益智酵素(ZT-1)

1、抗老年痴呆新药ZT-1(益智酵素)的研究江苏擎天生物医药有限公司中国科学院上海药物研究所民间草药民间草药 Hup A天然高选择性乙酰天然高选择性乙酰胆碱酯酶抑制剂胆碱酯酶抑制剂 强效、高选择性强效、高选择性乙酰胆碱酯乙酰胆碱酯 酶酶抑制剂抑制剂 改善记忆障碍作用强改善记忆障碍作用强 作用时间长，口服吸收好作用时间长，口服吸收好 外周副作用很小外周副作用很小 ZT-1（益智酵素）：新一代治疗（益智酵素）：新一代治疗老年性痴呆症老年性痴呆症 的理想候选药的理想候选药第一部分第一部分 药学研究药学研究 原料药及其制剂的生产工艺研究原料药及其制剂的生产工艺研究 原料药及其制剂的质量研究和质量原料药及其

2、制剂的质量研究和质量 标标 准草案的制定准草案的制定 制剂的稳定性考察制剂的稳定性考察原料药的合成工艺研究原料药的合成工艺研究合成路线：o-Vanillin5-Cl-o-vanillin 1、合成工艺简单合成工艺简单 (一步反应，复结纯化一步反应，复结纯化) 2、条件温和、条件温和 (室温搅拌室温搅拌)3、收率稳定、收率稳定 ，Hup A 2.5g 得得 ZT-1（益智酵素）（益智酵素） 3.12g4、无三废问题、无三废问题 (大部分溶剂均能回收套用大部分溶剂均能回收套用)5、质量稳定、质量稳定 (二次复结晶即达二次复结晶即达98%以上以上)ZT-1（益智酵素）结构确证（益智酵素）结构确证,对

3、照品对照品 确证化学结构的方法确证化学结构的方法 理化常数理化常数 ；元素分析；元素分析； 红外吸收光谱（红外吸收光谱（IR） 紫外紫外-可见吸收光谱（可见吸收光谱（UV-VIS）；）； 核磁共振氢谱（核磁共振氢谱（1H NMR） 核磁共振碳谱（核磁共振碳谱（13C NMR）；）； 质谱（）质谱（） 单晶单晶X-射线衍射谱射线衍射谱 ； 热分析热分析 粉末粉末X-射线衍射射线衍射 ZT-1（益智酵素）（益智酵素） 对对 照照 品品 化化 学学 结结 构构 研研 究究益智酵素益智酵素制剂处方筛选制剂处方筛选及工艺研究及工艺研究 技术难点：主技术难点：主药剂量小，难药剂量小，难溶于水，对酸溶于水，

4、对酸碱和水分敏感碱和水分敏感。措施要点：以微晶纤措施要点：以微晶纤维为载体，制备固体维为载体，制备固体分散体，以无水乳糖分散体，以无水乳糖为主要辅料，控制操为主要辅料，控制操作环境的湿度。作环境的湿度。剂型：片剂剂型：片剂 原料质量标准研究原料质量标准研究1性状性状:外观外观 ;溶解度溶解度; 引湿性试验物理常数引湿性试验物理常数 2 鉴别鉴别: 呈色或沉淀反应呈色或沉淀反应;紫外吸收光谱紫外吸收光谱; 高效液相色谱法高效液相色谱法; 3. 纯度检查纯度检查:酸碱度酸碱度;水分水分;炽灼残渣炽灼残渣 重金属重金属;砷盐砷盐;有机溶剂残留量有机溶剂残留量 有关物质检查有关物质检查 4. 含量测定

5、含量测定原料质量标准研究原料质量标准研究1性状性状:外观外观 ;溶解度溶解度; 引湿性试验物理常数引湿性试验物理常数 2 鉴别鉴别: 呈色或沉淀反应呈色或沉淀反应;紫外吸收光谱紫外吸收光谱; 高效液相色谱法高效液相色谱法; 3. 纯度检查纯度检查:酸碱度酸碱度;水分水分;炽灼残渣炽灼残渣 重金属重金属;砷盐砷盐;有机溶剂残留量有机溶剂残留量 有关物质检查有关物质检查 4. 含量测定含量测定制剂质量标准研究制剂质量标准研究1. 性状性状:2. 鉴别鉴别:显色反应显色反应; 紫外吸收光谱紫外吸收光谱 高效液相色谱法高效液相色谱法3.检查检查: 崩解时限崩解时限; 重量差异重量差异; 含量均匀度含量

