碱性磷酸酶比活力测定

1、碱性磷酸酶比活力的测定1.1.学习分光光度法测定的原理和方法学习分光光度法测定的原理和方法掌握碱性磷酸酶比活测定的方法掌握碱性磷酸酶比活测定的方法一、目的要求二、原理（一）、比色分析法光的互补示意图光的互补示意图1. 物质的颜色和波长：物质的颜色和波长：可见光：波长（可见光：波长（）400760nm紫外光：紫外光：小于小于400nm红外光：红外光：大于大于760nm2. 溶液的颜色和光吸收的关系：溶液的颜色和光吸收的关系：溶液的颜色，是由于不同的有色物质有选择地吸收某种颜色的光而引起的。溶液的颜色，是由于不同的有色物质有选择地吸收某种颜色的光而引起的。溶液呈现的颜色是与它主要吸收的光相互补的光

2、的颜色。溶液吸收的光越多，溶液呈现的颜色是与它主要吸收的光相互补的光的颜色。溶液吸收的光越多，呈现的颜色越深。呈现的颜色越深。3. 物质浓度，液层厚度与光吸收的关系物质浓度，液层厚度与光吸收的关系（Lambert-Beer定律）：定律）：当一束单色光通过溶液后，光被溶液吸收的程度（当一束单色光通过溶液后，光被溶液吸收的程度（D）与溶液的浓度与溶液的浓度（C），），液层的厚（液层的厚（L）以及入射光的强度（以及入射光的强度（I0）有关。溶液浓度越大，液有关。溶液浓度越大，液层越厚，吸光越多，这就是物质（均匀透明固体，液体，气体）对光的吸层越厚，吸光越多，这就是物质（均匀透明固体，液体，气体）对光

3、的吸收定律。收定律。4. 待测溶液浓度的计算：待测溶液浓度的计算：（1 1）标准管法：）标准管法：在同样条件下，测得标准液和待测液的光密度（在同样条件下，测得标准液和待测液的光密度（D D）值，然后计算：值，然后计算：C C未知未知 = =（D D未知未知/ /D D标准标准）C C标准标准（2 2）标准曲线法：）标准曲线法：分析大批待测样品时，采用此法较方便。先配制一系列浓度由小到大的标分析大批待测样品时，采用此法较方便。先配制一系列浓度由小到大的标准溶液，测出它们的光密度（准溶液，测出它们的光密度（D D）值。在一定浓度范围内，溶液浓度（值。在一定浓度范围内，溶液浓度（C C）与其光密度（

4、与其光密度（D D）之间呈直线关系。以各管之间呈直线关系。以各管D D为纵坐标，为纵坐标，C C为横坐标，绘制为横坐标，绘制标准曲线。待测溶液标准曲线。待测溶液D D值测出后，在曲线上查出值测出后，在曲线上查出C C。1%1%浓度，浓度，1 1cmcm厚度溶液中测得：厚度溶液中测得：K = E1cm1%K = E1cm1%或克分子浓度，或克分子浓度，cmcm厚度溶液中测得：厚度溶液中测得：K = K = C = D/E1cm%, C = D/E1cm%, 或或 C = D/C = D/常用于紫外吸收法测定蛋白质，核酸含量，二者分别在常用于紫外吸收法测定蛋白质，核酸含量，二者分别在280280n

5、mnm和和260260nmnm处有最大吸收，其消光系数可查到，在同样条件下，测定待处有最大吸收，其消光系数可查到，在同样条件下，测定待测溶液的光密度测溶液的光密度, , 带入上式即可求得带入上式即可求得C C。（3 3）消光系数法：）消光系数法：（二）、酶活力在37 C下，以5mmol/L pNPP为底物，在pH 10.1的碳酸盐缓冲液含2 mmol/L 的测活体系中每分钟催化产生的酶量定为1个酶活力单位。酶的比活力定义为每mg蛋白所具有的酶活力单位数。酶活性测定前处理1、2号样品稀释50倍（用洗脱液稀释）3号样品稀释20倍（用洗脱液稀释）4号样品不稀释（用洗脱液稀释）蛋白浓度测定前处理1、2

