体外抗菌实验-18

1、 第二十章第二十章 药物的体外抗菌试验药物的体外抗菌试验药物的体外抗菌试验药物的体外抗菌试验 药物的体外抗菌试验是在体外测定微药物的体外抗菌试验是在体外测定微生物对药物敏感程度的试验，生物对药物敏感程度的试验， 已广泛地应用于科研、生产和临床。如抗菌已广泛地应用于科研、生产和临床。如抗菌药物的筛选、提取过程中的追踪、抗菌谱的定、药物的筛选、提取过程中的追踪、抗菌谱的定、药物含量的测定、药物血浓度测定、指导临床用药物含量的测定、药物血浓度测定、指导临床用药的药敏试验等。药的药敏试验等。抗菌试验包括抑荫试验和杀菌试验。抗菌试验包括抑荫试验和杀菌试验。抑菌：抑菌：即抑制微生物的生长繁殖，但不能杀死微

2、即抑制微生物的生长繁殖，但不能杀死微 生物，在药物除去后微生物又能生长生物，在药物除去后微生物又能生长.杀菌：杀菌：即能杀死微即能杀死微 生物，当药物除去后，微生生物，当药物除去后，微生 物也不能再生长繁殖。物也不能再生长繁殖。 第一节第一节 常用的体外抑菌试验常用的体外抑菌试验连续稀释法：连续稀释法： 可用于测定药物的最低抑菌浓度可用于测定药物的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀和最低杀菌浓度菌浓度(MBC)。可以用液体培养基，也可用固体培。可以用液体培养基，也可用固体培养基。养基。1液体培养基连续稀释法液体培养基连续稀释法 2固体培养基连续稀释法固体培养基连续稀释法 分平板法和斜面分平板法和斜

3、面 法。法。 琼脂扩散法：琼脂扩散法： 是利用药物可以在琼脂培养基中扩散，在药是利用药物可以在琼脂培养基中扩散，在药物有效浓度的范围内形成抑菌圈或抑菌距离，以物有效浓度的范围内形成抑菌圈或抑菌距离，以抑菌圈直径或抑菌距离的大小来评价药物抗菌作抑菌圈直径或抑菌距离的大小来评价药物抗菌作用强弱。用强弱。1、滤纸片法、滤纸片法 适用于新药的初筛试验。适用于新药的初筛试验。2打孔法打孔法 适于药物血浓度的监测。适于药物血浓度的监测。3挖沟法挖沟法 适用于在一个平板上试验一种药物对几种试验适用于在一个平板上试验一种药物对几种试验菌的抗菌作用。菌的抗菌作用。 第二节第二节 杀菌试验杀菌试验用以评价药物对微

4、生物的致死活性。用以评价药物对微生物的致死活性。最低杀菌浓度：最低杀菌浓度： 指该药物能杀死细菌的最低浓度。从对微生指该药物能杀死细菌的最低浓度。从对微生物广义而言，也可称之为最低致死浓度物广义而言，也可称之为最低致死浓度(MLC)。 是将待检药物先以合适的液体培养基在试管内进行连续稀释，每管内再加入一定量的试验菌液，培养后可得该药物的MIC，取MIC终点以上未长菌的各管培养液，分别移种于另一无菌平板上，培养后凡平板上无菌生长的药物最低浓度即为该药物的MBC(或MLC)。 活菌计数法活菌计数法 是在一定浓度的定量药物内加入定量的试验菌，是在一定浓度的定量药物内加入定量的试验菌，作用一定时间后，

5、取样进行活菌计数，从存活的微生作用一定时间后，取样进行活菌计数，从存活的微生物数计算出药物对微生物的致死率。物数计算出药物对微生物的致死率。石炭酸系数（又称酚系数）石炭酸系数（又称酚系数） 是以石炭酸为标准，在规定的试验条件下，作用是以石炭酸为标准，在规定的试验条件下，作用一定时间，将待测的化学消毒剂与石炭酸对伤寒沙门一定时间，将待测的化学消毒剂与石炭酸对伤寒沙门菌或金黄色葡萄球菌的杀菌效力相比较，菌或金黄色葡萄球菌的杀菌效力相比较， 所得杀菌所得杀菌效力的比值。效力的比值。 棋盘格法棋盘格法 是由于在试验时，含两种不同浓度是由于在试验时，含两种不同浓度药物的试管排列呈棋盘状而得名，药物的试管