6、均匀度 溶出度溶出度; 有关物质有关物质4. 含量测定含量测定原料稳定性原料稳定性结论结论: ZT-1（益智酵素）原料药在光照、高温、高湿度等试验环境中基本稳定。除光光照和照和92.5的高湿度条件时降解，的高湿度条件时降解，产物（Hup A）仅在10天时略有增加外，其外观、熔点、含量与0天比较均无明显变化，提示本品基本稳定，应置干燥、凉暗处密封保应置干燥、凉暗处密封保存存。按此包装条件，在加速试验6个月及到申报时长期试验十二个月，本品其外观、本品其外观、熔点、含量、降解产物与熔点、含量、降解产物与0月比较均无明显月比较均无明显变化变化，提示本品在包装条件下稳定。制剂稳定性制剂稳定性 ZT-1片

7、片(益智酵素片益智酵素片)在光照、高温、高湿度等在光照、高温、高湿度等试验环境中均不稳定。试验环境中均不稳定。其外观、溶出度均无明显改变。而含量则下降，从100.3下降至82.3397.00，其中尤以92.5的高湿度条件最为明显，可下降至82.33；降解产物则明显增加，从1.3左右增加至4.1318.95, 提示本制剂应置干燥、凉暗应置干燥、凉暗处严封保存处严封保存。按此包装条件，在加速试验6个月及到申报时长期试验十二个月，本制剂除略有分解外，外观、溶出度和含量均无改变，说明本制剂在此包装条件下稳定稳定。原料药及其制剂的质量标准原料药及其制剂的质量标准 技术要点：技术要点：原料药纯度大于等于原

8、料药纯度大于等于98%98%；制剂含量均匀度、溶；制剂含量均匀度、溶出度的指标均符合药典有关要求。出度的指标均符合药典有关要求。建立反相高效液相色谱法进行纯度检查和含量测建立反相高效液相色谱法进行纯度检查和含量测定。定。质量标准（草案）及起草说明按药典格式已经撰写质量标准（草案）及起草说明按药典格式已经撰写完成。完成。第二部分第二部分 药效与毒理研究药效与毒理研究 主要药效学试验主要药效学试验 一般药理试验一般药理试验 急性毒性试验急性毒性试验 长期毒性试验长期毒性试验 致突变试验致突变试验 生殖毒性试验生殖毒性试验 药代动力学研究药代动力学研究主要药效学试验及结果主要药效学试验及结果 抑制胆

9、碱酯酶活性的作用抑制胆碱酯酶活性的作用 改善记忆功能作用改善记忆功能作用抑制胆碱酯酶活性的作用抑制胆碱酯酶活性的作用 体外试验体外试验检测了ZT1（益智酵素）对大鼠皮层、大鼠、牛及人细胞膜AChE活性的抑制作用。它的抑制酶活性50浓度 (IC50) 分别为83、90、99及78 nmol，抑制作用强度与Hup A相当，弱于E2020。ZTZT1 1（益智酵素）对血清丁酰胆碱酯酶（益智酵素）对血清丁酰胆碱酯酶（BuChEBuChE）活性抑制最弱，）活性抑制最弱，它对它对AChEAChE的选择性抑制作用约比的选择性抑制作用约比Hup AHup A大大1 1倍倍。ZTZT1 1（益智酵素）是可逆、混

10、合型（益智酵素）是可逆、混合型AChEAChE抑制剂。抑制剂。 体内试验体内试验用小鼠与大鼠二种，口服ZT1各0.5、1.0、2.0 mol/kg对各脑区AChE的抑制呈现剂量依赖相关。抑制作用强抑制作用强度与度与Hup AHup A相当，但比相当，但比E2020E2020及他克林各强及他克林各强1616与与120120倍。倍。ZTZT1 1 （益智酵素）对血清内（益智酵素）对血清内BuChEBuChE抑制作用最弱。抑制作用最弱。ZTZT1 1（益智酵（益智酵素）素）对脑内对脑内AChEAChE抑制作用持续长达抑制作用持续长达6 hr6 hr，但对血清，但对血清BuChEBuChE抑制抑制作用

