进行序列进行定向克隆定向克隆 、定点诱变、定点诱变 、体外转录、体外转录等等研究时，需要其末端带有研究时，需要其末端带有限制位点、突变序列、启动子限制位点、突变序列、启动子等等DNADNA元件，为此可以在元件，为此可以在PCRPCR引物的引物的55端加接端加接这些元件进行这些元件进行扩增，这就是修饰引物扩增，这就是修

14、饰引物PCRPCR 例如例如: :在引物在引物5 5，端加接限制位点，就可以用限制酶切割扩，端加接限制位点，就可以用限制酶切割扩增产物，形成黏端，从而与有互补黏端的载体增产物，形成黏端，从而与有互补黏端的载体DNADNA重组，重组，这就是克隆这就是克隆PCRPCR 克隆克隆PCRPCR克隆效率较高，并且如果给两个引物加接不同的克隆效率较高，并且如果给两个引物加接不同的限制位点，可以进行定向克隆限制位点，可以进行定向克隆四、等位基因特异性四、等位基因特异性PCR 等位基因特异性等位基因特异性PCR(AS-PCR)PCR(AS-PCR)用于检测用于检测点突变点突变 原理原理: :同时设计一个同时设

15、计一个正常引物对正常引物对和一个和一个突变引物突变引物对对 下游引物完全一样下游引物完全一样，上游引物上游引物33末端的碱基不末端的碱基不同同 两个两个PCRPCR体系体系，各加入一个引物对，各加入一个引物对 等位基因特异性等位基因特异性PCRPCR用于鉴定单核苷酸多态性用于鉴定单核苷酸多态性 (SNP)(SNP)五、五、PCR-RFLP 聚合酶链反应聚合酶链反应- -限制性片段长度多态性分析技术限制性片段长度多态性分析技术 (PCR-(PCR-RFLPRFLP) )是是PCRPCR技术与技术与RFRF分析的联合，即先用分析的联合，即先用PCRPCR将包含待测将包含待测多态性位点的多态性位点的DNADNA片段扩增出来，然后用识别该位点的限片段扩增出来，然后用识别该位点的限制酶切割，电泳分析其制酶切割，电泳分析其RFLPRFLP，判断是否存在突变，判断是否存在突变 PCR-RFLPPCR-