6、排列呈棋盘状而得名， 用以用以评价两种药物同时用不同浓度进行联合评价两种药物同时用不同浓度进行联合试验时的抗菌活性。试验时的抗菌活性。 第三节第三节 联合抗菌试验联合抗菌试验 在药学上作中，常需检查两种抗菌药物在药学上作中，常需检查两种抗菌药物在联合应用时的相互作用以及抗菌药物与不在联合应用时的相互作用以及抗菌药物与不同同pH值或不同离子溶液的相互影响。如加强值或不同离子溶液的相互影响。如加强药物抗菌作用的为药物抗菌作用的为协同协同(synergism)；减弱药；减弱药物作用的为物作用的为拮抗拮抗(antagonism)；相互无影响的；相互无影响的为为无关无关(indjfference)；作用

7、为二者之和的为；作用为二者之和的为累累加加(addition)。 纸条试验纸条试验 即在已接种试验菌的平板表面垂直放置两条各浸有即在已接种试验菌的平板表面垂直放置两条各浸有一种药液的滤纸条，培养后根据抑菌区的加强、减弱或一种药液的滤纸条，培养后根据抑菌区的加强、减弱或无影响来判断它们在联合应用时的效应。无影响来判断它们在联合应用时的效应。梯度平板纸条试验梯度平板纸条试验 需先制备含药的梯度平板。将试验菌悬液涂布于需先制备含药的梯度平板。将试验菌悬液涂布于平板表面，取滤纸条浸透另一待检药液，按梯度平板平板表面，取滤纸条浸透另一待检药液，按梯度平板中药物浓度递减的方向置于平板表面。培养后，如该中药

8、物浓度递减的方向置于平板表面。培养后，如该待检药液对平板内的药物有加强作用，则可见沿纸条待检药液对平板内的药物有加强作用，则可见沿纸条两边的抑菌区被扩大。两边的抑菌区被扩大。 第四节第四节 体外抗菌试验的影响因素体外抗菌试验的影响因素1试验菌试验菌 在抗菌试验中所用试验菌一般应该用标在抗菌试验中所用试验菌一般应该用标准菌株。准菌株。2培养基培养基 培养基的质量须加控制。培养基的质量须加控制。3抗菌药物抗菌药物 药物的浓度和总量直接影响抗菌试验的药物的浓度和总量直接影响抗菌试验的结果，需要精确配制。结果，需要精确配制。 第二十一章第二十一章药物制剂的微生物学检查药物制剂的微生物学检查 药物制剂的

9、微生物学检查药物制剂的微生物学检查 药物制剂的微生物学检查主要包药物制剂的微生物学检查主要包括无菌检验，细菌总数测定，霉菌总括无菌检验，细菌总数测定，霉菌总数测定，以及病原菌的检验与螨的检数测定，以及病原菌的检验与螨的检测等。测等。 第一节第一节 无菌制剂的无菌检查无菌制剂的无菌检查（一）一般药品的无菌检查（一）一般药品的无菌检查 一般药品的无菌检查法属于直接接种法，即一般药品的无菌检查法属于直接接种法，即将检品按规定量直接分别接种于适宜需氧菌、厌将检品按规定量直接分别接种于适宜需氧菌、厌氧菌和真菌生长繁殖的一定量的培养基中，同时氧菌和真菌生长繁殖的一定量的培养基中，同时以同样的培养基作阳性对

10、照试验。以同样的培养基作阳性对照试验。 我国药典规定以金黄色葡萄球菌我国药典规定以金黄色葡萄球菌CMCC(B) 26003、生袍梭状芽胞杆菌、生袍梭状芽胞杆菌CMCC(B)64941、白、白假丝酵母菌假丝酵母菌CMCC(F)98001作为需氧菌、厌氧作为需氧菌、厌氧菌和真菌的阳性对照菌株。菌和真菌的阳性对照菌株。 （二）特殊药品的无菌检查法（二）特殊药品的无菌检查法 如果阳性对照管不长菌，则必须进行特殊处如果阳性对照管不长菌，则必须进行特殊处理后方可按照一般药品的无菌检查法进行。理后方可按照一般药品的无菌检查法进行。1油类药物的无菌检查油类药物的无菌检查 一般油剂因与常规培养基不混溶，药品中的