11、仅维持作用仅维持3 hr3 hr，比之，比之Hup AHup A、E2020E2020和他克林明显短。和他克林明显短。Hup A, ZT-1Hup A, ZT-1（ 益智酵素益智酵素 ）和和其它胆碱酯其它胆碱酯酶抑制剂的比较酶抑制剂的比较-35-30-25-20-15-10-5001234567AChE inhibition(%)-50-45-40-35-30-25-20-15-10-5001234567BuChE inhibition(%)给药后时间（小时）ZT-1HupAE2020TacZT-1HupAE2020Tac皮层乙酰胆碱酯酶皮层乙酰胆碱酯酶血清丁酰胆碱酯酶血清丁酰胆碱酯酶胆碱酯酶

12、抑制剂的作用持续时间比较胆碱酯酶抑制剂的作用持续时间比较-20020406080100120-3-2-10123456Time after medication (h)ACh (% Increase of Baseline)ZT-1 0.75 mol/kg i.p.donepezil 6 mol/kgrivastigmine 1.50 mol/kg # # # #salinedrug i.p.大鼠脑皮层乙酰胆碱水平大鼠脑皮层乙酰胆碱水平改善记忆功能作用改善记忆功能作用用成年小鼠、大鼠、猴及老年猴测试了ZT1（益智酵素）的促进与改善各种实验性记忆障碍作用，ZT1（益智酵素）对水迷宫、八臂迷宫及延

13、迟反应记忆操作均有改善作用，ZT1 （益智酵素）改善记忆功能的有效剂量为0.050.1 mg/kg，作用比之作用比之Hup A、E2020 及及 他克林他克林各强各强 1、6 及及 15 倍倍。ZT1（益智酵素）肌肉注射115 g/kg均显示有明显促进老年猴记忆功能。药效学试验结论药效学试验结论上述药效学测试的结果表明：上述药效学测试的结果表明： ZT1（益智酵素）（益智酵素） 优于优于Hup A、E2020及他克林，因此具有开发用于治疗早老及他克林，因此具有开发用于治疗早老性痴呆症前景性痴呆症前景。一般药理学试验及结果一般药理学试验及结果 对麻醉犬心血管系统的影响对麻醉犬心血管系统的影响 对

14、麻醉犬呼吸系统的影响对麻醉犬呼吸系统的影响 对小鼠神经系统的影响对小鼠神经系统的影响对麻醉犬心血管系统的影响对麻醉犬心血管系统的影响 ZT-1 （益智酵素）（益智酵素）剂量分别为剂量分别为 20、60、 200 g/kg 灌胃给药对犬的收缩压、舒灌胃给药对犬的收缩压、舒 张压、心率、心律及心电图无明显影响。张压、心率、心律及心电图无明显影响。对麻醉犬呼吸的影响对麻醉犬呼吸的影响 ZT-1（益智酵素）（益智酵素）剂量分别剂量分别 为为 20、60、 200 g/kg 灌胃给药对犬的呼吸频率与灌胃给药对犬的呼吸频率与 呼吸幅度无明显影响。呼吸幅度无明显影响。对小鼠神经系统的影响对小鼠神经系统的影响

15、 小鼠灌服小鼠灌服ZT1（益智酵素）（益智酵素） 67、168 g/kg (相当于推荐临床剂量的相当于推荐临床剂量的10和和25倍倍)，对小鼠的自发活动、外观行，对小鼠的自发活动、外观行为以及肌张力、平衡功能均无明显影为以及肌张力、平衡功能均无明显影响，灌服响，灌服335 g/kg (相当于临床剂量相当于临床剂量50倍倍)，对自发活动及平衡功能有轻微，对自发活动及平衡功能有轻微影响，但在次日均恢复正常。影响，但在次日均恢复正常。Acute toxicity of ZT-1 and other cholinesterase inhibitors in miceChEIImproving memo

16、ry*deficitmg/kg, p.o.LD50mg/kg, p.o.ZT-1Hup ADonepezilTacrineGalanthamine0.050.050.1202.056.9 4.6 2553.127.1*Mouse water maze assayZT-1（益智酵素）（益智酵素） 6个月长期毒性个月长期毒性： SD大鼠灌胃给予三个月的无毒剂量为无毒剂量为0.8 mg/kg；有毒剂量为；有毒剂量为2.4 mg/kg。第一周反应较强，特别是高剂量组，甚至死亡。第一周反应较强，特别是高剂量组，甚至死亡，随时间延长而反应减轻，有药物耐受性。第一周死亡的动物，肝脏有损伤。但是3个月的大鼠，

