基因工程DNA诱变

1、第十章第十章 DNA诱变诱变突变是研究基因结构与功能的最基本手段。突变是研究基因结构与功能的最基本手段。经典方法：经典方法：分离自发突变体，或用物理、化学因分离自发突变体，或用物理、化学因子处理活体来获得突变，再根据突变体的表型，子处理活体来获得突变，再根据突变体的表型，采用遗传学方法鉴定相应基因。采用遗传学方法鉴定相应基因。体外诱变：体外诱变：在试管中对在试管中对DNA进行诱变，改变其核进行诱变，改变其核苷酸序列，从而获得突变基因。苷酸序列，从而获得突变基因。用于基因工程、蛋白质工程等研究。用于基因工程、蛋白质工程等研究。第一节第一节 随机诱变随机诱变体外随机诱变：体外随机诱变：指随机地在克

2、隆化指随机地在克隆化DNA中引入碱中引入碱基突变。基突变。特点：特点：没有针对性，随机引入突变；没有针对性，随机引入突变；方法：方法：易错易错PCR 、盒式诱变、增变菌株、化学诱、盒式诱变、增变菌株、化学诱变；变；用途：用途：改变基因的编码区，使得蛋白质的氨基酸改变基因的编码区，使得蛋白质的氨基酸序列发生改变。序列发生改变。一、一、易错易错PCR (error-prone PCR)概念：概念：在在PCR反应中，使用具有错配倾向的反应中，使用具有错配倾向的DNA聚合酶以及反应条件，使碱基错误掺入到新合成聚合酶以及反应条件，使碱基错误掺入到新合成的基因中的基因中，得到随机突变的，得到随机突变的DN

3、A群体，再用载体群体，再用载体克隆突变基因克隆突变基因 。易错易错PCR采用的方法：采用的方法： 增加增加MgCl2浓度到浓度到7mM，稳定非互补的碱基配对；，稳定非互补的碱基配对； 加入加入0.5mM的的MnCl2，降低，降低pol对模板的特异性；对模板的特异性； pol量加到量加到5U，促使在错配碱基处继续延伸；，促使在错配碱基处继续延伸； 限定限定4种碱基中的一种，通常为正常浓度的种碱基中的一种，通常为正常浓度的1-10%，在缺乏正确核苷酸时，在缺乏正确核苷酸时，DNA聚合酶经短暂停顿后，聚合酶经短暂停顿后，会插入另外会插入另外3种核苷酸的一种；种核苷酸的一种； 3种为正常浓度的正常碱基

4、，第四种为次黄嘌呤种为正常浓度的正常碱基，第四种为次黄嘌呤dITP（可与（可与C、T、A配对）；配对）； dCTP和和dTTP的浓度加到的浓度加到1mM，促进错误掺入；，促进错误掺入； 使用突变使用突变DNA聚合酶，如聚合酶，如Mutazyme。二、盒式诱变二、盒式诱变盒式取代诱变盒式取代诱变 混合寡核苷酸诱变混合寡核苷酸诱变盒式取代诱变盒式取代诱变种类种类盒式取代诱变：盒式取代诱变：从载体中从载体中切除特定的切除特定的dsDNA片段，片段，用突变的用突变的DNA片段取代。片段取代。混合寡核苷酸诱变混合寡核苷酸诱变混合寡核苷酸诱变混合寡核苷酸诱变：在人在人工合成工合成DNA链的过程中，链的过程

5、中，随机引入突变的碱基，得随机引入突变的碱基，得到混合的双链到混合的双链DNA的过程的过程。三、增变菌株的诱变作用三、增变菌株的诱变作用概念：概念：与与DNA错配修复和错配修复和DNA损伤修复有关的基损伤修复有关的基因突变后，细胞内基因的突变频率升高，这样的因突变后，细胞内基因的突变频率升高，这样的菌株叫菌株叫增变菌株（增变菌株（mutator strain）。）。四、化学诱变四、化学诱变用化学诱变剂处理双链用化学诱变剂处理双链DNA片段，将发生随机突片段，将发生随机突变的变的DNA群体克隆到合适的载体中，构建成一个群体克隆到合适的载体中，构建成一个重组突变体库。重组突变体库。这类化合物具有与

6、这类化合物具有与DNA碱基类似的结构。碱基类似的结构。如：如：5-溴尿嘧啶（溴尿嘧啶（BU） 为为胸腺嘧啶（胸腺嘧啶（T）的类似物）的类似物2-氨基嘌呤（氨基嘌呤（AP） 为为腺嘌呤（腺嘌呤（A）的类似物）的类似物马来酰肼（马来酰肼（MH） 为为尿嘧啶（尿嘧啶（U）的异构体）的异构体 核酸碱基类似物核酸碱基类似物第二节第二节 定向诱变（定向进化）定向诱变（定向进化）定向进化：定向进化：一次突变很难获得满意的结果，通常一次突变很难获得满意的结果，通常采用反复多次诱变，最终获得满足人们需要的性采用反复多次诱变，最终获得满足人们需要的性能改良的蛋白质。能改良的蛋白质。是一种依赖序列同源性的是一种依赖