11、一般油剂因与常规培养基不混溶，药品中的微生物不易生长，所以一般可采用吐温培养基，微生物不易生长，所以一般可采用吐温培养基，其余同一般药品无菌检查法。其余同一般药品无菌检查法。 2抗菌药物或含防腐剂药物的无菌检查抗菌药物或含防腐剂药物的无菌检查 如果被检药品具有抗菌作用，阳性对照管及试验如果被检药品具有抗菌作用，阳性对照管及试验管均可能不长菌。因此在进行无菌检查前必须采用一管均可能不长菌。因此在进行无菌检查前必须采用一些方法除去药物本身的抗菌作用，然后再依上述方法些方法除去药物本身的抗菌作用，然后再依上述方法进行无菌检查。进行无菌检查。(1)加入灭活剂加入灭活剂(2)微孔滤膜法微孔滤膜法(3)稀

12、释法稀释法(4)离心沉淀法离心沉淀法 第二节第二节 口服药及外用药物的微生物学检查口服药及外用药物的微生物学检查 目前对口服药及外用药物的微生物目前对口服药及外用药物的微生物学检验主要是微生物限量检验，即限制学检验主要是微生物限量检验，即限制口服药及外用药的微生物总数和限制病口服药及外用药的微生物总数和限制病原微生物种类的系列测定项目。原微生物种类的系列测定项目。 我国规定的项目有：我国规定的项目有： 细菌总数测定，霉菌总数测定。病原菌细菌总数测定，霉菌总数测定。病原菌(大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、沙门菌和破伤风梭菌菌、沙门菌和破伤风梭菌)的

13、检验和活螨的检的检验和活螨的检验等。验等。判断合格与否的标准是：判断合格与否的标准是： 口服药及外用药中微生物总量须低于规定口服药及外用药中微生物总量须低于规定限量外，并须在口服药物每克或每毫升中不得限量外，并须在口服药物每克或每毫升中不得含有大肠埃希菌、沙门菌；外用药物每克或每含有大肠埃希菌、沙门菌；外用药物每克或每毫升中不得含有铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球毫升中不得含有铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和破伤风梭菌，此外均不得检出活螨。菌和破伤风梭菌，此外均不得检出活螨。 细菌总数的测定细菌总数的测定: 是了解被检药品在单位重量或体积是了解被检药品在单位重量或体积(每克每克或每毫升或每毫升)内所含

14、有的活菌数内所含有的活菌数(实际是需氧菌实际是需氧菌的活菌数的活菌数)，以判断供试药物被细菌污染的程，以判断供试药物被细菌污染的程度，是对该药品整个生产过程的卫生学总评度，是对该药品整个生产过程的卫生学总评价的一个重要依据。价的一个重要依据。 霉菌和酵母菌总数的测定：霉菌和酵母菌总数的测定： 是考察供试药物中每克或每毫升所含是考察供试药物中每克或每毫升所含的活霉菌和酵母菌的总数，以判明检品被的活霉菌和酵母菌的总数，以判明检品被真菌污染的程度。真菌污染的程度。 病原菌检验的原则病原菌检验的原则： 病原菌的形态和培养特征的观察是鉴别的基病原菌的形态和培养特征的观察是鉴别的基本要求，对生化反应、血清

15、学反应、动物毒力试本要求，对生化反应、血清学反应、动物毒力试验等项目的要求因菌而异，各有其侧重点验等项目的要求因菌而异，各有其侧重点。 一般的检测程序为：一般的检测程序为：药物的准备或预处理药物的准备或预处理增菌培养增菌培养分离培养分离培养纯纯培养培养染色镜检、生化试验、血清学试验、动物染色镜检、生化试验、血清学试验、动物试验等试验等结果判断。结果判断。 凡由检品中检出大肠埃希菌时，表明该药品可能凡由检品中检出大肠埃希菌时，表明该药品可能被粪便污染，患者服用后，有被粪便中可能存在的其被粪便污染，患者服用后，有被粪便中可能存在的其他肠道致病菌和寄生虫卵等病原体感染的危险。因此，他肠道致病菌和寄生