17、无论是血液生化或病理组织学检查均与对照组相似。可认为肝脏的损伤是一过性的。其它的毒性反应有气管粘膜下及肠道粘膜腺体增生，分泌旺盛。肠道有轻微炎症反应、稀便、毛发疏松、体重下降。雌性大鼠较雄性大鼠反应明显。猕猴口服ZT-1（益智酵素）13周，0.8 mg/kg/day基本无毒性反应。基本无毒性反应。2.4mg/kg/day有中度的神经反应和个别猴有一过性的肝功能损伤，有中度的神经反应和个别猴有一过性的肝功能损伤，为猕猴所能耐受的剂量。为猕猴所能耐受的剂量。7.2mg/kg/day有重度的神经反应和部分有重度的神经反应和部分猴有一过性的肝功能损伤，猴有一过性的肝功能损伤，并有1只猴死亡。毒副反应主

18、要发生在给药后的12周内，以后逐渐减轻。未见明显性别差异。ZT-1（益智酵素）（益智酵素）9个月个月猕猴长期毒性：猕猴长期毒性：ZT-1（益智酵素）（益智酵素）主要毒副反应是引起胆碱能神主要毒副反应是引起胆碱能神经功能增强所致的各种临床症状，与剂量相关，严经功能增强所致的各种临床症状，与剂量相关，严重者可致死亡。随着用药时间的延长，症状逐渐减重者可致死亡。随着用药时间的延长，症状逐渐减轻，适应。病理组织学检查未见明显的靶器官毒性轻，适应。病理组织学检查未见明显的靶器官毒性病变病变。猕猴猕猴连续灌胃给药39周的无毒性反应的剂量为无毒性反应的剂量为0.8 mg/kg 。2.4、7.2 mg/kg

19、组给药早期部分猴体重降低、组给药早期部分猴体重降低、进食减少、肌颤、肌无力、稀便等临床症状均类似进食减少、肌颤、肌无力、稀便等临床症状均类似Ach的药效反应或扩大的药效作用。的药效反应或扩大的药效作用。给药四周后罕见肌颤，但给药期仍时有稀便，提示猴对ZT-1（益智酵素）有耐药性。7.2 mg/kg毒副反应明显，特别给药早期胃肠道功能亢进促使1例猴直肠脱垂不可复而合并急性腹膜炎濒死。 NOHH2NNOHNHClHOOCH3NOHNHNOHHNH2CClHOOCH3NaBH4ZT-1C23H23ClN2O3(MW:410)Huperzine A (Hup A)C15H18N2O(MW:242)Hu

20、perzine B (Hup B, I.S.)C16H20N2O(MW:256)Reduced ZT-1C23H25ClN2O3(MW:412)新建的ZT-1（益智酵素）（益智酵素）血药浓度分析方法首先采用采用NaBH4将血样（肝素抗凝的全血）中的将血样（肝素抗凝的全血）中的ZT-1（益智酵素）（益智酵素）在采血后在采血后立刻转化成稳定的还原型立刻转化成稳定的还原型ZT-1（rZT-1），处理过后的血样再经过液-液法提取，其提取物最后用LC/ESI-MS/MS分析定量。分析定量。该分析方法采用该分析方法采用Huperzine B作为内标物作为内标物（I.S.）。ZT-1（益智酵素）（益智酵素）

21、的分子量不大，且具有较好的脂溶性，经口服给药后能很快吸收，同时其在体内的消除也较快。ZT-1 （益智酵素）（益智酵素）在体内主要转化成HupA。大鼠（大鼠（n = 5）经灌胃给药）经灌胃给药（i.g.）两个剂量PVP助溶的ZT-1 （益智酵素）（益智酵素）（即：0.5和1mgZT-1/kg体重）后，ZT-1 （益（益智酵素）智酵素）的达峰时间（Tpeak）为5min（少数1mg/kg剂量者为15min或30min）、峰浓度（Cmax）分别为1.57和0.61ng/mL、C-T曲线下面积（AUC）分别为0.48和0.60ng?h/mL；而HupA作为ZT-1（益智酵素）（益智酵素）的主要代谢物，