7、序列同源性的DNA体外重组技术。体外重组技术。又称为又称为试管进化试管进化、有性、有性PCR (sexual PCR)、分子育、分子育种种PCR (molecular breeding PCR)。优点：优点：可以将大量有益突变快速组合，加速产生可以将大量有益突变快速组合，加速产生DNA序列多样性。序列多样性。使进化从以往的使进化从以往的“突变突变选择选择”模式变为与自然模式变为与自然进化更为相似的进化更为相似的“突变突变重组重组选择选择”模式。模式。定向进化的原理定向进化的原理定向进化与自然进化的异同点：定向进化与自然进化的异同点：定向进化的实质是达尔文进化论在分子水平上的定向进化的实质是达尔

8、文进化论在分子水平上的延伸和应用。延伸和应用。定向进化使进化朝着人们需要的方向发展。定向进化使进化朝着人们需要的方向发展。动力不同：保守突变动力不同：保守突变 & 非保守取代；非保守取代；方向不同：适应突变的积累方向不同：适应突变的积累 & 定向定向突变的积累突变的积累； 速度不同：非常漫长速度不同：非常漫长 & 时间短甚至几天；时间短甚至几天； 目标不同：适应环境目标不同：适应环境 & 探索蛋白质的可塑性。探索蛋白质的可塑性。 两者的不同：两者的不同：一、一、DNA改组改组/洗牌（洗牌（DNA shuffling）美国美国Stemmer 于于1994 年首次提出年首次提出 。DNA shuf

9、fling技术技术：从从易错易错PCR获得的正向突变获得的正向突变库中分离的库中分离的DNA片段片段经过超声波处理或在经过超声波处理或在DNase的作用下随机切成小片段，的作用下随机切成小片段，经过经过不加引物不加引物的多次的多次PCR循环。在循环。在PCR循环过程中，随机片段之间互循环过程中，随机片段之间互为模板和引物进行扩增，直到为模板和引物进行扩增，直到接近切割前的目的接近切割前的目的基因的长度；最后用基因两侧的引物合成全长的基因的长度；最后用基因两侧的引物合成全长的基因。基因。其结果是导致不同基因片段之间的重组。其结果是导致不同基因片段之间的重组。DNADNA改改组组原原理理DNA s

10、huffling技术的优点：技术的优点：对操作的靶序列没有任何要求，长度可达几十对操作的靶序列没有任何要求，长度可达几十kb ，操作简单操作简单;在短时间内通过多轮重组，在短时间内通过多轮重组，积累积累所有所有有益有益的突的突变变比随机突变显著比随机突变显著提高了正向突变的概率提高了正向突变的概率。二、交错延伸重组二、交错延伸重组（staggered extension process, StEPstaggered extension process, StEP）交错延伸重组是一种简化的交错延伸重组是一种简化的DNA shuffling技术。技术。交错延伸交错延伸(stagger extens

11、ion process, StEP) 在在PCR反应中把常规的反应中把常规的退火和延伸合并为一步退火和延伸合并为一步, 缩短缩短反应反应时间。以突变体库时间。以突变体库dsDNA为模板，以为模板，以单引物单引物进行进行延伸，从而只能合成出非常短的新生链，经变性延伸，从而只能合成出非常短的新生链，经变性的新生链再作为引物与的新生链再作为引物与不同不同模板退火而继续延伸模板退火而继续延伸，由于模板转换而实现不同模板间的重组，这样重由于模板转换而实现不同模板间的重组，这样重复直到获得全长基因片段。复直到获得全长基因片段。三、随机引发重组三、随机引发重组(random priming in vitro

12、 recombination，RPR)RPR以以ssDNA为模板为模板，配合，配合一套随机引物一套随机引物，先产，先产生大量互补于模板不同位点的短生大量互补于模板不同位点的短DNA片段，由于片段，由于碱基的错配和错误引发，这些短碱基的错配和错误引发，这些短DNA片段中也会片段中也会有少量的点突变，在随后的有少量的点突变，在随后的PCR反应中，它们互反应中，它们互为引物进行合成，再组装成完整的基因长度。为引物进行合成，再组装成完整的基因长度。可以直接以可以直接以cDNA为模板进行随机引发重组。为模板进行随机引发重组。第三节第三节 定点诱变定点诱变70年代初年代初x174 DNA（ssDNA 53