16、虫卵等病原体感染的危险。因此，口服药品中不得检出大肠埃希菌。口服药品中不得检出大肠埃希菌。检验要点：检验要点：(1)形态：革兰阴性短小无芽胞杆菌。形态：革兰阴性短小无芽胞杆菌。(2)分离培养：在伊红美兰（分离培养：在伊红美兰（EMB)培养基上分解乳培养基上分解乳 糖，产生紫黑色、有金属光泽的菌落。糖，产生紫黑色、有金属光泽的菌落。 (3)生化反应：乳糖发酵试验：产酸产气或产酸不产生化反应：乳糖发酵试验：产酸产气或产酸不产气；气；IMViC试验：试验：+-，注意与产气杆菌相区别。，注意与产气杆菌相区别。1、大肠埃希菌、大肠埃希菌 检验要点：检验要点：(1)形态：革兰阴性短小杆菌。形态：革兰阴性短

17、小杆菌。(2)分离培养：分离培养：SS琼脂上，沙门菌不分解乳糖，产琼脂上，沙门菌不分解乳糖，产生生H2S，菌落无色、透明或半透明，圆形，边缘整，菌落无色、透明或半透明，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，菌落中心呈黑褐色。齐，表面光滑湿润，菌落中心呈黑褐色。EMB平平板上菌落呈无色或粉红色。二糖铁培养基板上菌落呈无色或粉红色。二糖铁培养基TSl上分上分解葡萄糖、产酸产气，不分解乳糖、蔗糖，有动力、解葡萄糖、产酸产气，不分解乳糖、蔗糖，有动力、产生黑色沉淀。产生黑色沉淀。(3)生化反应：见表生化反应：见表21l。(4)血清学反应：用可疑菌作为抗原，沙门菌血清学反应：用可疑菌作为抗原，沙门菌AF组的多价

18、血清作为抗体进行玻片凝集反应，并以生组的多价血清作为抗体进行玻片凝集反应，并以生理盐水做对照试验。理盐水做对照试验。 2、沙门菌、沙门菌 3、铜绿假单胞菌、铜绿假单胞菌检验要点：检验要点：(1)形态：革兰阴性短杆菌。形态：革兰阴性短杆菌。(2)分离培养：在十六烷三甲基溴化铵琼脂平板上菌分离培养：在十六烷三甲基溴化铵琼脂平板上菌落扁平，无定形，湿润，周边扩散或略有蔓延，灰落扁平，无定形，湿润，周边扩散或略有蔓延，灰白色，培养基上扩散有水溶性绿色色素。白色，培养基上扩散有水溶性绿色色素。(3)生化反应：氧化酶试验阳性，绿脓菌素试验阳性，生化反应：氧化酶试验阳性，绿脓菌素试验阳性，可报告检出铜绿假单

19、胞菌。如绿脓菌素阴性，必须可报告检出铜绿假单胞菌。如绿脓菌素阴性，必须明胶液化试验阳性，硝酸盐还原试验阳性，明胶液化试验阳性，硝酸盐还原试验阳性，42生生长试验阳性，才可报告被检品检出铜绿假单胞菌。长试验阳性，才可报告被检品检出铜绿假单胞菌。 4、金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌检验要点：检验要点：(1)形态：革兰阳性球菌，葡萄状排列。形态：革兰阳性球菌，葡萄状排列。(2)分离培养及生化试验：见表分离培养及生化试验：见表21-3如分离培养的可疑菌甘露醇和血浆凝固酶如分离培养的可疑菌甘露醇和血浆凝固酶试验均为阳性，则可判断为检出金黄色葡试验均为阳性，则可判断为检出金黄色葡萄球菌。萄球菌。 5、破伤风梭菌、破伤风梭菌 检验要点：检验要点：(1)形态：革兰阳性芽胞梭菌，菌体细长，带芽胞的菌形态：革兰阳性芽胞梭菌，菌体细长，带芽胞的菌体呈鼓楷状。有周鞭毛，能运动，不形成英膜。体呈鼓楷状。有周鞭毛，能运动，不形成英膜。(2)分离培养：葡萄糖疤肉培养基中生长