22、其Tpeak、Cmax及AUC在以上两个剂量下分别为0.22和0.37h、109.9和209.5ng/mL、96.3和319.8ngh/mL。雄雌二犬经灌胃给药（i.g.）1mg/kg体重ZT-1（益智酵素）（益智酵素）后，ZT-1（益智酵素）（益智酵素）的Tpeak为0.25h、Cmax为11.8和321.6ng/mL、AUC为5.26和187.17ng?h/mL。其代谢物HupA的Tpeak、Cmax及AUC分别为0.62和1.12h、585.4和88.8ng/mL、1150.4和347.3ng?h/mL。另一对雄雌二犬经静脉注射给药ZT-1（益智酵素）（益智酵素）血中浓度却可以较HupA

23、的浓度高出10倍以上，提示在血中ZT-1（益智酵素）（益智酵素）向HupA的转化可能受到了抑制。静脉注射时ZT-1（益智酵素）（益智酵素）及HupA的T1/2分别为0.28和0.20h，及8.31和4.00h。 致突变试验致突变试验uAmsAms试验试验：TA97TA97、TA98TA98、TA100TA100、 TA102TA102、TA1535TA1535五个菌株在五个菌株在S9S9和和 S9S9二种试验系统中，剂量从二种试验系统中，剂量从0.50.5 10001000微克微克/ /皿，均为阴性。皿，均为阴性。生殖毒性试验生殖毒性试验4mg/kg4mg/kg孕鼠体重增长下降，吸孕鼠体重增长

24、下降，吸收胎增加，有死亡。收胎增加，有死亡。8mg/kg8mg/kg孕鼠体重增长下降，吸孕鼠体重增长下降，吸收胎增加收胎增加0.6mg/kg0.6mg/kg对孕鼠和胚胎发育均对孕鼠和胚胎发育均无影响。无影响。 7070年代年代 毒扁豆碱毒扁豆碱(physostigmine)(physostigmine) 1993 1993 他克林他克林 ( (美国美国FDA, Cognex)FDA, Cognex) 1994 1994 Hup AHup A 1996 donepezil (1996 donepezil (美国美国FDA, Aricept)FDA, Aricept) 2000 rivastigm

25、ine ( 2000 rivastigmine (美国美国FDA, Exelon)FDA, Exelon) 胆碱酯酶抑制剂治疗胆碱酯酶抑制剂治疗AD的开发研究进程的开发研究进程 Hup A Hup A DonepezilDonepezil 他克林他克林Tacrine RivastimineTacrine RivastimineNNH2OHNNH2NOCH3CH3OOCH3NOONCH3CH3CH3CH3ZT-1（益智酵素）（益智酵素）是新一代是新一代治疗老年痴呆症候选药治疗老年痴呆症候选药对脑内乙酰胆碱酯酶具有高选择性对脑内乙酰胆碱酯酶具有高选择性提高皮层乙酰胆碱水平提高皮层乙酰胆碱水平作用持

26、续达作用持续达6 6小时以上小时以上明显改善老年及多种实验性记忆障碍明显改善老年及多种实验性记忆障碍口服吸收好，易通过血脑屏障口服吸收好，易通过血脑屏障临床推荐治疗剂量的临床推荐治疗剂量的200200倍对心血管、呼吸倍对心血管、呼吸 系统功能没有不良副作用系统功能没有不良副作用治疗老年痴呆症的同类药物中毒性最低治疗老年痴呆症的同类药物中毒性最低在荷兰乌德勒克共进行4批72人次临床I 期疗效观察，分如下4个方面讨论：1，对AChE和 BuChE的抑制作用。2，对Scopolamine致认知障碍的改善作用。3, 药代动力学观察。4, 药物安全性评价。ZT-1ZT-1（益智酵素益智酵素 ）临床）临床

27、1 1期疗效评价：期疗效评价：1，对，对AChE和和 BuChE的抑制作用。的抑制作用。分别测定服用ZT-1（益智酵素）, 安慰剂组对血红细胞和血浆BuChE抑制作用发现: ZT-1（益智酵素）组在1到3 mg的不同剂量组均对AChE有不同程度的抑制作用。作用出现在口服给药1到4小时后, 最大抑制率在3310.1% 到7011.9% 范围内。作用延续时间达30小时。安慰剂组对AChE无明显抑制作用, 抑制率为-622.4% 。 ZT-1（益智酵素）组在剂量达 3 mg组仍未见对血浆BuChE的抑制作用。人体试验结果与体外试验结果一致。IDB-ZT1-E02-V6.pdfIDB-ZT1-E02-V6.pdf健康老年志愿者单剂量口服ZT-1（益智酵素）后, 不同剂量组对AChE的抑制作用2，对，对Scopolam