13、86 bp），当用带），当用带琥珀突变琥珀突变的的x174 ssDNA与变性的野生型与变性的野生型DNA片片段段一起转染细菌时，观察到一起转染细菌时，观察到“标记获救标记获救”现象，现象，即产生野生型噬菌体。即产生野生型噬菌体。一、寡核苷酸介导定点诱变的基本流程一、寡核苷酸介导定点诱变的基本流程合成引物合成引物(携带所需的突变携带所需的突变)，与野生型，与野生型DNA退火退火 延伸合成延伸合成DNA，含有预定的突变。，含有预定的突变。测序，验证突变，保证其他区域没有发生突变。测序，验证突变，保证其他区域没有发生突变。克隆带突变的克隆带突变的DNA二、经典二、经典DNA定点诱变定点诱变在在PCR

14、出现前，利用出现前，利用M13噬菌体可制备噬菌体可制备ssDNA的特的特点。重组点。重组M13可以分别回收到两种形式：可以分别回收到两种形式：dsDNA和和ssDNA。1.背景知识背景知识 大肠杆菌缺陷型：大肠杆菌缺陷型：dut-：dUTPase缺陷，不能把缺陷，不能把dUTP转化为转化为dUMP，导致细，导致细胞内积累胞内积累dUTP，一些，一些dUTP掺入掺入DNA中占据了中占据了T的位置。的位置。ung-： glycosylase缺陷，缺陷，UDG酶酶尿嘧啶尿嘧啶-N-糖基化酶糖基化酶可可除去掺入除去掺入DNA中的尿嘧啶残基中的尿嘧啶残基（一）（一）Kunkel定点诱变法（又称定点诱变法

15、（又称“U”法）法） KunkelKunkel突变法突变法Kunkel 法过程包括：法过程包括： 当目标当目标 DNA 插入插入 phagemid 载体并进入载体并进入 E. coli CJ236 后。后。 由于该菌体由于该菌体 ung- dut- 突变，合成的突变，合成的 DNA 上含有少上含有少量尿嘧啶（取代了胸腺嘧啶）。量尿嘧啶（取代了胸腺嘧啶）。 M13K07 辅助下，产生带辅助下，产生带U的的ssDNA 。 分离分离ssDNA，与引入突变的，与引入突变的 Oligo 复性。复性。 在在 T7 DNA polymerase 和和T7 DNA ligase 作用下，以作用下，以带带 U

16、的单链的单链 DNA 为模板合成一条新链，形成杂合双链。为模板合成一条新链，形成杂合双链。 感染感染 dut+ ung+ E. coliMV1190 后，在细胞分裂过后，在细胞分裂过程中，只有新合成的程中，只有新合成的 DNA 链才能起模板作用合成新的并链才能起模板作用合成新的并引入了突变位点的子代双链引入了突变位点的子代双链 DNA 。而有。而有 U 的的 DNA 链，链，在在 dut+ 和和 ung+ 产物的作用下，尿嘧啶被水解，从而失产物的作用下，尿嘧啶被水解，从而失去作为模板的能力。去作为模板的能力。（二）位点选择诱变，又叫（二）位点选择诱变，又叫抗生素抗性回复突变法抗生素抗性回复突变

17、法（altered sites in vitro mutagenesis） 使用了使用了2个引物，一个含有突变位点，另一个是选择性引个引物，一个含有突变位点，另一个是选择性引物，用来恢复有缺陷的抗生素抗性基因。物，用来恢复有缺陷的抗生素抗性基因。v质粒含有一个突变的质粒含有一个突变的Amp抗性基因抗性基因(不能抗不能抗Amp)v将目标将目标DNA克隆到载体中克隆到载体中v转化大肠杆菌，提取阳性重组质粒，变性后与两转化大肠杆菌，提取阳性重组质粒，变性后与两个引物退火个引物退火v在在dNTPs存在时，存在时，T4 DNA聚合酶合成新链，用聚合酶合成新链，用T4 DNA连接酶环化连接酶环化v转化大肠

18、杆菌，在含转化大肠杆菌，在含Amp的培养基上筛选，长出的培养基上筛选，长出的菌落提质粒，鉴定后送测序的菌落提质粒，鉴定后送测序四、四、PCR介导的定点诱变介导的定点诱变优点：优点：回收率高；回收率高；不需不需ssDNA；高温降低模板二级结构；高温降低模板二级结构；同一试管反应。同一试管反应。（一）大引物（一）大引物PCR诱变诱变 见见P180描述描述（二）重叠延伸（二）重叠延伸PCR诱变诱变(overlapping extension PCR)重叠延伸重叠延伸PCR诱变诱变v在基因的中间，针对感兴趣的位点设计带突变位在基因的中间，针对感兴趣的位点设计带突变位点的正反向引物点的正反向引物v其中带突变位点的反向引物与基因其中带突变位点的反向引物与基因55端的正向端的正向引物配对、而带突变位点的正向引物与基因引物配对、而带突变位点的正向引物与基因33端的反向引物配对，分别进行端的反向引物配对，分别进行PCRPCR扩增扩增v合并合并扩增产物，经变性复性，由扩增产物，经变性复性，由DNADNA聚合酶重聚合酶重新合成完整的带突变位点的基因新合成完整的带突变位点的基因v再通过再通过PCRPCR扩增获得大量的突