6、号样品稀释100倍（用洗脱液稀释）3号样品稀释20倍（用洗脱液稀释）4号样品对倍稀释（用洗脱液稀释）12支试管，1-4做两组平行测定管，01-04作为空白对照管管 号号空白空白（01-04）1-12-23-34-45 mM pNPP(mL)各各0.2mL Na2CO3-NaHCO3 (mL)各管加入各管加入1.0 mL 20 mmol/L MgCl2 (mL)各管加入各管加入0.2 mL H2O (mL)各各0.50mL混匀，混匀，37，5分钟分钟 酶液（酶液（mL）/各各0.1mL37，精确反应，精确反应10分钟分钟 0.1 mol/L NaOH (mL)各管加入各管加入2.0 mL 酶液（

7、酶液（mL）0.1mL OD 405 nm蛋白浓度测定1. 测定100 g/mL牛血清白蛋白溶液的OD值；2. 将稀释后的样品在280nm下测定吸光度；3. 以洗脱液作空白。蛋白浓度按下式计算：280280ODCOD/100未知牛血清白蛋白mLg数据处理单位时间0.1mL酶液催化产物量计算：克分子消光系数法ODC108 . 8OD)1 (/13405未知）（光程cmLmolPNP即C未知OD/(8.8103)AVC= (mg/mL)VtB=(U/mL) 21蛋白浓度酶活力计算：式中：A为稀释倍数，B为由消光系数法计算得的pNP mol数，t为反应时间，C为测得的蛋白mg数，V1为测定酶活力所用

8、的酶量(mL数) V2为测定酶活力所用的酶量(mL数)酶的比活力（U/mg） 酶活力(U/mL)/ 蛋白浓度(mg/mL)纯化倍数=各步比活力/第一步比活力得率%=各步总活力 100/第一步总活力 A二、原理（一）、比色分析法光的互补示意图光的互补示意图1. 物质的颜色和波长：物质的颜色和波长：可见光：波长（可见光：波长（）400760nm紫外光：紫外光：小于小于400nm红外光：红外光：大于大于760nm2. 溶液的颜色和光吸收的关系：溶液的颜色和光吸收的关系：溶液的颜色，是由于不同的有色物质有选择地吸收某种颜色的光而引起的。溶液的颜色，是由于不同的有色物质有选择地吸收某种颜色的光而引起的。

9、溶液呈现的颜色是与它主要吸收的光相互补的光的颜色。溶液吸收的光越多，溶液呈现的颜色是与它主要吸收的光相互补的光的颜色。溶液吸收的光越多，呈现的颜色越深。呈现的颜色越深。4. 待测溶液浓度的计算：待测溶液浓度的计算：（1 1）标准管法：）标准管法：在同样条件下，测得标准液和待测液的光密度（在同样条件下，测得标准液和待测液的光密度（D D）值，然后计算：值，然后计算：C C未知未知 = =（D D未知未知/ /D D标准标准）C C标准标准（2 2）标准曲线法：）标准曲线法：分析大批待测样品时，采用此法较方便。先配制一系列浓度由小到大的标分析大批待测样品时，采用此法较方便。先配制一系列浓度由小到大的标准溶液，测出它们的光密度（准溶液，测出它们的光密度（D D）值。在一定浓度范围内，溶液浓度（值。在一定浓度范围内，溶液浓度（C C）与其光密度（与其光密度（D D）之间呈直线关系。以各管之间呈直线关系。以各管D D为纵坐标，为纵坐标，C C为横坐标，绘制为横坐标，绘制标准曲线。待测溶液标准曲线。待测溶液D D值测出后，在曲线上查出值测出后，在曲线上查出C C。12支试管，1-4做两组平行测定管，01-04作为空白对照管管 号号空白空白（01-04）1-12-23-34-45 mM pNPP(mL)各各0.2mL Na2CO3-NaHCO3 (mL)各管加入各管加入1.0 mL 20